IMMUNOHISTOCHEMIA

Etapy reakcji IHC - skrawki parafinowe

Odparafinowanie i uwadnianie (gdy są skrawki mrożeniowe to tego etapu nie ma)	Ksylen I
		Ksylen II
		Ksylen III
		Alkohol 99,8%
		Alkohol 96%
		Alkohol 90%
		Alkohol 80%
		Woda redestylowana - podwójnie destylowana
	Odkrywanie antygenu (rozbijanie wiązań krzyżowych powstałych przy utrwalaniu w aldehydach)	Bufor cytrynianowy pH 6,0, proteinaza K; do mikroskopii elektronowej inkubacja w metanadjodanie sodu; etap przeprowadza się w wysokiej temperaturze ok.100⁰C
		Woda redestylowana
	Blokowanie aktywności endogennej peroksydazy	Woda utleniona 3%
		Woda redestylowana
		PBS (bufor fosforanowy - buforuje formalinę)
	Blokowanie tła	BSA (albumina serum wołowego)
		Płukanie w PBS
	Inkubacja z II przeciwciałem	I przeciwciało (swoiste do wykrywania antygenu)
		PBS
	Inkubacja z I przeciwciałem	II przeciwciało + znacznik (peroksydaza)
		PBS
	Barwienie	Substrat DAB dla peroksydazy chrzanowej (brązowy produkt reakcji), NBT/BCIP dla alkalicznej fosfatazy (różowo - fioletowy produkt reakcji)
		Woda bieżąca
	Podbarwienie jąder komórkowych	Hematoksylina Meyera
		Bieżąca woda
	Odwodnienie	Alkohol 80%
		Alkohol 90%
		Alkohol 96%
		Alkohol 99,8%
		Aceton
	Prześwietlenie	Ksylen I
		Ksylen II
		Ksylen III
		Ksylen IV
Zamknięcie w medium	Żywica DPX

Skrawki z kriostatu:
- nie ma etapu odparafinowania i uwadniania,
- rozpoczyna się od blokowania aktywności endogennej np. peroksydazy.

Żywice akrylowe usuwa się acetonem. Dalszy etap taki sam jak przy skrawkach parafinowych:
- aceton,
- alkohol szereg malejący,
- woda redestylowana,
- odkrywanie antygenu itd.

Jeżeli używamy żywice, których nie trzeba usuwać zaczynamy proces od etapu odkrywania antygenu.
Hematoksyliny używa się, aby brązowe plamy umiejscowić na tle struktur komórkowych.
Wykrywanie antygenów tkankowych z użyciem specyficznych przeciwciał
Przeciwciało - najczęściej wiąże się jedynie z fragmentem antygenu zwanym determinantą antygenową.
W przypadku białka jest to ugrupowanie złożone z kilku aminokwasów. W przypadku węglowodanów - kilka oligosacharydów.

Przeciwciała używane w IHC
Monoklonalne - skierowane przeciwko jednej determinancie antygenowej danego antygenu. Wykrywają ściśle określoną determinantę antygenową.
Poliklonalne - zawierają mieszaninę przeciwko różnym determinantom antygenowym tego samego antygenu. Wykrywają różne determinanty tego samego antygenu możliwe jest stosowanie większych rozcieńczeń tych przeciwciał.
Monoklonalne są bardziej specyficzne niż poliklonalne.

Przygotowanie materiału tkankowego do reakcji IHC
Cele utrwalenia i przygotowani materiału do IHC:
- dobre utrzymanie ogólnej struktury tkanki/komórki,
- nie dopuszczanie do wypełniania i przemieszczania antygenów w tkance/ komórce,
- zachowanie właściwości antygenów do wiązania przeciwciał.

Ze względu na zróżnicowaną wrażliwość antygenów, na utrwalanie i odwadnianie i zatapianie materiału należy wyeliminować odpowiedni etap reakcji lub wykonać ją na skrawkach nieutrwalonych - kriostatowych.
Najlepszą immunoreaktywność - zachowują skrawki kriostatowi.
Materiał mrożeniowy pozwala na najlepsze zachowanie antygenowości tkanki.
Należy zwrócić uwagę na jakich skrawkach stosuje się dane przeciwciało.

Utrwalacze do reakcji IHC
1) Aldehydy - formaldehyd (FA) i glutaraldehyd (GA). Podczas utrwalanie wiążą różne grupy funkcyjne białek np. aminowe, sulfhydrylowe, guanidynowe, grupy OH fenoli - wytwarzając krzyżowe sieciowanie białek.
GA - wiązania krzyżowe są trwałe co powoduje znaczną utratę immunoreaktywności.
FA - wiązania nie są trwałe i ulegają częściowemu rozpadowi w czasie płukania; większa immunoreaktywność w porównaniu z GA.

Mieszaniny
1) w immunohistochemii mikroskopii świetlnej i fluoroscencyjnej stosuje się małe stężenia GA (0,1-1%) z dodatkiem FA (2-6%) np. fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa, Fluorochrom.
2) w immunohistochemii mikroskopii elektronowej stosuje się mieszaniny FA i GA + czterotlenek osmu, złoto koloidalne w efekcie najlepsza immunoreaktywność zachowanie ultrastruktury komórki.

Przygotowanie
Czterotlenek osmu - powoduje prawie całkowite utratę właściwości antygenowych większości substancji. Można je przywrócić traktując skrawki ultra cienkie tuż przed reakcji immunohistochemicznej, substancjami utleniającymi - najlepiej metanadjodanian sodu.
Występuje w mieszaninie: FA + GA + czterotlenek osmu.

Skład buforu PBS:
- Na₂HPO₄,
- NaH₂PO₄,
- KH₂PO₄,
-NaCl.

1. Przygotowanie skrawków parafinowych
   - usuwanie parafiny z tkanek - ksylen początkowo 60⁰C, później temperatura pokojowa,
   - uwodnienie tkanek 99,8% EtOH 50% EtOH

2. Przygotowanie skrawków zatopionych w żywicach
   Żywice polarne - (met akrylan glikolu, lowikryl, LR white, LR gold) - skrawki nie wymagają usunięcia żywicy.
   Żywice niepolarne - (Epon, BMM) należy je usuwać ze skrawków z użyciem acetonu. Następnie chronić - 99,8% EtOH 50% EtOH

3. Przygotowanie skrawków kriostatowych

Odzyskiwanie antygenowości
Bezpośrednio przed wykonaniem reakcji na skrawkach utrwalonych często konieczne jest tzw. odzyskiwanie antygenowości w celu rozbicia wiązań krzyżowych i tym samym ułatwienia penetracji przeciwciał udostępnienia większej ilości determinant antygenowych.
Odzyskiwanie antygenowości możliwe jest przez zastosowanie enzymów proteolitycznych lub kuchenki mikrofalowej lub łaźni wodnej.

1. Trawienie enzymami proteolitycznymi
   Po uwodnieniu skrawki inkubować w jednym z roztworów:
   - pronazy E,
   - proteinazy K,
   - proteazy,
   - trypsyny.
   Enzymy rozpuścić w buforze PBS pH ok. 7,2. Tkanki inkubować w temperaturze pokojowej lub temperaturze 37⁰C.
   Stężenie enzymu i czas trawienia skrawków ustala się eksperymentalnie. Po zakończeniu skrawki płukać kilkakrotnie w buforze PBS i wykonać reakcją immunocytochemiczną.

2. Gotowanie w kuchence mikrofalowej lub łaźni wodnej
   Po uwodnieniu skrawki inkubować w buforze cytrynianowym pH 6-9 (wyższe gdy antygen nie jest powszechny w tkance), gotować 15-20 minut, a potem wolno wystudzić.
   Płukać kilkakrotnie w buforze PBS i wykonać reakcję IHC.

W badaniach IHC:
- stosować kontrolę i testy na specyficzność przeciwciał (kontrola pozytywna i negatywna),
- dokładnie standaryzować wszystkie etapy danej metody
- stosować wzrastające rozcieńczonego specyficznego przeciwciała aż do rozcieńczenia nie dającego odczynu pozytywnego,
- w reakcjach kontrolnych zastępować specyficzne przeciwciała przez surowicę zwierzęcia tego samego gatunku,
- w odczytywaniu wyniku reakcji IHC kierować się istotnymi informacjami pochodzącymi z innych badań.

Kontrola negatywna - nie inkubuje się z pierwotnym przeciwciałem ( 2 szkiełka reakcja właściwa na drugim kontrola).
Kontrola pozytywna - tkanka na której ten antygen na pewno (musi wystąpić reakcja).
Wybiera się największe rozcieńczenie, które jako ostatnie daje zabarwienie.
Zahamowanie endogennej aktywności enzymatycznej
Enzymatyczne znaczniki przeciwciał
Peroksydaza izolowana jest z korzeni chrzanu, wykazuje dużą aktywność, a niezawodne metody jej wykrywania sprawiają, że jest najszerzej wykorzystywanym znacznikiem przeciwciał.
Alkaliczna fosfataza otrzymywana z jelit cielęcych.
Endogenną aktywność enzymatyczną należy zablokować przed wykonaniem IHC.
1) Zahamowanie aktywności peroksydacyjnej - inkubacja skrawków w metanolowym lub wodnym roztworem H₂O₂.
Utlenianie w kwasie nadjodowym, a następnie redukcja w bromowodoru sodu:
- doskonale hamuje endogenną aktywność peroksydazową,
- eliminuje z tkanki wolne grupy aldehydową, które nieswoiście wiążą przeciwciała.
2) Zahamowanie aktywności alkalicznej fosfatazy - dodanie do substratu specyficznego inhibitora - lewamizolu. Stężenie lewamizolu jest na tyle wysokie, że hamuje niską aktywność enzymu tkankowego, a nie hamuje znacznie wyższej aktywności enzymu znacznikowego. Lewamizol dodaje się do substratu - hamowanie następuje później niż w wypadku peroksydazy chrzanowej.

Blokowanie miejsc nieswoiście wiążących przeciwciała (blokowanie tła)
Krótkotrwała inkubacja skrawków przed reakcją IHC, z białkiem pochodzącym od innego zwierzęcia niż to od, którego uzyskano swoiste przeciwciało - np. albumina surowicy bydlęcej (BSA). Blokowanie nie zapobiega tworzeniu się mocnych, specyficznych wiązań pomiędzy antygenem, a zastosowanym przeciwciałem. Serum 5% - przez 5-10 minut.

Metoda bezpośrednia lokalizacji antygenów
Inkubacja badanej tkanki z jednym znakowanym przeciwciałem.
Pośrednia jest bardziej specyficzna.

Wykrywanie znaczników - uzyskany w wyniku reakcji barwny, nierozpuszczalny produkt wyznacza miejsce lokalizacji kompleksu wykrywanego antygen z przeciwciałem.
1) wykrywanie aktywności peroksydazy chrzanowej metodą z użyciem 3,3'-diaminobenzydyną (DAB)
Prowadzi do wytworzenia brązowego polimeru nierozpuszczalnego w wodzie, alkoholu ani rozpuszczalnikach organicznych wykazującego zdolność do wiązania metali ciężkich. Nierozpuszczalność jest istotna ze względu na zamknięcie.
Dodanie soli miedzi, kobaltu, niklu lub złota do płynu inkubacyjnego z DAB powoduje wzmocnienie intensywności reakcji i zmienia barwę brązowego produktu na niebieski lub czarny, co pozwala niekiedy, zwłaszcza przy słabej reakcji na zwiększenie jej wyrazistości.
2) wykrywanie aktywności alkalicznej fosfatazy
NBT/BCIP - reakcja w środowisku zasadowym. Produkt o barwie niebieskiej.

Układ: biotyna - amidyna (lub streptamidyna)
Biotyna łatwo wiąże się z białkami , w tym z przeciwciałami. Biotynowane przeciwciało jest łatwo wykrywane przez kompleks amidyna (lub streptamidyna) - peroksydaza chrzanowa. Peroksydaza znakuje przeciwciała tylko w jednym miejscu. Biotyna znakuje przeciwciało w kilkudziesięciu miejscach. Sygnał będzie intensywniejszy.
I przeciwciało nieznakowane II przeciwciało znakowane biotyną inkubacja skrawków z amidyna i peroksydazą chrzanową substrat

Zasady właściwego przeprowadzania reakcji IHC

Na etapie utrwalania:
- nieprawidłowe lub niedostateczne utrwalenie może doprowadzić do wypłukiwania antygenu z tkanki,
- użycie nieprawidłowego utrwalacza lub silne utrwalenie możne doprowadzić do całkowitego zablokowania determinant antygenowych,
- zablokowanie determinant w następstwie odwadniania lub zatapiania materiału.

Na etapie lokalizacji antygenów:
- inkubację z roztworem przeciwciał przeprowadza się w komorze wilgotnej, aby uniknąć ich odparowania i zagęszczania,
- wszystkie etapy powinny być przeprowadzone w środowisku soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bądź buforem Tris - HCl (TBS),
- w przypadku stosowania enzymów jako znaczników należy pamiętać o konieczności efektywnego blokowania endogennej aktywności enzymu w tkance.

Przyczyny uzyskania wyniku fałszywie pozytywnego i fałszywie negatywnego
- ukrycie determinant z powodu związania komórki z różnymi strukturami komórki,
- zmiany w budowie antygenów podczas rozwoju komórki np. potranslacyjne zmiany konformacji białka,
- procesy związane z przygotowaniem tkanki do badań - utrwalanie, odwadnianie, zatapianie.

Reakcje kontrolne
- stanowią gwarancję wiarygodność wyników procedury,
- mają na celu potwierdzić swoistość metody i wykryć wszelkie artefakty.

Dodatnia reakcja kontrolna:
- przeprowadzona na wybranej, modelowej tkance zawierającej wykrywany antygen,
- reakcja wskazuje na prawidłowość stosowanej procedury.

Ujemna reakcja kontrolna:
1) z pominięciem przeciwciała swoistego - wykrywa nieswoiste wiązanie przez tkankę drugiego przeciwciała/i lub endogenną aktywność enzymatyczną,
2) z pominięciem swoistego przeciwciała i przeciwciała wtórnego - zabarwienie tkanki świadczy o endogennej aktywności enzymatycznej w badanym materiale lub niespecyficznym wiązaniu przez tkankę kompleksu antygen - przeciwciało.

Inne znaczniki przeciwciał
Fluorochromy
Najczęściej stosowane:
- izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) - zielone zabarwienie,
- rodanina (Cy3),
- czerwień teksańska (Texas Red),
- DAPI - wybarwia jądra na niebiesko.
Są wrażliwe na ksyleny dlatego zamyka się je glicerolem.
Są to substancje wykazujące zdolność emitowania światła po pobudzeniu ich źródłem promieniowania.

ANALIZA EKSPRESJI GENÓW - METODA HYBRYDYZACJI IN SITU
np. FISH, CISH, SISH.

Podstawowym warunkiem pomyślnego wyniku hybrydyzacji in situ jest odpowiednia jakość preparatu. Szkiełka odtłuszczone, czyste, wysoko adhezyjne.

Sondy - to różne sekwencje DNA ( dwu - lub jednoniciowe), RNA (jednoniciowe cRNA) komplementarne do lokalizowanych fragmentów genów. Sondy są odpowiednio znakowane. Otrzymywane np. na drodze amplifikacji z użyciem metody PCR.

Długość sondy - minimalnie 24 nukleotydy. Odpowiada za specyficzność metody. Za długa może się skręcać i tworzyć komplementarne odcinki wewnątrz sondy.

Do znakowania wykorzystuje się obecnie fluorochromy, biotynę, digoksygeninę, które wraz z nukleotydami wbudowanie są w DNA sondy.
Deparafinizacja i uwadnianie
Trawienie proteinazą K.
Płukanie w PBS.

Proteinaza K - działa w szerokim zakresie pH i w niespecyficzny sposób atakuje peptydy. Używamy ją w celu usunięcia białek zlokalizowanych w obrębie sekwencji mRNA do których chcemy skierować dana sondę.
Odwadnianie
Prehybrydyzacja - w buforze - prowadzi do zerwania wiązań wodorowych.
- 5*SSC (NaCl, cytrynian sodu),
- 5* Denhardt's (BSA, ficoll, PVP),
- 100 μg/ml DNA spermy łososia,
- 25% formalina
Prehybrydyzacja - 1h w 42⁰C.

SSC - nadaje roztworowi wymaganą siłę jonową.
Formamid - utrzymuje kwasy nukleinowe w stanie denaturowanym.
Siarczan dekstranu - zwiększa wydajność hybrydyzacji.
Niespecyficzne kwasy nukleinowe (DNA spermy łososia, tRNA) - zapobiega nieswoistemu wiązaniu sondy ze strukturami komórkowymi.

BSA i PVP (poliwinylpirolidon) - w celu zmniejszenia tła.

Hybrydyzacja
Denaturacja znakowanej digoksygeniną sondy - 10 minut 65⁰C
Inkubacja w lodzie przez 5 minut.
W tym samym buforze + sonda 12-16 godzin w 42⁰C.

Płukanie po hybrydyzacji - w buforze SSC.
Wykrywanie hybrydów DNA-DNA (sondy)
Używamy przeciwciała skierowanego do przeciwciała znakowanego.
Barwienie jąder komórkowych - DAPI.
Płukanie w wodzie.
Suszenie skrawków.
Zatapianie w glicerolu.

---