1.
Planowano badanie aktywności kompleksów fotosyntetycznych przy użyciu elektrody Clarka, mierzącej zmiany stężenia tlenu w zawiesinie błon tylakoidów. Postanowiono wypróbować następujące związki chemiczne mogące oddziaływać z błonami tylakoidów i kompleksami fotosyntetycznymi:
fenylo-p-benzochinon E +150mV
kwas askorbinowy E +60mV
metyloviologen E -430mV
które z wymienionych związków można użyć jako donorów, a które jako akceptorów elektronów w łańcuchu fotosyntetycznym, jeśli wiadomo, że średni potencjał oksydoredukcyjny dla poszczególnych składowych fotosyntezy wynosi:
dla układu wydzielającego tlen E +820mV
dla Q plastochinonu związanego w PSII, ostatniego akceptora ele w kompleksie PSII E -150mV
dla centrum reakcji PSI E +480mV
dla centrum żelazo-siarkowego, ostatniego akceptora elektronów w kompleksie PSI E - 550mV
2.
Model kinetyki Michealisa- Menten został opracowany dla nieodwracalnej jednosubstratowej reakcji enzymatycznej. Jakie założenia należy przyjąć i w jaki sposób należy wykonać pomiary aby w prawidłowy sposób obliczyć stałe kinetyczne Km i Vmax dla wszystkich czterech reagentów dehydrogenazy mleczanowej (LDH), enzymu katalizującego odwracalną reakcję dwusubstratową. Jakie znaczenie ma w planowaniu doświadczenia ma informacja, że stała deltaG0 dla reakcji
mleczan +NAD+ <==> pirogronian +NADH+H+ deltaG0 = +6
Czy można określić mechanizm katalizowanej reakcji? Odpowiedź szczegółowo uzasadnić.
3.
Na kolumnie chromatograficznej oczyszczano dehydrogenazę mleczanową. W trakcie procedury eluowano z kolumny kolejne frakcje o objętości 1ml. We frakcjach badano aktywność enzymu poprzez pomiar zmian absorbancji przy 340nm. Do kolejnych kuwet zawierających odpowiedni bufor i substraty dodano:
I - 10ul pięciokrotnie rozcieńczonego eluatu nr1
II - 10ul nierozcieńczonego eluatu nr 2
III - 20ul nierozcieńczonego eluatu nr3
Końcowa objętość roztworu w kuwecie wynosiła 2ml
Zmiany absorbancji mierzono co 30sekund od momentu startu reakcji. Milimolowy współczynnik absorbancji dla nukleotydów nikotynoaminoadeninowych wynosi 6,22mM-1 cm-1. W tabeli podano średnie wartości pomiarów absorbancji:
Preparat |
Czas (sekundy) |
0 |
30 |
60 |
90 |
120 |
I |
Absorbancja |
0,6 |
0,4 |
0,2 |
0,1 |
0,05 |
II |
Absorbancja |
0,62 |
0,42 |
0,22 |
0,15 |
0,05 |
III |
Absorbancja |
0,58 |
0,48 |
0,38 |
0,28 |
0,1?.. |
Stężenie białka wyznaczono metodą Bradford w ten sposób, że do probówek zawierających 1,5ml odczynnika Bradford dodano po 10ul:
a) 5x rozcieńczonego eluatu nr 1
b) nierozcieńczonego eluatu nr 2
c) nierozcieńczonego eluatu nr 3
i 90 ul wody. Po 5minutach zmierzono absorbancję przy 595 nm uzyskując wartości absorbancji:
a) 0,3
b) 0,3
c) 0,6
Jednocześnie wyznaczono wg tego samego schematu krzywą wzorcową, uzyskując następujące wartości:
Ilość białka ug |
0 |
6 |
12 |
18 |
24 |
Absorbancja |
0 |
0,2 |
0,4 |
0,7 |
0,78 |
Na podstawie podanych danych obliczyć aktywność całkowitą i właściwą tych eluatów.