Namnażanie wirusów w laboratorium
-nie mogą mnożyć się poza komórkami
-ograniczony zakres komórek w których się mnożą.
-nie wszystkie wirusy namnażają się w komórkach In vitro.
Hodowle pierwotne -> diploidalne, używane do produkcji szczepionek p-virusowych, mogą być pasażowane tylko kilkakrotnie (zazwyczaj 3-5 razy).
Hodowle półciągłe -> z tkanki płodowej, prawidłowy kariotyp diploidalny, używane do produkcji szczepionek, do ok. 50 pasaży.
Hodowle ciągłe -> aneuploidalne, często wywodzą się z guza lub z tkanki ale są po transformacji, dzielić się mogą w nieskończoność.
Hodowle narządowe -> niektóre wirusy namnażają się tylko w hodowlach narządowych (np. koronawirusy tylko w tchawicy ludzkiej)
Limf B -> uzyskują cechę umożliwiającą dzielenie się w nieskończoność po zakażeniu EBV
Limf T -> rosną w obecności IL-2
CPE - EFEKT CYTOPATYCZNY -> zmiany w wyglądzie komórki zakażonej, charakterystyczne dla poszczególnych wirusów (np. Herpes simplex - balonowatość komórek).
Łysinki - ??????
Namnażanie w zarodkach kurzych -> od zapłodnienia do wyklucia 21 dni, do badania ->inkubacja od 10 do 14 dni w 37st.
- zakażanie jamy owodniowej - do izolacji wirusa grypy
- zakażenie jamy omoczniowej - wirus grypy po zakażeniu przez j. owodniową namnaża się w dużych ilościach w jamie omoczniowej (do produkcji szczepionek)
- błona kosmówkowo-omoczniowa - wirusy herpes i poks
Namnażanie za pomocą technik biologii molekularnej. Wektorami często są adenowirusy i wirusy krowianki, plazmidy.
Konsekwencje zakażenia:
Patogenność - różnica w ciężkości choroby pomiędzy różnymi mikroorganizmy (np. różne wirusy)
Wirulencja - różnica w ciężkości choroby pomiędzy różnymi szczepami tego samego wirusa.
Wirulencja lub jej brak może być spowodowane przez bardzo małe zmiany w genomie wirusa.
Efekt cytopatyczny (CPE) :
- Liza komórek - może dojść do zahamowania syntezy makrocząstek i/lub zahamowania metabolizmu komórek (np. poprzez nagromadzenie się białek kapsydu).wirusy lizujące
- Fuzja komórek - poprzez białka fuzyjce (pośredniczące w przejściu vir do komórek) dochodzi do tworzenia syncytiów (przez np. paramyksowirusy (odra), herpeswirusy, niektóre retrowirusy).wirusy nielizujące - przenoszą się bezpośrednio z komórki do komórki.
- Ciałka wtrętowe - eozynofilne lub bazofilne ciałka pojawiające się na skutek zarażenia komórek niektórymi mikroorganizmami. Wewnątrz jądra i/lub wewnątrz cytoplazmy. Są to: -agregaty dojrzałych wirionów (np. papowawirusy) - miejsca o zmienionej barwliwości (bo tam synteza wirusa) - zmiany degeneracyjne.
Nowe antygeny na powierzchni komórki.
Sposoby szerzenia się infekcji wirusowych:
Przez układ oddechowy:
Ortomyksowirusy - grypa
Paramyksowirusy - Odra, świnka, zakażenia wirusem RS
Rinowirusy - przeziębienia
Wirus ospy wietrznej i półpaśca - ospa wietrzna.
Przez układ pokarmowy:
Poliowirus - poliomyelitis
Inne enterowirusy - choroby gorączkowe z zajęciem mięśni lub OUN
Rotawirusy - gestroenteritis
Wnikanie przez spojówki
Enterowirus typ 70 - zapalenie spojówek
Adenowirus typ 8 - zapalenie rogówki i spojówek
Wnikanie przez układ moczowo-płciowy
Lentiwirus (HIV) - AIDS
Hepadnawirus - WZW B
Herpes simplex - zmiany opryszczkowe w cewce i szyjce macicy
Papillomawirus - brodawki szyki macicy, rak.
Wirusy wywołujące wysypkę w jamie ustnej:
Herpeswirusy:
-opryszczka zwykła - zap. jamy ustnej z pęcherzykami i owrzodzeniami.
-ospa wietrzna - pęcherzyki szybko ulegające owrzodzeniu
-mononukleoza zakaźna - wybroczyny czasami na podniebieniu
Coxsackie A:
Herpangina - małe pęcherzyki na tylnej części j.u.
Zespół ręki stopy i ust - pęcherzyki, przednia część j.u.
Paramykswowirus:
Odra - plamki Koplika na obrzękniętej błonie śluzowej w pobliżu ujścia przewodów ślinianek
Choroby wir wywołujące wysypkę na skórze:
Plamista - różyczka, rumień zakaźny (parwowirus), zakażenia enterowirusami i wir. ECHO, denga
Grudkowo-plamista - Odra, mononukleoza zakaźna, zakażenia enterowirusami i wir. ECHO
Pęcherzykowa lub pęcherzykowo-grudkowa - opryszczka zwykła, ospa wietrzna, półpasiec, zakażenia Coxsackie (głównie A9 i A16), zakażenia enterowirusami i wir. ECHO
Plamicowa - różyczka wrodzona
Wybroczynowa/krwotoczna - wir gorączki krwotoczne.
Adenoviridae - DNA
A - 12,18,31 - układ pokarmowy - endemiczne
B - 3, 7, 11, 21 - gardło, płuca, ukł. Moczowy, spojówki - epidemiczne
C - 1,2,5,6 - gardło - utajone zak. Gardła
D - 8,9,19 - oko - epidemiczne
E - 4 - górne drogi oddechowe - epidemiczne
F - 40,41 - ukł. pokarmowy - endemiczne.
12 wierzchołkowy ikosaedron , z każdego wierzchołka cienkie włókno
replikacja: rdzeń wirusa przenoszony jest do jądra, typowy wzorzec replikacji wirusów dsDNA. Utworzenie wczesnych i późnych nici mRNA kodujących białka wczesne i późne.
Potomne cząstki gromadzą się w b. dużej liczbie, tworzą krystaliczne agregaty. Mechanizmy syntezy wyczerpują się, komórka ginie.
Klinika:
- endemiczne zak. dróg oddechowych (dzieci): niedrożność nosa, kaszel, zap. gardła.
- epidemiczne zak. ukł. oddechowego (u rekrutów): górne i dolne dr. Oddechowe. Zak. sprzyja stres i zgrupowanie. Ok. 10 dni, często zap. płuc.
- gorączkowe zap. gardła i spojówek: jednoczesne zap. gardła i spojówek spojówek u dzieci i młodzieży. Źródło - woda w basenach.
- epidemiczne zap. spojówek i rogówki: keratoconiunctivitis, szerzy się epidemicznie, np. przez narzędzia medyczne.
- choroby ukł pokarmowego : najczęściej zap jelit u niemowląt.
Dodatkowo: wgłobienie jelita u niemowląt, martwicze zap jelita cienkiego, ostre zap pęcherza moczowego, zap opon MR i mózgu. U chorych na AIDS ciężkie zespoły (zap płuc).
Patogeneza: inkubacja - 5-10 dni, replikuje w gardle, spojówkach, jelicie cienkim. Często bez objawów jest obecny w migdałkach.
Badania diagnostyczne: odczyn immunfluorescencji,.
Doustna żywa szczepionka w wojsku.
Testy diagnostyczne
Stosowanie przeciwciał monoklonalnych -> zawsze taka sama czułość i swoistość wobec antygenów wirusowych.
Odczyn immunofluorescencji bezpośredniej IFS - wirus lub antygen wirusowy znakowane są surowicą odpornościową wyznakowaną barwnikami fluorescencyjnym (świeci na zielono w mikroskopie fluorescencyjnym). Wada: trzeba wyznakować każdą surowicę p-wirusową.
Odczyn immunofluorescencji pośredniej IFA - stosuje się nie znakowaną surowicę swoistą wobec antygenu wirusowego. Barwnik przyłączany jest do surowicy przeciw Ig gatunku, z którego pochodzi surowica p-wirusowa. Zaleta: do badania różnych wirusów wystarczy tylko jedna fluorescencyjna surowica.
ELISA - metoda immunoenzymatyczna, odczyn immunoadsorbcyjny - popularny, zautomatyzowany. Podobne do IFA ale: znacznikiem enzym (ELISA) lub jod radioaktywny (RIA). Przyłączenie wyznakowanych przeciwciał wykrywane jest poprzez reakcje enzymu (zabarwienie) lub pomiar promieniowania (RIA). Wynik ELISA odczytywany jest fotometrycznie a RIA w liczniku prom. Testy te pozwalają na ilościową ocenę badanych antygenów/przeciwciał. Wymagane jest płukanie pomiędzy etapami badania oraz próby kontrolne + i -.
Test aglutynacji lateksowej. opłaszczone antygenem cząstki lateksu aglutynują po zmieszaniu ze swoistą surowicą odpornościową. Szybki i wygodny ale przy małych stężeniach może dawać fałszywe wyniki ujemne.
Mikroskopia elektronowa i immunoelektroskopia elektronowa. Barwione kwasem fosforowolframowym próbki (negatywowo - wiriony się nie barwią, białe). Wykrywanie min przy 10^6 cząstek. Identyfikacja bezpośrednio w materiale badanym (np. HSV i VZV w płynie z pęcherzyków)
Metoda hybrydyzacji kwasu nukleinowego. Przeprowadza się denaturację DNA do pojedynczej nici i dodaje sondę (sekwencje wyznakowanych fluorescencyjnie lub radioaktywnie nukleotydów komplementarnych do kw. nukleinowego wirusa). Bardzo duża czułość, możliwość stosowania In situ.
PCR- polimerazowa reakcja łańcuchowa.
Próbkę kliniczną DNA poddaje się wielokrotnemu powielaniu w cyklerze a następnie rozdziela się w żelu poliakrylamidowym i uwidacznia przez dodanie bromku etydyny i naświetlenie prom. nadfioletowym. Bardzo duża czułość! Do wykrywania HCV, HBV, CMV.
Wykrywanie wirusów w hodowlach komórkowych. Wykrywanie przez obserwacje CPE. - wirusy lizujące (np. enterowirusy) -> rozpad komórek , wirusy nie lizujące (np. herpeswirusy, paramyksowirusy) -> tworzenie syncytiów, balonowatość komórek (lub czasem nie). Czasem gdy wirus nie daje CPE to komórka nim zrażona jest niewrażliwa na zakażenie innym wirusem.
HIV-1 wykrywa się w hodowli leukocytów stymulowanych fitohemaglutyniną i IL-2. dają CPE.
Hemadsorbcja. Wirusy uwalniając się z komórki wbudowują w jej błonę swoje hemaglutyniny. Do komórki takiej adsorbowane są erytrocyty - wygląd jak kiść winogron.
Hemaglutynacja. Jeśli wirus zawiera w osłonce hemaglutyniny to wymieszanie go z erytrocytami spowoduje aglutynację erytrocytów.
Zahamowanie hemadsorbcji. Pożywkę z wirusem powodującym hemadsorbcje miesza się z przeciwciałami przeciw hemaglutyninie. Tą mieszaniną zakaża się nową hodowlę kom. Jeśli nie adsorbują te kom. erytrocytów to znaczy, że p-ciała związały wirus.
Wykrywanie p-cial p-wirusowych.
Zahamowanie hemaglutynacji. Zakażony pacjent wytwarza p-ciała przeciwko hemaglutyninom wirusa. Ich obecność wykazuje się, jeśli surowica pacjenta hamuje hemaglutynację.
IgM - p-ciala IgG anty ludzkiemu IgM są na płytce na którą dodaje się surowice. IgM są przyłączane. Następnie dodaje się odpowiedni antygen i znakuje go wyznakowanymi przeciwciałami. Błędne mogą być testy np. przy reaktywacji zakażenia, lub po podaniu dawki przypominającej szczepionki.
Western blotting.
Rozdziela się białka wirusowe na żelu poliakrylamidowym (elektroforeza), przenosi na papier i tam dodaje surowicę pacjenta. P-ciała wiążą się ze specyficznymi białkami wirusa. Następnie nanosi się p-ciała przeciw ludzkim immunoglobulinom wyznakowane enzymem + substrat reakcji enzymatycznej.
Odczyn wiązania dopełniacza (OWD).
Badana surowicę miesza się z wzorcowym antygenem i dopełniaczem. Jeśli utworzą kompleks to dodane erytrocyty uczulone przeciwciałami nie ulegną lizie (wynik +). Jeśli p-ciała z surowicy nie zwiążą antygenu i dopełniacza to erytrocyty ulegają lizie (wynik -).
Odczyn hemolizy radialnej.
Wirusy przyłącza się do erytrocytów baranich/ludzkich i miesza z płynną agarową. Po zakrzepnięciu wycina się w agarozie dołki i wlewa tam próbkę surowicy. Po nocnej inkubacji wylewa się na powierzchnię roztwór dopełniacza, który powoduje lizę tych krwinek na których powstał kompleks antygen-pciało. Średnica strefy zlizowania odpowiada ilości p-ciał.
* Metody okreslania ilosci wirusow:
1. odczyn hemaglutynacji wirusowej (nieserolog. antygen + antygen)
- [jednostka hemaglutynacji 1/32=32 jednostki] (miano wirusa)
2. odczyn hemadsorpcji (wirus na zalozonej hodowli komorkowej)
- krwinki przyklejaja sie do hodowli komorkowej, na ktorej jest wirus
- [jednostka hemadsorpcji]
3. metoda lysinkowa [pfu/ml]
-stosowana dla wszystkich bakteriofagow
-lysinka powstaje tam gdzie namnaza sie wirus
- PFU jednostka łysinkowa [plaque forming units] na 1 ml
- łysinki są są zlokalizowanymi małymi centrami infekcji spowodowanej lizą kom. lub wystąpieniem CPE w jednowarstwowej hodowli zdrowych kom. Każda łysinka pochodzi od pojedynczego infekcyjnego winionu
- miano infekcyjności: pfu=l.łysinek/(rozcieńczenie x objętość) [1/ml]
4. TCID 50 [tissue culture infective dose] = efekt cytopatyczny w 50% komorek hodowli komorkowej
-górne graniczne rozcieńczenie wirusa, po zakazeniu ktorym w50% hodowli komorek pojawia się CPE
inne:
ID 50 - infekcja i objawy chorobowe u 50% zakazonych obiektów biologicznych (np. zwierzat)
LD 50 - dawka letalna, śmierć 50% zakażonych zwierzat
Wirusy zak.ukł.odd:
EBV -mononukl.zak.
CMV -zesp.mononukleozopod., zap.płuc w uogólnionym noworodków