Morfologiczne i biochemiczne metody identyfikacji mikroorganizmów
Małe wymiary komórek mikroorganizmów nie pozwalają na ich obserwację okiem nieuzbrojonym. Do badania morfologii, oceny liczebności czy żywotności drobnoustrojów stosuje się obserwacje mikroskopowe preparatów wykonanych bezpośrednio z materiału badanego lub z hodowli. Przygotowane preparaty można oglądać bezpośrednio pod mikroskopem lub dodatkowo je wybarwić. Celem barwienia jest ułatwienie:
obserwacji cech morfologicznych i diagnostycznych (m.in. kształt, wielkość, wzajemny układ komórek w hodowli, tzn. występowanie komórek pojedynczo lub w różnych układach, obecność otoczek, zdolność ruchu, ilość i rozmieszczenie rzęsek/wici, sposób rozmnażania się - przez podział, tworzenie pączków, zarodników i form przetrwalnych),
liczenia drobnoustrojów (żywych, martwych).
Barwienie drobnoustrojów jest procesem fizykochemicznym, który polega na wniknięciu barwnika do wnętrza komórki i utworzeniu barwnego kompleksu z cytoplazmą. Do barwienia mikroorganizmów najczęściej stosuje się zasadowe barwniki (błękit metylenowy, zieleń malachitowa, fuksyna zasadowa, czerwień obojętna, fiolet krystaliczny, goryczkowy i metylowy), wykorzystując ich powinowactwo do kwaśnej cytoplazmy komórkowej. Rzadziej używane są barwniki kwaśne (fuksyna kwaśna, eozyna, erytrozyna, barwnik Kongo i nigrozyna) lub obojętne mieszaniny barwników kwaśnych i zasadowych (np. barwnik Giemsy).
Rozróżnia się dwie metody barwienia:
progresywna( polega na stosowaniu rozcieńczonych barwników w przeciągu dłuższego czasu-12-24godz.)
regresywna( polega na stosowaniu stężonych barwników przez krótki okres czasu z następującym po nim odbarwieniem)
W zależności od stosowanych barwników, można wyróżnić 3 sposoby barwienia:
barwienie pozytywowe - polegające na zabarwieniu komórek, podczas gdy tło zostaje bezbarwne; może być proste lub złożone,
barwienie negatywowe - uzyskanie kontrastu między ciemnym tłem a nie zabarwionymi komórkami; stosowane jest zwykle do barwienia krętków i otoczek bakterii; wykorzystuje się roztwór nigrozyny, tuszu chińskiego lub cyjanochiny, rozmaz wykonuje się z zawiesiny komórek zmieszanych z barwnikiem, nie utrwala się, tylko od razu po wysuszeniu ogląda pod mikroskopem, może być proste lub złożone,
barwienie pozytywowo-negatywowe - połączenie powyższych metod, najpierw wykonuje się barwienie negatywowe, a po wyschnięciu dobarwia się barwnikiem pozytywowym.
Ze względu na to ilość barwników zastosowanych przy barwieniu, wyróżnia się:
barwienie proste - gdzie używamy jednego roztworu barwnika, barwnik zlewa się, spłukuje wodą, alkoholem lub acetonem i osusza bibułą; stosowane w celu ustalenia kształtu i układu komórek, np. barwienie fioletem krystalicznym lub błękitem metylenowym
barwienie złożone - z użyciem co najmniej 2 roztworów barwników, barwienie albo w ściśle określonej kolejności albo ich mieszaniną; np. barwienie metodą Grama
Metoda Grama barwienia bakterii została opracowana w 1884 roku przez Duńczyka, Hansa Christiana Grama. Pozwala ona doświadczalnie zróżnicować te organizmy na dwie różne grupy (Gram-dodatnie i Gram-ujemne) ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej oraz, co za tym idzie, także pewne różnice w fizjologii i podatności na leki.
Komórki bakteryjne, zarówno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiają się fioletem krystalicznym. Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie granatowe. Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1-2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik. Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są granatowe, zaś Gram-ujemne - bezbarwne. Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) dobarwia, niezbyt mocno, komórki Gram-ujemne, nie zmieniając barwy komórek Gram-dodatnich. W efekcie wyżej przedstawionych działań efekty mogą być następujące: bakterie barwią się na kolor ciemno-fioletowy, prawie czarny, określamy je jako Gram-dodatnie lub bakterie barwią się w kolorze czerwonym, określamy jako Gram-ujemne
Proces barwienia nie jest skomplikowany: na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanosimy bakterie, po dodaniu płynu fizjologicznego wykonujemy rozmaz. Następnie szkiełko z rozmazem pozostawiamy do całkowitego wyschnięcia, po czym preparat utrwalamy przez trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika i ustawiamy go na wanience do barwienia i kolejno stosujemy:
- fiolet krystaliczny 2 min, spłukujemy wodą destylowaną
-płyn Lugola 2 min, spłukujemy wodą destylowaną
-alkohol 30 sek, ponownie spłukujemy
Tak wybarwiony preparat suszymy w bibule filtracyjnej, i po naniesieniu kropelki olejku cedrowego możemy oglądać bakterie pod mikroskopem.
Metody biochemiczne
Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych. Cechy biochemiczne mikroorganizmów określa się na podstawie reakcji chemicznych zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych, wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo:
wzrost lub jego brak
zmiana zabarwienia pożywki
reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem
wytworzenie gazu
W identyfikacji biochemiczne mikroorganizmów stosuje się głownie 2 rodzaje podłoży na nich opierają się testy identyfikujące mikroorganizmy. Są to:
Podłoża specjalne, czyli podłoża z dodatkiem węglowodanów lub innych specyficznych substratów. Służą m.in. do określania cech hodowanych drobnoustrojów np. właściwości fermentacyjnych danego drobnoustroju, lub do wytwarzania specyficznych produktów metabolizmu takich jak: toksyny, antybiotyki itd. Przykładem podłoży specjalnych są pożywki wchodzące w skład tzw. szeregów biochemicznych używanych do identyfikacji bakterii - podłoże Kliglera (określenia zdolności do fermentowania glukozy, laktozy, wytwarzania siarkowodoru oraz rozkładania cukrów z wytworzeniem gazu) , podłoże Stuarta (wykrywanie urezay)
Podłoża wybiórcze, czyli podłoża z dodatkiem takich substancji, które umożliwiają wzrost tylko pewnych określonych gatunków mikroorganizmów, a jednocześnie hamują wzrost innych gatunków. Podłoża te pozwalają na wyizolowanie jednego lub kilku gatunków mikroorganizmów z materiału, w którym znajduje się cała masa drobnoustrojów.
Np. podłoże z dodatkiem fioletu krystalicznego, które umożliwia wzrost tylko bakterii Gram-ujemnych, różne podłoża selektywne do hodowli bakterii zawierające antybiotyki jako składnik selekcjonujący drobnoustroje.
Do podłoży dodawane są barwniki, które zmieniają swoje zabarwienie w zależności od pH podłoża (często jest to błękit bromotymolowy, czerwień fenolowa, purpura bromkokrezolowa i inne).
Przy podłożach wybiórczo-różnicujących zmiana zabarwienia w czasie wzrostu określonego drobnoustroju informuje o określonej właściwości w zależności od danego substratu (np. rozkład laktozy, manitolu itd.)
Podczas laboratoriów z mikrobiologii stosowaliśmy biochemiczne metody identyfikacji. Przy analizie sanitarnej wody wykorzystywaliśmy podłoże Eijkmana oraz podłoże Endo. Przy podłożu Eijkmana w trakcie rozkładu laktozy przez bakterie grupy coli wydzielany jest dwutlenek węgla (zbierający się w rurkach Durham), poza tym pojawia się kwas który zmienia pH podłoża, powodując zmianę jego barwy z zielonej na żółtą. Podłoże Endo jest również selektywne względem bakterii grupy coli. Zawiera ono fuksynę, która ulega redukcji w obecności siarczanu sodu i tworzy bezbarwny związek z laktozą. Wzrost bakterii wykorzystujących laktozę, jako źródło węgla powoduje zakwaszenie podłoża i zabarwienie kolonii ( ciemno czerwone kolonie z charakterystycznym metalicznym pobłyskiem).
Innym sposobem identyfikacji mikroorganizmów niewątpliwie najdokładniejszym i najbardziej uniwersalnym są testy Api
Przykładowy test :
Opis testu API20N
Zestaw do identyfikacji niefermentujących pałeczek Gram-ujemnych nie należących do rodziny Enterobacteriaceae - API 20NE (Nr kat. 20050 firmy, bioMérieux) jest wystandaryzowaną mikrometodą do identyfikacji drobnoustrojów nie należących do Enterobacteriaceae, takich jak: Psudomonas spp., Acinetobacter spp., Flavobacterium spp., Vibrio spp., Aeromonas spp. i inne.
Skład testu
Test API 20NE (bioMérieux) składa się z 20 mikrostudzienek zawierających odwodnione substraty i podłoża tworzące szereg biochemiczny, w skład którego wchodzi 8 testów powszechnie stosowanych, takich jak: redukcja azotanów, wytwarzanie indolu, fermentacja glukozy, dehydrolaza argininy, ureaza, hydroliza eskuliny, hydroliza żelatyny, -galaktozydaza oraz 12 testów asymilacyjnych takich jak: asymilacja glukozy, arabinozy, mannozy, mannitolu, N-acetyloglukozaminy, maltozy, glukonianu, kaprynianu, adypinianu, jabłczanu, cytrynianu, octanu fenylu, które umożliwiają określenie zdolności adaptacji enzymatycznej badanych drobnoustrojów.
Test API 20NE wykonano wg standardowej procedury podanej przez producenta w następujących etapach:
Przygotowanie pasków testu API 20NE.
Przygotowanie badanej zawiesiny bakteryjnej.
Napełnienie pasków testu API 20NE sporządzoną zawiesiną bakteryjną.
Inkubacja testów w temperaturze 30C przez 48 godzin.
Odczyt szeregu biochemicznego po 24 godzinach zgodnie z Tabelą Odczytu (Załącznik 1) oraz zapis wyników na Karcie Wyników.
Dalsza inkubacja testu API 20NE.
Ponowny odczyt wyników reakcji biochemicznych w celu uzyskania 7 - cyfrowego kodu numerycznego, będącego ostateczną identyfikacją gatunkową pałeczek Gram-ujemnych niefermentujących odczytaną z Książki Kodów.
Firma bioMérieux produkuje również Testy do szybkiej identyfikacji są to Testy lateksowe np. :
Slidex Strepto - Kit
Zawiesina uczulonych cząsteczek lateksu do szybkiej identyfikacji paciorkowców b -hemolizujących grup A, B, C, D, F i G.
Slidex PNEUMO-Kit
Zawiesina uczulonych cząstek lateksu do szybkiej identyfikacji Streptococcus pneumoniae.
Wyszukiwarka