Chromatografia; zasady ogólne:

Mieszanina białek jest frakcjonowana w trakcie ruchu przez porowate podłoże. Białka oddziałują z dwoma fazami: ruchomą - rozpuszczalnikiem i stałą - podłożem. Podłoże zawiera miejsca wiązania białek. Wiązanie pojedynczych białek do podłoża opóźnia ich ruch. Im większe powinowactwo białka do podłoża tym wolniej wędruje przez złoże podczas chromatografii.

Chromatografia kolumnowa

Złoże upakowane w kolumnie. Rozpuszczalnik przechodząc przez kolumnę porywa cząsteczki białka (ruch w dół kolumny)

Chromatografia cienkowarstwowa

Cienka warstwa złoża naniesiona na płytkę szklaną lub celuloidową

Rozpuszczalnik wędruje ze zbiornika do góry płytki

Białka o najmniejszym powinowactwie do złoża wędrują z czołem rozpuszczalnika

11. Chromatografia jonowymienna

Podstawą rozdziału są różnice w ładunku elektrycznym. Całkowity ładunek białka zależy od sumy ładunków poszczególnych aminokwasów i zależy od pH. Punktem izoelektrycznym białka nazywamy pH, w którym białko jest neutralne

Zwiększenie siły jonowej powoduje osłabienie wiązania podłoże-białko i wymywanie poszczególnych frakcji

Separacja makromolekuł w chromatografii jonowymiennej polega na odwracalnej adsorpcji obdarzonych ładunkiem elektrycznym makromolekuł na złożu jonowymiennym (jonowymieniaczu). Wymieniacz jonowy jest substancją, która w zetknięciu z roztworem wymienia część swoich jonów na jony z roztworu. W jego strukturze można wyróżnić nierozpuszczalną matrycę połączoną wiązaniami kowalencyjnymi z określonymi grupami funkcyjnymi, które ulegają jonizacji i mogą w sposób odwracalny asocjować z jonami przeciwnego znaku, tzw. przeciwjonami. Ze względu na ładunek jonów które podlegają wymianie wyróżniamy dwa rodzaje jonowymieniaczy:

Kationity (polianiony) wymieniają kationy z roztworem

Anionit (polikation) wymieniają aniony z roztworem

Kationy i aniony będące jonami wymiany, czyli tzw. przeciwjonami pochodzą z roztworu buforowego używanego do równoważenia złoża. Podczas rozdziału chromatograficznego są one zastępowane przez obdarzone ładunkiem cząsteczki białka.

Jeśli chodzi o nośniki stosowane w tego typu chromatografii jest to głównie celuloza. Inną bardzo ważna cechą charakteryzującą złoże jest pojemność jonowymieniacza, czyli liczba równoważników wymienianych jonów (w miliwatach) przypadająca na 1 g złoża.

Możemy wyróżnić kilka etapów rozdziału białek w chromatografii jonowymiennej:

- Naniesienie mieszaniny białek na kolumnę chromatograficzną

- Adsorpcja białek o odpowiednim ładunku

- Desorpcja, czyli elucja białek związanych do złoża

- Regeneracja złoża

1. Dla kationitów: fosforanowy, octanowy, cytrynianowi, maleinowy, weronalowi, HEPES

2. Dla anionitów: Tris, bis-Tris, etanoloamina, imidazol

Wracając do drugiego sposobu elucji, możemy tego dokonać zwiększając stężenie wcześniej używanego buforu, bądź dodając do buforu soli obojętnej (KCl, NaCl). Mając na względzie jakość i dokładność prowadzonego rozdziału, należy odpowiednio dobrać szybkość przepływu oraz gradient użytej soli (liniowy, schodkowy). Im wolniejszy będzie przepływ i mniej gwałtowny przyrost stężenia np. NaCl tym rozdział będzie dokładniejszy.

2.

Mniej więcej to polega na tym że pH złoża w kolumnie chromatograficznej musi być równe punktowi izoelektrycznemu danego białka, czyli w tym wypadku 6,5. Dzięki temu białka o tym pH adsorbują do złoża. Można też stopniowo zwiększać stężenie buforu przez co rozdział będzie dokładniejszy. Następnie te wydzielone białka na złożu należy oddzielić. (Chyba przez umieszczenie w roztworze o większym pH niż 6,5). - taka odpowiedź jest chyba mniej więcej poprawna…

2.1

Sączenie molekularne, filtracja żelowa, metoda umożliwiająca rozdział białek na podstawie ich masy cząsteczkowej, w kolumnach wypełnionych polimerami o porowatej strukturze, np. żelami dekstranowymi (Sephadex), agarozowymi (Sepharose), poliakrylamidowymi (Biogel), nazywanych sitami molekularnymi; cząsteczki duże wypływają z kolumny szybciej, mniejsze - wolniej; s. m. wykorzystuje się też do oczyszczania białka oraz wyznaczania masy cząsteczkowej.

Mechanizm sączenia na żelu w największym uproszczeniu przedstawia się następująco. Cząsteczki większe niż pory napęczniałych ziaren żelu nie mogą penetrować do ich wnętrza, a więc przepływają wyłącznie wraz z fazą ruchomą i są eluowane jako pierwsze. Mniejsze cząsteczki wnikające w różnym stopniu do wnętrza granulek żelu, w zależności od swego kształtu i rozmiaru, eluowane są w kolejności zmniejszania się ich masy cząsteczkowej W praktyce sączenie molekularne stosuje się do:

- rozdziału substancji różniących się masą cząsteczkową

- odsalania substancji, których masy cząsteczkowe są znacznie większe od masy ncząsteczkowej soli obecnej w próbce

- wyznaczania mas cząsteczkowych związków.

3.1

Chromatografia powinowactwa (affinity chromatography - AC)

Chromatografia powinowactwa jest szczególnym typem chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się wzajemne powinowactwo dwóch substancji. Ze względu na swe unikalne właściwości pozwala znacznie uprościć procedurę izolowania wybranej substancji, przy jednoczesnym zachowaniu jej biologicznej aktywności.

Podstawy teoretyczne chromatografii powinowactwa

Interakcja substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej z unieruchomionym ligandem może mieć różny charakter, może to być oddziaływanie pomiędzy:

- hormonem i receptorem,

- receptorem i ligandem,

- enzymem i substratem,

- enzymem i inhibitorem,

- przeciwciałem i antygenem lub haptenem

Warto zwrócić uwagę na to, że w przypadku każdej pary oddziałujących cząsteczek, nie ma znaczenia, która z nich zostanie wybrana jako ligand. Przykładowo, jeżeli dysponujemy czystym antygenem możemy wyizolować monospecyficzne przeciwciała poliklonalne z surowicy odpornościowej, ale działając odwrotnie, możemy wyodrębnić antygen po przygotowaniu złoża, które zawiera unieruchomione odpowiednie przeciwciała. Chromatografię powinowactwa przeprowadza się zwykle w dwóch etapach. W pierwszym etapie przez kolumnę przepuszcza się materiał zawierający molekuły komplementarne do liganda. Przemieszczające się w obrębie złoża molekuły odnajdują unieruchomiony ligand i wiążą się z nim. Po odmyciu nieswoiście zaadsorbowanych molekuł rozpoczyna się drugi etap, w którym dochodzi do dysocjacji powstałych kompleksów i elucji swoiście związanych makromolekuł. Po zakończeniu elucji należy usunąć zastosowane w tym celu substancje od wyizolowanych makromolekuł. Można to zrobić różnymi metodami, np. stosując dializę, ultrafiltrację lub filtrację żelową.

Zalety i wady metody chromatografii powinowactwa

Zalety:

- brak ograniczeń w stosunku do objętości nanoszonej na kolumnę próbki oraz do stężenia separowanego materiału w próbce

- możliwość silnego zatężenia izolowanej molekuły

- bardzo wysoka specyficzność

- możliwość uzyskania w czystej postaci molekuł, które często nie mogą być izolowane innymi metodami

- wyizolowany materiał charakteryzuje się bardzo wysokim stopniem czystości pomimo zastosowania tylko jednego kroku preparatywnego.

Wady:

- trudności z uzyskaniem niektórych specyficznych ligandów

- częsta konieczność przygotowania złoża we własnym zakresie

- niska trwałość niektórych ligandów.

4.1

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (hydrophobic interaction chromatography . HIC)

Przeważająca większość makrocząsteczek posiada skomplikowaną strukturę wewnętrzną, w której można wyróżnić zarówno obszary hydrofilowe. Eksponowane na zewnątrz cząsteczki w polarnym otoczeniu wody, jak i obszary hydrofobowe, ukryte w jej wnętrzu i eksponowane na zewnątrz przy zmianie środowiska na niepolarne. Zarówno ilość takich obszarów hydrofobowych, jak i ich umiejscowienie w strukturze cząsteczki stanowią indywidualną cechę makrocząsteczek. Umożliwia to ich rozdział ze względu na odmienne właściwości hydrofobowe.

Podstawy teoretyczne chromatografii oddziaływań hydrofobowych

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) jest szeroko wykorzystywana do separacji i oczyszczania makrocząsteczek białkowych. Białka adsorbowane są na złożu dzięki występowaniu oddziaływań hydrofobowych fragmentów białka z silnie hydrofobowymi grupami ligandów, trwale umocowanych na powierzchni nośnika pozbawionego ładunku elektrycznego. Różne czynniki mają wpływ na zachowanie się cząsteczek białkowych w kontakcie z hydrofobowym adsorbentem. Niektóre z nich mają krytyczny wpływ na

rozdzielczość i selektywność metody, a także zdolność wiązania cząsteczek przez złoże. Poniżej są wymienione i omówione najważniejsze czynniki, tj:

- typ liganda oraz jego gęstość na powierzchni nośnika,

- rodzaj nośnika,

- rodzaj i stężenie soli,

- stężenie jonów wodorowych - pH,

- temperatura,

- skład solwentów.

Umieszczając białko w w roztworze o znacznym stężeniu (chyba może być np. w siarczanie amonu) i stopniowo zmniejszając jego stężenie poprzez dolewanie wody w pierwszej kolejności w pierwszej kolejności wytrącają się białka najbardziej hydrofobowe itd

2.

Przy użyciu tej metody powinno się oddzielać białka o właściwościach hydrofilowych i hydrofobowych (lub przynajmniej w dużym stopniu równiące się między sobą hydrofilowością/hydrofobowością).

Przykład: można w ten sposób oddzielić α-laktoalbuminy i β-laktoglobuliny.

Obecność jonów wapnia powoduje zmniejszenie hydrofobowości α-laktoalbuminy. Natomiast właściwości hydrofobowe β-laktoglobuliny słabo zależą od obecności tych jonów. W pierwszym etapie separacji przez kolumnę przepuszcza się mieszaninę tych białek w obecność EDTA. W takich warunkach α-laktoalbumina wiąże się ze złożem, a β-aktoglobulina przepływa przez kolumnę praktycznie bez oddziaływań. W drugim etapie wystarczy wyeluować zaadsorbowane na kolumnie białko, korzystając z buforu zawierającego jony wapnia.

---