METODA SAUTHERNA

DNA tnie się przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych na fragmenty, które następnie rozdziela się pod względem wielkości poprzez elektroforezę w żelu. Fragmenty te przenosi się następnie na filtr wiążący DNA , a fragmenty komplementarne identyfikuje się za pomocą autoradiografii, stosując wyznakowane, radioaktywne sondy.

Za pomocą analizy Sautherna możemy wykazać mutacje odcinkowe

-o delecji będzie świadczyć zmniejszenie się rozmiarów lub brak prążków

-o amplifikacji -powstanie prążków o zmniejszonych rozmiarach.

PCR (polymerase chain reaction)

Umożliwia powielanie wybranego fragmentu DNA w milionach kopii, bez użycia wektorów i bakterii. Polega na ok.30 powtarzających się cyklicznych etapach.

Etapy:

-denaturacja dna w temp 90-95 C

-wiązanie starterów temp.50-65 C

- wydłużanie starterów temp 68-72 C

(synteza powielanego fragm.DNA)

Każdy cykl ma ok.3 min, a powstające amplikony służą jako matryce w następnych cyklach reakcji

Prowadząc do logarytmicznego przyrostu ilości produktów. Reakcja PCR zachodzi w termoblokach zdolnych do szybkich zmian temp. La poszczególnych etapów reakcji(4C\sek.)

Mieszanina reakcji PCR;

1.matryca DNA lub cDNA

2. Dwa startery -fragm. Jednoniciowych DNA o dł. kilkunastu nukleotydów komplementarnych do matrycy i ograniczające długości powielanego odcinka DNA.

3.dNTP-miesznina dATP,dCTP,dGTP,dTTP,

4.Termostabilna polimeraza DNA(np. polimeraza Taq)

5. kationy magnezu

6.odpowiedni bufor

Cel:

-Wykrywanie mutacji genowych.

-wykrywanie chorób genetycznych

-wykrywanie nowotworów

-wykrywanie polimorficznych sekwencji(identyfikacja osobnicza)

-monitorowanie chorób(białaczki)

-monitorowanie translokacji.

ANALIZA NORTHERN BLOT

(dotyczy RNA)

Etapy;

-elektroforeza preparatów RNA

-transfer na filtr nylonowy

-związanie RNA z filtrem

-hybrydyzacja

-płukanie filtru

-autoradiografia

---