Genetyka ćw5
1. Analiza fotografi obrazująca wyniki testów cytogenetycznych
2. Analiza mikroskopowa preparatów :
test aberracji strukturalnych chromosomów
test mikrojądrowy
test wymian chromatyd siostrzanych (SCE)
test kometowy
1. Cytogenetyka monitorowana skutków skażeń chemicznych i promieniowania jonizującego
czynniki fizyczne, chemiczne, biologiczne mogą indukować mutacje orgiazmów żywych, w tym również u człowieka, który jeśli nie zostanie bezpiecznie naprawione lub usunięte, mogą prowadzić do zmian patologicznych, m.in. do rozwoju choroby nowotwoeroch. Do oceny mutagenów i gegenotyksycznego wpływu substancji na organizmy żywe testy cytogenetycznej bakteryjne.
Testy cytogenetyczne jako narzędzie do monitoringu genotoksyczności
a) Test struktury aberracji chromosomowych (CA)
wykorzystuje właściwości klastogenne mutagenów i kancerogenów (zdolność do łamania chromosomów)
występują dwa rodzaje aberracji strukturalnych
Chromosomowe gdy uszkodzenie obejmuje dwa chromatydy danego chromosomu matefazowego. Powstają w wyniku dzialania promieniowania jonizującego.
Chromatydowe, gdy uszkodzenie dotyczy jednej chromatydy. Powstają głównie pod wpływem mutacji chemicznych.
Do strukturalnych aberracji chromatydowych zaliczamy:
przerwy chromatynowe
złamania chromatynowe
wymiany chromatynowe: figury trójramienne i czteroramienne, wymiany chromatyd siostrzanych (po zastosowaniu specyficznego barwienia)
Aberracje chromosomowe to aberracje prereplikacyjne powstałe przed replikacją DNA w fazie G1 lub G0, podwajane w fazie S; uszkodzenia obejmują obydwie chromatydy
Aberracje chromatynowe to aberracje postreplikacyjne powstałe po replikacji DNA w późnej fazie S lub G2; uszkodzenia dotyczą jednej z chromatyd
Test aberracji strukturalnych chromosomów możemy przeprowadzać w warunkach In vitro i In vivo. Materiałem do testu w warunkach In vitro mogą być różne rodzaje komórek np.:
limfocyty krwi obwodowej
fibroblasty
trofoblast
komórki płynu owodniowego
Za kryterium mutagennego działania danego związku przyjmuje się statystycznie znamienny wzrost częstości aberracji w próbie badanej w porównaniu z kontrolą.
Test wymian chromatyd siostrzanych:
Test ten ma zastosowanie praktyczne w ocenie In vivo i In vitro związków chemicznych podejrzanych o działanie mutagenne lub kancerogenne oraz ocenie skutków ekspozycji na mutagen. (test trwa 72 godziny). Substancje analizuje się w 3 stężeniach i porównuje do kontroli. Hodowla jak w teście aberracji.
-opiera się na semikonserwatywnej replikacji DNA czyli syntezy komplementarnej nici poilinukleotydowej DNA na matrycy nici macierzystej
- SCE zachodzą w punktach rozpoczęcia replikacji DNA lub tuż obok
- podstawą testu jest hodowla chromosomów z dodatkiem BrdU (bromodeoksyurydyny - analog tymidyny) i różnicowe wybarwienie chromosomów.
Inkorporacja BrdU prowadzi do powstania w chromosomach, po dwóch cyklach komorkowych zróżnicowanego wybarwienia się chromatyd siostrzanych w obrębie każdego chromosomu.
Po zastosowaniu specyficznego barwienia możemy obserwować zmiany w ich strukturze polegające na wzajemnych przemieszczeniach homologicznych odcinków DNA między dwiema chromatydami siostrzanymi (SCE)
Chromatydy chromosomów metafazowych zawierające wbudowany BrdU w obydwie nici DNA (chromatydy B-B) wiążą mniej barwnika Giemzy - są jasne w porównaniu z chromatydami posiadającymi BrdU tylko w jednej nici (chromatydy T-B), które barwią się ciemniej.
Jeżeli komórka jest po pierwszym podziale to obie chromatydy chromosomu metafazowego wybarwione są jednolicie na ciemno, po drugim podziale jedna chromatyda zabarwiona jest na jasno a druga na ciemno, a po trzecim podziale obserwujemy w obrębie chromosomu metafazowego 2/3 chromatyd zabarwionych na jasno i 1/3 na ciemno.
Z każdej hodowli analizuje się od 50 do 100 metafaz które zawierają po 46 chromosomów i są w drugim cyklu replikacyjnym. Badany związek uznaje się za genotoksyczny jeżeli powoduje istotny wzrost częstości SCE na komórkach w porównaniu do kontroli.
Test mikrojądrowy
Wykorzystuje właściwości klastogenne mutagenów powodujących zlamania chromosomów oraz uszkodzenia wrzeciona podziałowego. Mikrojądra (MN) tworzone są przez:
- całe chromosomy powstałe na skutek uszkodzenia wrzeciona podziałowego i pozostałe po podziale w cytoplazmie lub
- odłamane (acentryczne) fragmenty chromosomów.
Test trwa 72h
Na 28h przed końcem hodowli dodaje się cytochalazyne-B która zatrzymuje podział cytoplazmy ale nie blokuje podziału jądra.
Analiza preparatów polega na ocenie od 500 do 1000 komórek dwujądrzastych otoczonych błoną komórkow, których mikrojądra widoczne są w postaci drobnych struktur (jak na zdjęciu z prezentacji)
Test kometowy (elektroforeza pojedynczych Komorek w żelu agarozowym - SCGE)
SCGE to metoda badania stopnia uszkodzenia DNA wywołanego działaniem czynników genotoksycznych
Jest to czuła metoda pozwalająca na wykrycie podwojnych i pojedynczych pęknięć nici DNA oraz miejsc alkalicznie labilnych (alkali labile sites - ALS) w pojedynczych Komorkach
Zawartość DNA w „ogonie” komety i jego długość są funkcją pochłoniętej dawki promieniowania; im większa dawka promieniowania tym dłuższy ogon komety.
Wybarwianie preparatów uzyskanych metodą SCGE wykonujemy najczęściej za pomocą barwników fluorescencyjnych takich jak: bromek etydyny, DAPI czy jodek propidyny.
W teście komety bada się pojedyncze komórki pochodzące od człowieka lub zwierząt laboratoryjnych np. komórki wątroby, śledziony, komórki jądrzaste krwi, komórki nabłonka. Wygodnym obiektem do badań są np. erytrocyty ryb ponieważ posiadają one jądra komórkowe i stanowią nawet 97% wszystkich elementów morfotycznych krwi ryby.
Analiza komet jest metodą względnie łatwą do wykonania a uzyskane wyniki są powtarzalne.
Test Amesa
Wykorzystuje się bakterie: Salmonella typhimurium mają mutacje w operonie histydyny - (Mutanty his-)
1.Nanosi się histydyne na szalkę petriego
2. Na histydyne nanosimy badaną substancje
3. I bakterie thyphimurium które żrą histydyne
4. kiedy zeżrą całą histydyne muszą się przekształcić w his+ (bo wcześniej były his-)
5.Jak skończyla się histydyna a bakterie dalej rosną to znaczy że badana substancja powoduje mutacje bakterii do his
+ i jest niekorzystna dla czlowieka
Wyszukiwarka