Przemysław Kraska gr III

Oznaczanie aktywności β-amylazy metodą Bernfelda.

Wykonanie:

Pobieramy z kolby miarowej 5ml wyciągu słodowego i przenosimy do kolby miarowej na 25ml. Następnie dopełniamy wodą do odpowiedniej objętości i mieszamy.

Do 3 czystych probówek pobieramy po 1ml roztworu skrobi i wstawiamy na 5 minut do łaźni wodnej o temperaturze 30ºC. Po 5 minutach do 2 probówek dodajemy po 1ml wyciągu enzymu z kolby na 25ml i przeprowadzamy reakcję hydrolizy skrobi w ciągu 15 minut w temperaturze 30ºC. Następnie do wszystkich 3 probówek dodajemy po 2ml kwasy 3,5+ dinitrosalicylowego, a do trzeciej probówki dodatkowo 1ml enzymu.

Po dokładnym wymieszaniu wszystkie 3 probówki wstawiamy na do wrzącej łaźni wodnej i gotujemy 10 minut. Po 10 minutach schładzamy i dopełniamy zawartość do 20ml wodą destylowaną. Wartość absorbancji odczytujemy w fotometrze.

Wyniki:

Po pomiarze w fotometrze uzyskałem następujące wyniki:

1-sza probówka 0,093

2-ga probówka 0,087

średnia wynosi 0,090

Mając wynik absorbancji odczytuję z krzywej wzorcowej ilość maltozy: 600μg. Wstawiamy ten wynik do wzoru:

μg x 25ml

345 x 15'

gdzie:

345- masa cząsteczkowa maltozy

15'- czas przebywania w łaźni

μg- wartość odczytana z krzywej wzorcowej

Otrzymany wynik to 2,9 mikrogramola.

Wiemy że w 1000 ml wody jest 3,5g słodu.

Dostałem 2ml roztworu, więc ilość słodu obliczymy z metody krzyżowej:

3,5g - 1000ml

x - 2ml

Wynik to 0,007g

Mając dane wcześniej wyliczone możemy obliczyć ilość mikromoli maltozy/1 minutę:

0,007g - 2,9μg

1g - x

Wynik to 414 mikromola maltozy/1minutę.

Wnioski:

W metodzie Bernfelda wykorzystuje się właściwości redukujące maltozy i innych cukrów, które w środowisku zasadowym redukują grupy nitrowe kwasu 3,5- dinitrosalicylowego do grup aminowych. Powstałe pochodne aminowe mają barwę pomarańczową, której intensywność zależy od ilości w próbie cukrów redukujących uwalnianych podczas działania enzymu, dlatego reakcja ta może stanowić podstawę do ich oznaczania fotometrycznego.

---