Metody ilościowego oznaczania drobnoustrojów, Studia - materiały, semestr 4, Mikrobiologia żywności


Metody ilościowego oznaczania drobnoustrojów:

Bezpośrednie:

  1. JTK, NPL - klasyczne oznaczanie ilości

  2. Liczenie komórek w wyskalowanych objętościowo komorach

  3. pomiar elektroniczny

  4. DEFT

  5. HGMF

  6. Cystometria przepływowa

Pośrednie:

  1. oznaczanie biomasy, białka, DNA oraz inny skł. Komórek , lub oznaczanie zawartości płynu pozakomórkowego

  2. oznaczanie ATP

  3. metody wykorzystujące pomiar parametrów elektrycznych

  4. oznaczanie potencjału elektrycznego komórek

  5. oznaczanie testem LAL

UWAGA - to co jest podkreślone to jest z wykładu z zeszłego roku!

Metody identyfikacji drobnoustrojów:

  1. klasyczne

  1. nowe:

- szeregi identyfikacyjne

- nowe podłoża i zestawy

- zestawy immunologiczne

  1. testy ELISA

  2. testy LATEKSOWE

  3. immunomagnetyczna separacja

- metody oparte o budowę DNA i geny

-podłoża umożliwiające jednostopniową lub szybką identyfikację wybranych drobnoustrojów (wykorzystanie fluorescencji)

-identyfikacja genetyczna

  1. sondy genetyczne

  2. metody wykorzystujące PCR

Podłoża dla:

- coli: (ad1)

PCPL do oznaczania grup wskaźnikowych,

BLBVB - bulion laktozowy z żółcią i zielenią brylantową,

podłoże Schuberta,

Fluoroculty Brylla,

- streptokoki: (ad2)

podłoże Rotha,

podłoże Litzky'ego

- clostridium: (ad3)

podłoże Wilsona-Blaira,

agar TSC (tryptose sulfite cycloseine) (tryptoza, siarczyn, cykloseryna)?

- gronkowca: (ad4)

Giolitti-Cautoni (telluryn potasowy, telluryt sodu)

- pleśnie i drożdże: (ad5)

agar ziemniaczany

podłoże z antybiotykami

Sposób przygotowania posiewu na Petrifilm:

-Przygotowanie próbki

/Próbkę rozdrobnić w stomacherze ; w zależności od typu analizy doprowadzić próbę do pH 6,6-7,2 lub 6,5 - 7,2 (1N NaOH lub 1 N HCl)/

-Rozcieńczenie i inokulacja 1 ml lub 5 ml (High-Sensitivy Coliform)

-Rozprowadzenie próbki

/Służy do tego pieczątka z ograniczeniem, ponieważ próba jest naniesiona na środek (lekko docisnąć) … zostawiamy na 3, 4 minuty/

-Inkubacja

/Max 20 w jednym stosie (dla High-Sensitivy Coliform max 10)/

-Odczyt i analiza

Normalnie płytki Petriego układa się po 8 w jednym stosie!

Analiza środowiska:

Uwaga! Po zadaniu próbki na petryfilm trzeba odczekać 3-4 minuty do rozpuszczenie zelu

DEFT - Direct Epifluorescent Filter Technique (EGZAMIN)

DEFT jest kombinacją metody filtracji membranowej (koncentracja mikroorganizmów) z mikroskopią fluorescencyjną (wizualizacje pojedynczych komórek wybarwionych fluorochromami). Metoda bardzo szybka, 30 min, zdecydowanie lepsza od metod wzrostowych.

Tu barwi się DNA lub RNA. Barwienie oranżem akrydyny, barwienie komórek na filtrze.

Uwagi do rysunku:

- oranż akrydyny to barwnik zasadowy - pomarańczowy

- oranż akrydyny + DNA = monommer barwnika /podwójna helisa/ - barwa zielona przy 525 nm

- oranż akrydyny z RNA = polimer barwnika /pojedyńcza helisa/ - barwa czerwona przy 650 nm

Aparat wykorzystuje fakt występowanie epifluorescencji - fluorescencji odbitej.

Metoda szczególnie przydatna przy analizie mleka lub innego roztworu badanego.

PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DLA MLEKA:

  1. 0,5 ml bakteriotrypsyna - enzym umożliwiający wnikniecie barwników do komórki /następuje lekkie uszkodzenie błony komorkowej/

  2. 2 ml Triton X-100 /detergent/ (0,5%);

  3. 2 ml mleka - wszystko mieszać;

  4. Inkubacja 10 minut w łaźni wodnej o temp, 50 C;

  5. filtracja- próbkę dajemy do wieży filtracyjnej w niej są membrany poliwęglanowe, przesączamy próbkę;

  6. barwienie i przemycie membrany, tu dajemy oranż akrydyny (2,5 ml)na membranę !!!nie do probówk;

  7. 2,5 ml buforu pH=3

  8. 2,5 ml izopropanolu - odbarwienie tego co zabarwiło się niepotrzebnie

  9. liczenie drobnoustrojów - membrany umieszczamy pod mikroskopem epifluorescencyjnym i liczymy. Liczenie bakterii o pomarańczowej fluorescencji.

Metody szybkiego oznaczania ilości drobnoustrojów: (EGZAMIN)

C. Charakterystyka biochemiczna i fizjologiczna

C.1. badanie typu energetycznego i oddechowego:

-jeśli akceptorem wodoru i elektronów jest jakiś produkt pośredni - metabolizm fermentacyjny;

-jeśli akceptorem wodoru jest tlen - aerobizm bezwzględny;

-jeśli akceptorem wodoru są azotany, węglowodany, siarczany - anaerobizm bezwzględny;

C.2. badanie metabolizmu cukrowego (badanie utylizacji alkoholi cukrowych):

-sprawdzanie obecności β-galaktozydazy i inwertazy

-sprawdzanie czy drobnoustrój wykorzystuje monocukry, dwucukry czy wielocukry;

C.3. badanie metabolizmu białkowego

C.4. badanie metabolizmu tłuszczowego (wykorzystanie źródeł azotu i tłuszczu jako źródło węgla):

-stosuje się barwnik błękit Viktorii, który rozpuszcza się w tłuszczu - jeżeli drobnoustrój wykorzystuje tłuszcz to barwnik się wytrąca;

- dodatek tłuszczu do podłoża i obserwowanie wzrostu drobnoustrojów;

C.5. badanie ogólnych własności fizjologicznych:

-halofilność do 15%NaCl

-osmofilność do 70% dodatku cukrowego

-określenie zapotrzebowania czynników wzrostowych (zapotrzebowanie na witaminy)

-wrażliwość na antybiotyki\

-optymalna temperatura wzrostu i krytyczna temperatura wzrostu

-zabarwienie drobnoustroju

-pH

1.Metabolizm cukrów

Wykonuje się test na wykorzystanie wielocukrów. Te źródła węgla są aplikowane na podłoże za pomocą testów cuksenograficznych.

  1. Hodowla na podłożu Clark - Lubs'a

- test z czerwienią metylową RM (produkty kwaśne - końcowe produkty metabolizmu)

- test Voges - Proskamer'a VP (produkcja acetony, detekcja acetony)

  1. krążki ONPG (orto-nitro-fenylogalaktozyd)

  1. asymilacja kwasu cytrynowego - podłoże Simmons'a (dla Enterobacteriaceae / Enterobacterium)

2.Metabolizm białek

  1. wykorzystanie makrocząsteczek

  2. wykorzystanie poszczególnych aminokwasów

AD. I. ⇒ wykorzystanie makrocząsteczek (białko jako źródło C i N)

Wykorzystanie kazeiny:

Wykorzystanie żelatyny - (upłynnienie podłoża żelatynowego)/wykorzystanie makrocząsteczek,

AD.II.⇒wykrywanie obecności enzymów białkowych (WAŻNE NA EGZAMIN)

Metoda Kohn'a

- ODC - dekarboksylaza ornityny (do putrescyny)

- LDC - dekarboksylaza lizyny (do kadaweryny)

- ADM - dekarboksylaza argininy (arginaza)

- TDA - dezaminaza tryptofanowa

--PDA - dezaminaza fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego

AD.III.⇒z metabolizmem białkowym wiąże się zdolność do wytwarzania indolu, H2S, NH3 (jako efekt dezaminacji aminokwasów)

- wytwarzanie indolu - na podłożu z peptonem + odczynnik Kovacs'a lub odczynnik Erlich'a

Służy do identyfikacji Escherichia Coli

- wytwarzanie H2S - na podłożu Mossel'a, Kligler'a lub TSI

H2S - powstaje z rozkładu cysteiny i metioniny

- wytwarzanie NH3- na podłożu z peptonem + odczynnik Nessler'a

- wytwarzanie ureazy - na podłożu Ferguson'a, Stuart'a, Christensen'a

Właściwości patogenne bardzo często wynikają z obecności enzymów, mogą być określone przez:

  1. wykrycie obecności enzymów np.

          1. hemolizyny - rozkład krwinek czerwonych α, β, γ;

          2. fosfatazy, esterazy - powodują rozkład ATP w komórce - metody biochemiczne w probówce;

          3. DNA-zy - rozkład kwasów nukleinowych /obecność DNA-zy - badamy na agarze z DNA i po wzroście spryskujemy NaOH i sprawdzamy obecność łysinek/

          4. koagulazy /obecność koagulazy - enzym wytwarzany przez gronkowca złocistego, jego aktywność prowadzi do żelowania krwi. W teście wykorzystujemy plazmę królika/

  1. drugim elementem patogenności jest obecność toksyn (np.botulinowa).

Kiedyś badało się to testami biologicznymi:

- wypreparowane jelita świnki morskiej (podobnie jak myszy)

- test na myszach - wykorzystywany w przypadku obecności toksyny botulinowej. Bierzemy 4 myszy, każdej podajemy próbkę z patogenem, trzem dajemy surowicę. Jeśli jedna zdechnie to świadczy to o obecności toksyny.

Dziś obecność toksyn bada się metodami np. HPLC.

BADANIE WEDŁUG GEN - PROBE

1. liza komórek drobnoustrojowych + odczynniki lizujący (lub sonifikacja)

2. hybrydyzacja (znakowany kwasem RNM)

rRNA + komplementarny DNA - 60min 72ºC

3. separacja

Hybrydy + hydroksyapatyt + wirowanie (adsorbancja hybrydów na powierzchni hydroksyapatytu)

4. odczyt odczynnika znakującego w osadzie hydroksyapatytu (około 2 godziny)

W zależności od tego czym znakujemy, potem odpowiednim przyrządem sprawdzamy wyniki.

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika wynaleziona w 1983 roku przez Kary'ego Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus. Za pracę w tej dziedzinie Kary Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla.

Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery (primery), czyli krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do matrycy, oraz termostabilną polimerazę DNA (może nią być na przykład polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z archeowców Pyrococcus furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje się większą progresywnością niż Taq, jednakże działa wolniej. Dostępne są także inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych). W wyższej temperaturze (zwykle około 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-70°C), przyłączają się one do matrycy. Podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy.

Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2n cząsteczek. W praktyce wydajność jest mniejsza, co nie zmienia faktu, że metoda PCR znajduje wiele zastosowań, m.in. w klonowaniu genów, diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, kryminalistyce, pracach nad gatunkami, które wyginęły.

Stosuje się również modyfikacje metody PCR m.in:

1


Wyszukiwarka