Spektrofotometria jest to technika spektroskopowa polegająca na ilościowym pomiarze absorpcji, emisji lub odbicia światła. Od zwykłej fotometrii różni się tym, że umożliwia pomiar światła w zależności od długości światła.

W technikach spektrofotometrycznych mierzy się i porównuje intensywność poszczególnych sygnałów w kolejnych widmach spektroskopowych, natomiast w technikach spektroskopowych nie zaliczanych do spektrofotometrii pomiar wartości intensywności światła ma drugorzędne znaczenie, a ważne jest raczej występowanie i kształt sygnałów w widmach.

Wiązka promieniowania monochromatycznego przechodząca przez warstwę roztworu jest osłabiona w stosunku do padającego. Promieniowanie o natężeniu Io ulega częściowo odbiciu lub rozproszeniu, częściowo pochłonięciu, a tylko część przechodzi przez roztwór. Powyższą obserwację można przedstawić w postaci równania:

                           

                                                                                    Io = Ir + Ip + It

gdzie:

 

              Io: natężenie wiązki promieniowania monochromatycznego

              Ir: natężenie promieniowania rozproszonego i obitego

              Ip: natężenie promieniowania pochłoniętego

It: natężenie promieniowania przechodzącego przez roztwór

 

Pomiar absorbancji należy wykonywać przy długości fali, dla której uzyskuje się maksymalną absorpcje (wartość długości fali można zaczerpnąć z tablic).

W przypadku gdy zależność 10 jest liniowa, wówczas dany roztwór podlega prawu Lamberta - Beera. Jednak w praktyce spotyka się odchylenia od tego prawa (rys 3) głównie za sprawą reakcjami chemicznymi zachodzącymi wraz ze zmianą stężenia lub błędami aparaturowymi, np. niską monochromatycznością promieniowania.

Spełnienie prawa Lamberta-Beera nie jest jednak warunkiem koniecznym wykonania analizy spektrofotometrycznej. Odchylenia od prawa Lamberta-Beera powodują zwiększenie błędów oznaczania.

 

Odstępstwa od praw absorpcji.

1. związane z próbką, zależą od charakteru środowiska;

• zmiana współczynnika załamania promieniowania,

• zbyt wysokie stężenie (oddziaływanie składników roztworu; hydroliza, solwatacja, polimeryzacja),

• nakładanie się przekrojów czynnych cząstek

 

2. instrumentalne;

• brak monochromatyzacji wiązki promieniowania,

• niska klasa przyrządu

 

Ze względu na powstawanie znacznych błędów nie należy dokonywać pomiarów przy bardzo niskim bądź wysokim stężeniu roztworu. Przy małych stężeniach wynik jest obarczony błędem, wskutek małych wartości absorbancji. Natomiast przy dużych stężeniach sytuacja jest odwrotna, mała część promieniowania przechodzi przez roztwór a zatem absorbancja ma wartości bardzo duże. Badanie czułości pomiaru można przeprowadzić wykorzystując stosunek ΔA/A, który odpowiada najmniejszej różnicy absorbancji, możliwej do zmierzenia w stosunku do całej absorbancji.

 

Budowa i zasada działania spektrofotometru

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Schemat optyczny spektrofotometru Spekol: 1-lampa wolframowa,2-kondensor, 3-zwierciadło, 4-szczelina wejściowa, 5-układ achromatyczny, 6-siatka dyfrakcyjna, 7-soczewka achromatyczna, 8-szczelina wyjściowa, 9-kuweta, 10-filtr, 11-detektor, 12-wzmacniacz tranzystora, 13-urządzenie pomiarowe, 14-bęben (pokrętło).

 

 

Źródłem (1) emitowanego światła jest lampa wolframowa (zakres 420-750 nm) lub lampa rtęciowa HQE (365-750 nm). Światło przechodząc przez kondensor (2) ulega odbiciu od zwierciadła (3) następnie przechodzi przez szczelinę wejściową (4) do kolimatora, gdzie

Każda cząsteczka ma charakterystyczny dla siebie układ poziomów energetycznych -elektronowych, oscylacyjnych i rotacyjnych, przy czym tych ostatnich nie obserwuje się w cieczach. W wyniku absorpcji promieniowania ultrafioletowego lub widzialnego cząsteczka przechodzi do jednego ze stanów wzbudzonych, a następnie na różne sposoby wytraca nadmiar energii. Procesy pochłaniania i deekscytacji przedstawia się często schematycznie na tzw. diagramie Jabłońskiego:

W cieczach w temperaturach bliskich temperaturze pokojowej obserwuje się praktycznie tylko fluorescencję. Widmo jej składa się z szeregu pasm oscylacyjno-elektronowych, a jego kształt zdeterminowany jest regułą Francka-Condona, która mówi, że w czasie aktu absorpcji kwantu promieniowania elektromagnetycznego (10^-15 s), jądra atomowe w molekule nie zmieniają w sposób istotny swego położenia i modu oscylacji. Zatem w stanie wzbudzonym natychmiast po akcie absorpcji konfiguracja i wzajemne ruchy jąder atomowych są identyczne jak w stanie podstawowym tuż przed absorpcją. Czas życia w elektronowym stanie wzbudzonym jest rzędu 10^-4-10^-9 s. W tym czasie molekuła oddaje w sposób bezpromienisty w zderzeniach nadmiar energii rotacyjnej i oscylacyjnej. Energia wzbudzenia elektronowego jest zbyt duża, aby molekuła mogła się jej łatwo pozbyć bezpromieniście w niewysokich temperaturach. Dominuje więc mechanizm promienisty. Emisja następuje więc z zerowego poziomu oscylacyjnego stanu wzbudzonego, a zatem widmo emisyjne jest przesunięte w stronę większych długości fali w stosunku do widma absorpcji (przesunięcie Stokesa). Jeżeli układ poziomów oscylacyjnych w stanach podstawowym i wzbudzonym S₁ jest podobny, to widmo emisji fluorescencji jest zwierciadlanym odbiciem długofalowego pasma w widmie absorpcji.

Wydajność różnych procesów deekscytacji w stanie ciekłym zależy od układu poziomów energetycznych badanej cząsteczki oraz rozpuszczalnika, a także od temperatury. Podniesienie temperatury powoduje wzrost wydajności procesów bezpromienistych

IC

ISC

A

ISC

F

P

S2

S1

S0

T2

T1

3

2

1

0

3

2

1

0

3

2

1

0

3

2

1

0

3

2

1

0

Diagram Jabłońskiego. Oznaczenia: A - absorpcja, F - fluorescencja, P -fosforescencja, IC - konwersja wewnętrzna, ISC - przejścia międzysystemowe (interkombinacyjne), So, S1, S2, stany elektronowe singletowe podstawowy i dwa wzbudzone, T1, T2, stany wzbudzone trypletowe, liczby 0,1,2,3 numerują poziomy oscylacyjne, strzałki z liniami ciągłymi oznaczają przejścia promieniste, strzałki z liniami przerywanymi - przejścia bezpromieniste. Dla przejrzystości rysunku poziomy rotacyjne pominięto.  

po przejściu przez układ achromatyczny (5) pada na monochromator (6), którym jest siatka dyfrakcyjna. Przy pomocy układu dźwigni, poruszanych bębnem (14), możliwe jest obracanie siatką dyfrakcyjną i dzięki temu w szczelinie wyjściowej monochromatora uzyskuje się wiązkę o żądanej długości fali. Szerokość spektralna przepuszczonych przez szczelinę wiązek monochromatycznych wynosi 12 nm. Wiązka o wybranej długość, po przejściu przez soczewkę achromatyczną (7), trafia na szczelinę wyjściową (8) i po przejściu przez kuwetę z roztworem badanym (9) i filtr barwny służący do pochłaniania promieniowania cieplnego (10) pada na detektor (11). Najczęściej detektorem jest fotoogniwo selenowe. Powstały w fotoogniwie fotoprąd ulega wzmocnieniu we wzmacniaczu (12) a następnie dostaje się do urządzenia pomiarowego (13).

Stan kwantowo- mechaniczny elektronu opisywany jest przez liczby kwantowe. Ze względu na zasadę minimum energii elektrony obsadzają najniższe, dozwolone (skwantowane) poziomy. Wówczas mówimy, że atom znajduje się w stanie podstawowym. Pochłonięcie porcji energii prowadzi do wzbudzenia atomu.

Skwantowana w atomie jest nie tylko energia, ale również orbitalny moment pędu, orientacja przestrzenna orbitalnego momentu pędu, spin i orientacja przestrzenna spinu. Powyższe wielkości określają liczby kwantowe:

1. główna n, kwantująca energię i przyjmująca wartości liczb naturalnych:

....................(1)

2. poboczna l, kwantująca orbitalny moment pędu i przyjmująca wartości od 0 do (n-1):

..................(2)

3. magnetyczna m, kwantująca orientację przestrzenną orbitalnego momentu pędu i przyjmująca wartości od - l do + l, łącznie z zerem:

..................(3)

4. spinowa s, przyjmująca wartość ½ :

...................(4)

5.magnetyczna spinowa
, kwantująca orientację przestrzenną spinu i przyjmująca wartości - ½, + ½:

..................(5)

Z mechaniki kwantowej wynika, że nie da się jednocześnie określić położenia i pędu elektronu czyli jego toru. Można jedynie określić prawdopodobieństwo znalezienia elektronu w wybranym obszarze wokół jądra. Dlatego też do opisu ruchu elektronu używamy równania Schrodingera, którego rozwiązaniem są funkcje falowe.

---