Aminotransferazy należą do klasy transferaz. Katalizują one przeniesienie grupy -NH2 razem z protonem i parą elektronów, zwykle z 2-L-aminokwasu, na węgiel karbonylowy 2-oksokwasu. W wyniku powstaje nowy 2-L-aminokwas oraz 2-oksokwasopochodna 2-L-aminokwasu, który był dawcą grupy aminowej. Tego typu reakcja enzymatyczna znana jest pod nazwą transaminacji. W większości reakcje transaminacji są łatwo odwracalne, ponieważ mają stalą równowagi reakcji około 1,0. Istota tych reakcji sprowadza się do zgromadzenia grup aminowych z różnych aminokwasów w formie 2-L-aminokwasu, zwykle kwasu 2-L-glutarninowego. 2-oksoglutaran jest więc wspólnym akceptorem grup aminowych od większości aminokwasów. Utworzony w wyniku transaminacji 2-L-glutaminian kieruje grupy aminowe do określonych szlaków biosyntetycznych lub ciągów reakcji, za pomocą których wytwarzane są końcowe produkty przemian azotowych. Większość aminotransferaz wykazuje wyższą specyficzność w stosunku do 2-oksokwasów jako akceptorów grup aminowych, niż w stosunku do dawców tych grup — 2-L-aminokwasów. Stwierdzono, że jedna aminotransferaza może katalizować kilka różnych reakcji transaminacji, natomiast ta sama para substratów (2-L-aminokwas — 2-oksokwas) często bierze udział w transaminacjach katalizowanych przez różne aminotransferazy. Wszystkie reakcje transaminacji przebiegają zgodnie ze wspólnym mechanizmem i uczestniczy w nich zazwyczaj silnie związany z białkiem enzymu koenzym, pochodna witaminy B6 — 5-fosforan pirydoksalu.

Poszczególne aminotransferazy często występują w komórce w postaci kilku izoenzymów, które mogą być zlokalizowane zarówno w cytosolu, jak i w różnych organellach komórkowych, takich jak plastydy, mitochondria, peroksysomy i glioksysomy. Ważne w biochemii klinicznej są aminotransferazy alaninowa i asparaginianowa. Wyso­ką aktywność tych enzymów w osoczu krwi obserwuje się np. po zawale mięśnia sercowego i w schorzeniach wątroby. Patologicznie wysoka aktywność aminotransferazowa osocza świadczy o uszkodzeniu tkanek i przedostaniu się do krwi enzymów komórkowych. Optimum pH dla większości poznanych aminotransferaz zarówno roślinnych, jak i zwierzęcych jest zawarte na ogół w przedziale 7,0-9,0 w zależności od źródła enzymu, masy cząsteczkowe zaś w granicach 75 000-100 000 Da. Aminotransferaza asparaginianowa, tj. aminotransferaza 2-L-asparaginian: 2-oksogluta-ran, jest najlepiej poznaną aminotransferaza roślin wyższych. Podobnie jak aminotransferaza asparaginianowa pochodzenia zwierzęcego enzym ten przejawia najwyższą aktywność w stosunku do pary substratów 2-L-asparaginian: 2-oksoglutaran. Przebieg reakcji t z udziałem tych związków przedstawiono poniżej:

Aminotransferaza asparaginianowa pełni ważne funkcje w metabolizmie roślin, gdyż uczestniczy w przemianach aminokwasów, w wewnątrzkomórkowym systemie wahadłowym przenoszącym wodory pomiędzy cytosolem a chloroplastami czy peroksysomami, w mię­dzykomórkowym transporcie metabolitów w procesie tzw. fotosyntezy typu C4. Pełniąc tak wiele funkcji, enzym ten występuje w różnych frakcjach tkankowych i subkomórkowych roślin. Na przykład, w liściach szpinaku wykryto 4 izoenzymy tej aminotransferazy, a każdy z nich pochodził z innej frakcji komórkowej: cytosolu, chloroplastów, mitochondriów i peroksysomów.

Do oznaczania aktywności aminotransferazy asparaginianowej wykorzystuje się liczne metody:

a) chromatografię bibułową substratów lub produktów po inkubacji z enzymem,

b) manometryczne oznaczanie CO2 uwalnianego przy udziale dekarboksylazy glutami-nianowej z wytworzonego w reakcji L-glutaminianu,

c) spektrofotometryczne oznaczanie przy 280 nm powstającego szczawiooctanu,

d) spektrofotomeryczne oznaczanie szybkości powstawania szczawiooctanu w czasie reakcji transaminacji z zastosowaniem NADH + H+ i dehydrogenazyjabłczanowej,

e) spektrofotometryczne oznaczanie szczawiooctanu i pirogronianu powstałego w wyni­ku samorzutnej dekarboksylacji szczawiooctanu po zatrzymaniu reakcji transaminacji z zastosowaniem NADH + H i dwóch dehydrogenaz: jabłczanowej i mleczanowej,

f) pomiar absorbancji światła przez barwne produkty reakcji szczawiooctanu i pirogro­nianu z 2,4-dinitrofenyIohydrazyną.

Dwie ostatnie metody będą stosowane do oznaczania aktywności aminotransferazy asparaginianowej w wyciągu z siewek pszenicy.

a. Spektrofotometryczna metoda oznaczania aktywności aminotransferazy aspa­raginianowej

Zasada metody. Za miarę aktywności aminotransferazy asparaginianowej przyjęto ilość utworzonego szczawiooctanu i powstałego w wyniku samorzutnej dekarboksylacji części szczawiooctanu — pirogronianu. Związki te oznacza się po zatrzymaniu reakcji transaminacji na podstawie dwóch reakcji enzymatycznych z udziałem dodatkowo dodanych dehydrogenaz jabiczanowej i mleczanowej oraz NADH + H+:

W warunkach ćwiczenia równowaga obu tych reakcji jest przesunięta w prawo i przy nadmiarze NADH + H+ przebiegają one do momentu zużycia substratów 2-oksokwasowych. NADH + H+ wykazuje silną absorbancję przy 340 nm wskutek obecności układu dihydropiry-iyny. Z chwilą gdy układ ten ulegnie utlenieniu, absorbancja zanika. Spadek absorbancji przy 340 nm (próby pełne) w stosunku do absorbancji wyjściowej (próby materiałowe) świadczy o ilości zużytego NADH + H+ i jest proporcjonalny do stężenia szczawiooctanu i pirogronianu.Reakcję transaminacji prowadzi się przy nadmiarze substratów w temperaturze 30°C w buforze fosforanowym pH 7,4 przez 30 min.

Cykl azotu

Cyklem azotu nazywamy przemieszczanie się azotu przez łańcuch pokar­mowy żywych organizmów (rys. 1). Ten złożony cykl obejmuje bakterie, rośliny i zwierzęta. Wszystkie organizmy mogą wbudowywać amoniak. (NH3) do organicznych związków azotowych, czyli związków zawie­rających wiązania C-Ń. Jednak tylko niewiele mikroorganizmów potrafi syntetyzować amoniak z azotu atmosferycznego (N2). Pomimo że azot gazowy stanowi około 80% atmosfery ziemskiej, jest on zupełnie nie­aktywny chemicznie. Pierwszym etapem w cyklu azotu jest redukcja gazowego N2 do amoniaku w procesie nazywanym wiązaniem azotu. Amomiak powstaje również przez redukcje jonu azotanowego (NO3-) obecnego w glebie. Redukcja azotanów jest prowadzona przez większość roślin i mikroorganizmów. Amoniak powstały w tych dwóch procesach może być następnie włączany przez wszystkie organizmy. W biosferze występuje równowaga między nieorganicznymi i organicznymi formami azotu. Przemiana azotu organicznego w nieorganiczny zachodzi w dro­dze przemian katabolicznych, denitryfikacji i rozkładu

Wiązanie azotu

Proces przemiany azotu atmosferycznego w amoniak (wiązanie azotu) jest przeprowadzany tylko przez niewiele mikroorganizmów, nazywa­nych diazotrofami. Są nimi niektóre wolno żyjące bakterie glebowe, jak Klebsiella i Azotobacter, cyjanobakterie (sinice) i bakterie symbiotyczne (głównie Rhizobium). Symbiotyczne bakterie Rhizobium dokonują inwazji korzeni roślin motylkowatych (m.in. groch, fasola, koniczyna, lucerna) tworzą brodawki korzeniowe, w których zachodzi wiązanie azotu. Ilość Nawiązanego przez te diazotroficzne mikroorganizmy wynosi rocznie około 1011 kg, co stanowi około 60% bieżąco związanego azotu na Ziemi. Wyładowania atmosferyczne i promieniowanie ultrafioletowe wiążą kolejne 15%, a pozostała część pochodzi z procesów przemysłowych. Brak chemicznej reaktywności wiązania N= N jest wyraźnie widoczny na tle warunków przemysłowego proces wiązania azotu. Proces ten, przeprowadzony w 1910 roku przez Fritza Habera i jeszcze nadal stoso­wany w fabrykach nawozów sztucznych, polega na reakcji N2 w obecności H2 z udziałem katalizatora żelazowego w temperaturze 500°C i pod ciś­nieniem 300 atmosfer.

Kompleks nitrogenazy

Biologiczne wiązanie azotu jest przeprowadzane przez kompleks nitro genazy który składa się z dwóch białek: reduktazy, dostarczającej elektrony o dużym potencjale redukcyjnym, i nitrogenazy, która wykorzystuje te elektrony do redukcji N2 do NH3 (rys. 2). Reduktaza jest dimerem identycznych podjednostek o masie 64 kDa, zawiera jedno ugrupowanie żelzo-siarkowe i dwa miejsca wiążące ATP. Nitrogenaza jest dużym białkiem o masie 220 kDa, składa się z dwóch podjednostek a i dwóch B (a2B2) oraz zawiera kompleks żelazo-molibdenowy. Transport elektronów od reduktazy do nitrogenazy jest sprzężony z hydrolizą ATP, prowadzoną przez reduktazę. Chociaż redukcja N2 do NH3 jest procesem w którym bierze udział tylko 6 elektronów reduktaza nie działa perfekcyjnie i powstaje także H2. Dlatego potrzebne są jeszcze dwa elektrony. Osiem elektronów o dużym potencjale pochodzi ze zredukowanej ferrodoksyny, która jest wytwarzana w wyniku działania fotosystemu I w chloroplastach, albo w oksydacyjnym transporcie elektronów. Sumaryczna reakcja biologicznego wiązania azotu ukazuje że jest to proces bardzo kosztowny pod względem energetycznym, w którym hydrolizie ulega co najmniej 16cząsteczek ATP.

Leghemoglobina

Kompleks nitrogenazy jest niezwykle wrażliwy na inaktywację przez O2, enzym ten musi" więc być chroniony przed tym reaktywnym gazem. W brodawkach korzeniowych roślin motylkowatych ochronę tę zapewnia symbiotyczna synteza leghemoglobiny. Część globinowa tego monomerycznego białka wiążącego tlen jest syntetyzowana przez roślinę, zaś hem jest wytwarzany przez Rhizobium. Leg-hemoglobina ma bardzo duże powinowactwo do O2, utrzymuje więc wystarczająco małe jego stężenie, chroniąc nitrogenazę.

Asymilacja azotu

Następnym etapem w cyklu azotu jest asymilacja nieorganicznego azotu w postaci amoniaku do związków organicznych zawierających azot. Wszystkie organizmy włączają amoniak w dwóch głównych reakcjach,

katalizowanych przez dehydrogenazę glutaminianową i syntetazę glutaminową, z utworzeniem aminokwasów, odpowiednio: glutaminianu(Glu) i glutaminy (Gin). Azot aminowy w Glu i azot amidowy w Gin są

następnie używane w kolejnych reakcjach biosyntetycznych prowadzących do utworzenia nowych związków.

Dehydrogenaza glutaminianowa

Dehydrogenaza glutaminianowa katalizuje redukcyjną aminację a-ketoglutaranu, pośredniego metabolitu cyklu kwasu cytrynowego. Dehydrogenaza ta działa zarówno z NAD, jak i z NADP. Enzym ten bierze również udział w katabolizmie aminokwasów.

Syntetaza glutaminowa

Syntetaza glutaminowa katalizuje włączanie amoniaku do glutaminy, zużywając energie z hydrolizy ATP. Enzym ten jest nazywany syntetaza, a nie syntazą, ponieważ reakcja utworzenia wiązania połączona jest z hydroliza ATP. W przeciwieństwie do tego syntaza nie wymaga ATP.

MEABOLIZM AMINOKWASÓW

Biosynteza aminokwasów

Rośliny i mikroorganizmy mogą syntetyzować wszystkie spośród 20poj-stawowych aminokwasów. Ssaki natomiast nie mogą syntetyzować nie­których 2 nich, muszą więc otrzymywać je w pożywieniu. Aminokwas, które muszą być dostarczane w pokarmach, nazywamy egzogennymi (niezbędnymi), natomiast pozostałe, które mogą być syntetyzowane w organizmie, określamy jako endogenne. Terminy te odnoszą się do potrzeb organizmu w określonych warunkach. Dla człowieka aminokwa­sami endogennymi są: Ala, Arg, Asa Asp, Cys, Glu, Gln, GIy, Pro, Ser i Tyr, a egzogennymi — His, Ile, Leu, Lys, Met Phe, Thr, Trp i Val. Szlaki biosyntezy aminokwasów są rozmaite i często są różne u różnych organiz­mów, jednak wszystkie aminokwasy mają ważną wspólną cechę: ich szkielet węglowy pochodzi z kluczowych metabolitów pośrednich w głównych szlakach metabolicznych, jakimi są: glikoliza, cykl kwasu cytrynowego i szlak pentozofosforanowy. Aminokwasy można podzielić na sześć rodzin biosyntetycznych, w zależności od metabolitu pośredniego, z którego się. Grupa a-aminowa pochodzi zwykle z transaminacji glutaminianu.

Rozkład aminokwasów

Ponieważ aminokwasy nie mogą być magazynowane, a białka stale ule­gają odnowie, dlatego aminokwasy będące w nadmiarze są ciągle roz-klaciaee- Najpierw jest odłączana grupa a-aminowa, a pozostały szkielet węglowy jest przekształcany do jednego lub kilku głównych metabolitów pośreclnich i używany jako paliwo metaboliczne. Szkielet węglowy 20 podstawowych aminokwasów jest kierowany tylko do siedmiu cząsteczek pirogronianu, acetylo-CoA, acetoacetylo-CoA, a-ketoglutaranu, bursztynyto-CoA, fumaranu i szczawiooctanu (rys. 2). Aminokwasy roz­kładane do pirogronianu, a-ketoglutaranu, bursztynylo-CoA, fumaranu i szczawiooctanu są nazywane glukogennymi, ponieważ mogą brać udział w syntezie glukozy. Jest to możliwe, ponieważ metabolity cyklu kwasu cytrynowego i pirogronian mogą być przekształcane w fosfoenolo-pirogronian, a następnie w glukozę w procesie glukoneogenezy (patrz tematy J4 i LI), Natomiast aminokwasy rozkładane do acetylo-CoA albo acetoacetylo-CoA nazywamy ketogennymi, ponieważ biorą udział w powstawaniu ciał ketonowych (patrz temat K2). AcetyloCoA oraz acetoacetylo-CoA biorą również udział w syntezie tłuszczów. Spośród zestawu 20 podstawowych aminokwasów tylko Leu i Lys są wyłącznie ketogenne. Ile,Phe, Trp i Tyr są zarówno ketogenne jak i glukogenne. , ponieważ niektóre atomy węgla mogą się znaleźć w acetylo-CoA lub acetoacetylo-CoA, podczas gdy inne przechodzą do prekursorów glukozy. Pozostałe 14 aminokwasów są związkami wyłącznie glukogennymi.

Transaminacji

Zanim szkielet węglowy aminokwasów zostanie przekształcony do głównych metabolitów pośrednich, grupa a-aminowa musi zostać od­łączona w procesie transaminacji. W procesie tym grupy a-aminowe większości aminokwasów są przenoszone na a-ketoglutaran, co prowadzi do powstania glutaminianu i odpowiedniego a-ketokwasu:

a-aminokwas + a-ketoglutaran <-----> a-ketokwas + glutaminian

Enzymy katalizujące te reakcje są nazywane aminotransferazami (transaminazami) i u ssaków występują głównie w wątrobie. Na przykład, aminotransferaza asparaginianowa katalizuje przemieszczanie grupy aminowej z asparaginianu na a-ketoglutaran (rys. 3a), podczas gdy amino-transferaza alaninowa katalizuje przeniesienie grupy aminowej z alaniny na a-ketoglutaran (rys. 3b).

Fosforan pirydoksału

Koenzymem (grupą prostetyczną) wszystkich aminotransferaz jest fosforan pirydoksalu

pochodna pirydoksyny (witamina B6), ulegający podczas transaminacji

przejściowemu przekształceniu w fosforąn pirydoksyaminy. Przy braku substratu grupa aldehydowa tworzy kowalen­cyjne połączenie typu zasady Schiffa (wiązanie iminowe) z grupą ami­nową łańcucha bocznego określonej reszty lizyny w centrum aktywnym enzymu. Po dodaniu substratu grupa a-aminowa wchodzącego amino­kwasu wypiera grupę aminową lizyny w centrum aktywnym i powstaje nowe połącznie typu zasady Schiffa z aminokwasem będącym substra-tem. Aminokwas tworzący z fosforanem pirydoksalu zasadę Schiffa pozostaje ściśle związany z enzvmem przez liczne oddziaływania niekowalencyjne. Aminokwas jest następnie hydrolizowany i powstaje a-ketokwas oraz fosforan pirydoksaminy, grupa a-aminowa jest chwilowo przenoszona z aminokwasu na fosforan pirydoksału. Etapy te stanowią połowę całkowitej reakcji transaininacji. Druga część jest odwróceniem powyż­szych reakcji. Drugi a-ketokwas reaguje z fosforanem pirydoksaminy, co prowadzi do powstania drugiego aminokwasu i regeneracji kompleksu enzym-fosforan pirydoksału.

Reakcje katalizowane przez aminotransferazy są „anergiczne" ponieważ nie wymagają udziału energii metabolicznej. są one również całkowi eie odwracalne, a kierunek reakcji zależy od względnego stężenia par ami-nokwas-ketokwas. Fosforan pirydoksalu jest koenzymem nie tylko w reakcjach transaminacji, lecz także w wielu innych przemianach amino­kwasów, takich jak dekarboksylacje, deaminacje, racemizacje i rozszcze­pienia aldolowe.

Oksydacyjna deaminacja glutaminianu

Grupy a-aminowe, które byty kierowane do glutaminianu z innych ami­nokwasów, są następnie przekształcane w amoniak pod wpływem dzia-łania dehydrogenazy glutaminianowej. Niezwykłość tego enzymu polega na tym, że działa zarówno z NAD+, jak i z N ADP+ w biosyntezie glutaminianu koenzymem jest NADP+, nato­miast podczas rozkładu tego aminokwasu działa NAD+. Dehydrogenaza glutaminianowa składa się z sześciu identycznych podjednostek i podlega regulacji allosterycznej. Jej inhibitorami allosterycz-nymi są GTP i ATP natomiast GDP i ĄDP są aktywatorami allosterycz-nymi. Kiedy więc stan energrtyczny komórki jest niski(tzn.kiedy jest więcej ADP i GDP niż ich form trifosforanowych), dehydrogenaza glutaminianowi jest aktywowana i zwiększa się utlenianie aminokwasów. Powstające szkielety węglowe są zużywane następnie jako paliwo metaboliczne, wchodząc do cyklu kwasu cytrynowego i w końcu uwalniając energię podczas fosforylacji oksydacyjnej.

Oksydazy aminokwasów

Głównym szlakiem deaminacji aminokwasów jest transaminacja zacho­dząca przez oksydacyjną deaminację glutaminianu. Istnieje także szlak drugorzędny, w którym aminokwasy są utleniane bezpośrednio przez oksydazę L-aminokwasów. Koenzymem tej oksydazy jest mononu-kleotyd flawinowy (FMN), ulegający redukcji do FMNH2 i ponownie utleniany molekularnym O2 w procesie, w którym powstaje również toksyczny H2O2. H2O2 jest unieszkodliwiany przez katalazę, która go rozkłada. W nerkach i wątrobie występuje również oksydaza D-aminokwasów, zależna od FAD. Jednak­że funkcja tego enzymu u zwierząt jest niejasna, ponieważ izomery D-aminokwasów rzadko występują w przyrodzie; spotyka się je tylko w ścia­nach komórek bakterii.

Metabolizm fenyloalaniny

Fenyloalanina ulega hydroksylacji przez hydroksylazę fenyloalartinową i przecho­dzi w inny aromatyczny aminokwas, tyrozynę Koenzymem w tej reakcji jest zredukowana tetrahydrobiopteryna, która jest utleniana do dihydrobiopteryny. Hydroksylaza fenyloalaninowa jest monooksygenazą, ponieważ jeden z atomów O2 pojawia się w produkcie, a drugi w H2O. Tyrozyna ulega następnie transaminacji do p-hydroksyfenylopi-rogronianu. który jest przekształcany do homogentyzynianu przez hydroksylazę p-hydroksyfenylopirogronianową. Ta hydroksylaza jest dioksygenazą, ponieważ obydwa atomy O2 włącza do produktu. Homogentyzynian jest następnie rozszczepiany przez oksygenazę homogentyzyiuanową, inną dioksygenazę, zanim w końcowej reakcji powstaną fumaran i acetooctan, Fumaran może zostać włączony do cyklu kwasu cytrynowego, natomiast acetooctan może zostać użyty do syntezy ciał ketonowych. Tak więc fenyloalanina i tyro­zyna są zarówno glukogenne, jak i ketogenne.

Wrodzone wady metabolizmu

Znane są dwie wrodzone wady metabolizmu wpływające na przemiany fenyloalaniny. Są to dziedziczne zaburzenia metabolizmu, spowodo­wane brakiem jednego z enzymów tego szlaku, jednym z tych zaburzeń jest alkaptonuria, wywołana brakiem oksygenazy homogentyzyniano-wej. Wynikiem tego jest nagromadzanie się homogentyzynianu, który jest następnie wydalany z moczem i który pod działaniem powietrza utlenia się, zmieniając barwę na czarną. Defekt ten jest nieszkodliwy, w przeci­wieństwie do innego zaburzenia, fenyloketonurii. W fenyloketonurii występuje zablokowanie hydroksylacji fenyloalaniny do tyrozyny, spo­wodowane brakiem lub niedoborem hydroksylazy fenyloalaninowej, albo, co zdarza się rzadziej, jej koenzymu — tetrahydrobiopteryny. Rezul­tatem tego jest 20-krotny wzrost poziomu fenyloalaniny we krwi, połączony z następującą potem jej transaminacją do fenylopirogronianu. Jeśli chory nie jest leczony, grozi mu poważne upośledzenie umysłowe, średnia wieku chorego nie przekracza 20 lat. Choroba ta występuje z czę­stością 1:20 000 i na jej obecność badane są wszystkie noworodki. Leczenie polega na zmniejszaniu ilości fenyloaianiny przyjmowanej w pokarmach (ustalenie odpowiedniej diety ubogiej w fenyloalaninę), co pozwala ograniczyć do minimum potrzebę metabolizowania jej nadmiaru. Orga­nizm musi jednak otrzymywać wystarczającą ilość fenyloalaniny, która jest potrzebna do jego wzrostu i wymiany w białkach.

CYKL MOCZNIKOWY

Wydalanie amoniaku

Związki zawierające azot nie mogą być magazynowane tak jak węglowo­dany (glikogen) czy lipidy (triacyloglicerole). Tak więc azot przyjmowany w nadmiarze w stosunku do potrzeb organizmu jest wydalany. Nadmiar azotu jest przekształcany w amoniak, a następnie wydalany przez żywe organizmy jednym z trzech sposobów. Wiele zwierząt wodnych wydala amoniak bezpośrednio do otaczającej wody. Ptaki i gady lądowe wydalają amoniak w postaci kwasu moczowego, natomiast większość kręgowców lądowych przed wydaleniem prze­kształca amoniak w mocznik. Te trzy klasy organizmów określamy odpo­wiednio jako: amonoteliczne, urykoteliczne i ureoteliczne.

Cykl mocznikowy

Mocznik jest syntetyzowany w wątrobie w cyklu mocznikowym. Następ­nie jest wydzielany do krwiobiegu, filtrowany przez nerki i wydalany z moczem. Cykl mocznikowy był pierwszym cyklicznym szlakiem meta­bolicznym odkrytym przez Hansa Krebsa i Kurta Henseleiła w 1932 roku, 5 lat przed wyjaśnieniem przez Krebsa cyklu kwasu cytrynowego. Oto sumaryczna reakcja cyklu mocznikowego:

NH4+ + HCO3- + H2O+3ATP+asparaginianmocznik+2ADP+AMP+2Pi+PPi+fumaran

Jeden z atomów azotu w moczniku pochodzi z amoniaku, drugi jest. przeniesiony z aminokwasu — asparaginianu, natomiast, atom węgla pochodzi z CO2. Ornityna, aminokwas, który nie należy do 20 podstawo­wych aminokwasów i którv nie występuje w białkach, jest przenośnikiem. atomów azotu i węgla. Cykl mocznikowy skfada się z pięciu reakcji enzy­matycznych, z których pierwsze dwie są umiejscowione w mitochondriach , a kolejne trzy w cytozolu;

1. Syntetaza karbamoilofosforanowa, która właściwie nie należy do cyklu mocznikowego, katalizuje aktywację i kondensacje amoniaku (pochodzącego z oksydacyjnej deaminacji glutaminianu przez dehy drogenazę glutammianową z CO2 (w postaci wodoro węglanu HCO3-), prowadzącą do utworzenia karbamoilofosforanu. Hydroliza dwóch cząsteczek ATP sprawia, że reakcja ta jest praktycz­nie nieodwracalna.

2. Druga reakcja zachodzi również w mitochondriach i polega na prze­niesieniu grupy karbamoilowej z karbamoilofosforanu na ornityne przez karbamoilotransferazę ornitynową. W reakcji tej powstaje inny, również nie należący do podstawowych, aminokwas cytrulina, która jest następnie transportowana z mitochondrium do cytozolu, gdzie zachodzą pozostaje reakcje cykJu.

3. Cytrulina ulega następnie kondensacji z asparaginianem, z którego pochodzi drugi atom azotu w moczniku, do argininobursztynianu w reakcji katalizowanej przez syntetazę argininobursztynianową. Reakqa ta przebiega dzięki hydrolizie ATP do AMP i PPi oraz za-chodzącej potem hydrolizie pirofosforanu. Tak więc obydwa wiązania wysokoenergetyczne w ATP są ostatecznie rozszczepione.

4. Liaza argininobursztynianowa usuwa następnie szkielet węglowy asparaginianu z argininobursztynianu w postaci fumaranu, pozosta­wiając atom azotu w drugim produkcie — argininie. Ponieważ arginina powstaje w cyklu mocznikowym, w organizmach ureotelicznych jest zaliczana do związków endogennych. Arginina jest bezpośrednim prekursorem mocznika.

5. Mocznik powstaje z argininy w reakcji katalizowanej przez arginazę, z równoczesną regeneracją ornityny. Ornityna jest następnie transpor­towana z powrotem do mitochondrium i może znowu przyłączyć kolejną cząsteczkę karbamoilofosforanu.

Połączenie z CKC

Synteza fumaranu przez liazę argininobursztynianową łączy cykl mocznikowy z cyklem kwasu cytrynowego. Fumaran jest metabolitem pośrednim tego ostatniego cyklu, w którym po uwodnieniu tworzy jabłczan, utleniany dalej do szczawiooctanu.

Szczawiooctan może ulegać kilku przemianom:

• transaminacji do asparaginianu, który może następnie powrócić do cyklu mocznikowego;

• kondensacji z acetylo-CoA do cytrynianu, który dalej ulega prze­kształceniom w cyklu kwasu cytrynowego;

• przekształceniu w glukozę podczas glukoneogenezy;

• przekształceniu w pirogronian.

Hiperamonemia

Dlaczego organizmy muszą natychmiast usuwać amoniak? Odpowiedź na to pytanie jest oczywista, jeśli weźmiemy pod uwagę powstanie blokady w cyklu mocznikowym, spowodowanej przez wadliwy enzym. Blokada jakiegokolwiek enzymu cyklu mocznikowego prowadzi do zwiększenia ilości amoniaku we krwi, co nazywamy hiperamonemi. Najczęstszą przyczyną tej blokady jest wada genetyczna, ujawniająca się zaraz po urodzeniu. Chory noworodek jest ospały i często wymiotuje. Jeśli niemowlę nie jest leczone, prowadzi to do śpiączki i nieodwracal­nego uszkodzenia mózgu. Przyczyny tego nie są poznane do końca, być może dzieje się tak dlatego, że nadmiar amoniaku prowadzi do zwię­kszonego wytwarzania glutaminianu i glutaminy (rys. 3) {patrz temat Ml). Reakcje te powodują zmniejszenie ilości a-ketoglutaranu, metabo­litu pośredniego cyklu kwasu cytrynowego, co może następnie zmniej­szyć wytwarzanie energii, zwłaszcza w mózgu. Prowadzi to takie do zwiększenia ilości kwasowego aminokwasu — giutaminianu i jego ami­dowej pochodnej — glutaminy, które mogą bezpośrednio spowodować uszkodzenie mózgu

Powstawanie fosforanu kreatyny

Cykl mocznikowy jest także punktem wyjścia do syntezy innego ważnego metabolitu — fosforanu kreatyny. Ten fosfagen jest rezerwuarem grupy fosforanowej o wysokim potencjale w komórkach mięśniowych, ponie­waż energia uwolniona podczas jego hydrolizy jest większa niż energia uwolniona podczas hydrolizy ATP (AG hydrolizy fosforanu kreatyny = -43,1 kj mol-1 w porównaniu z -303 kj mol"1 dla ATP). Pierwszym etapem wytwarzania fosforanu kreatyny jest kondensacja argininy i glicyny, prowadząca do powstania guanidynooctanu (rys. 4). W reakcji tej uwalniana jest ornityna, która może być ponownie wykorzy­stana w cyklu mocznikowym. Guanidynooctan ulega następnie metylacji przez S-adenozylometioninę, donora grup metylowych, a powstająca w ten sposób kreatyna ulega fosforylacji przez kinazę kreatynową i prze­kształca się w fosforan kreatyny

Cykl aktywnego metylenu

S-adenozylometionina jest donorem grup metylowych w licznych reak-qach biologicznych fnp. w powstawaniu fosforanu kreatyny (patrz wyżej) i w syntezie kwasów nukleinowych). Powstaje ona w cyklu aktywnego metylu (n/s. 5). Podczas oddawania grupy metylowej na inny związek, S-adenozylometionina przekształca się w S-adenozylohomocysteinę. Aby S-adenozylometionina została zregenerowana, grupa adenozylowa z S-adenozylohomocysteiny zostaje odłączona i powstaje homocysteina. Jest ona następnie metylowana przez mery Iotransfera zę homocysteinową, jeden z dwóch zawierających witaminę B,2 enzymów występujących u eukariotów. Powstała metionina jest następnie aktywowana do Ś-adeno-zylometioniny z uwolnieniem wszystkich trzech grup fosforanowych z ATP.

Kwas moczowy

Kwas moczowy (rys. 6) jest głównym azotowym produktem ubocznym organizmów urykotelicznych (gady, ptaki i owady), ale powstaje również w organizmach ureotelicznych w wyniku rozkładu zasad purynowych pochodzących z DNA i RNA. W surowicy niektó­rych osobników występuje wysoki poziom moczanu sodu (najczęstszej formy kwasu moczowego w obojętnym pH), co może prowadzić do odkładania krysztaiów tego związku w stawach i nerkach. Choroba ta jest znana jako dna moczanowa, typ artretyzmu, charakteryzujący się silnym bólem odczuwanym w stawach.

Mioglobina bialko globularne, masa 17,8kDa, posiada pojedynczy łan polipeptydowy.on zaś zawiera 153 aminokwasów. Czasteczka ta jest scisle upakowana. Reszty aminokwasów hydrofobowych skierowane SA SA jej wnętrza a reszty aminokwasów polarnych znajduje się na powierzchni . Czasteczka ta zbudowana jest z 8 alfa helis. Jest także prostetyczna grupa hemowa- jednostka niepeptydowa polaczona z mioglobina niekowalnecyjnie. Jej rola to wiązanie tlenu.

Hemoglobina białko które przenosi tlen z płuc do tkanek ciała. Przebiega fosforyzacja oksydacyjna. Zbudowana jest z : 4 lańcuchów polipeptydowyh- są upakowane scisle i powiązane SA . HbA zbudow jest z 2 łań alfa złożonego z 141 aminokwasów aminokwasów i łan. beta (146). Łańcuchy te tworza 8 alfa helis+ prostetyczna grupa hemowa. Hemoglobina wiąze 4 czasteczki tlenu.

Hem -bierze udział w pr pozyskiwania energii podczas oddychania Zbudowane są z 4 pierscieni pirogowych z centralnie związanym atomem metalu Fe; jest to różnorodna grupa barwników tetrapirolowych, wystepują jako grupy prostetyczne hemoglobiny i mioglobiny, również cytochromów. Niektóre enzymy katalizy i peroksydazy zawierają hem. Tu funkcja hemu jest wiązanie i uwalnianie ligania do centralnego atomu Fe lub z niego lub uwalnianie i przyjmowanie elektronów w reakcjach redoks.

Nośniki łańcucha oddechowego- kompleksy

Łańcuch oddechowy obejmuje 3 kompleksy białkowe zanurzone w blonie mitochondrialnej

Dehydrogenaza NADH (kompleks 1) składa się z 30 polipeptydów. Wiąże NADH i utlenia do NAD+ odbierając 2 elektorny. Które przechodzą do grupy prostetycznej FMN i tworzy FMNH2. Każdy z elektornów odbierany jest z jonem H+, SA przyłączone 2 e i 2 H+. Elektorny przenoszone SA do centrów Fe-S. Jest kilka typów tych centrów. Fe i S związane SA koordynacyjnie. Fe3+ utl przechodzi do Fe2+ zredukow. Gdy elektron przejdzie do nastepnego przenośnika elektornów, atom Fe w centrum Fe-S powraca do Fe2+.

Kompleks cytochromów bc1 (reduktaza cytochromowa, kompleks 3) w skład wchodzą: cytochron b i c1 i białko Fe-S. Cytochromy zawieraja atom Fe w swej grupie hemowej. Cytochromy przenosza elektrony. Atom Fe 3+ przechodzi do Fe2+ przyjmując elektron. Przenoszą one tylko 1 elektron. Transport elektornów jest skomplikowany.

Oksydaza cytochromowa -kompleks 4 zawiera 2 cytochromy a i a3. a- stanowi pare z atomem miedzy CuA, a a3- CuB. Atomy Fe3+ przechodza w Fe2+. Cu u zaś z 2+ do +. Reakcja katalizowana jest przez oksydaze cutochromową i zachodzi tu przeniesienie 4 elektornow z 4 cząsteczek cytochromu c oraz 4 jonów H= do tlenu cząsteczkowego i powstanie 2 H20.

Wiązanie azotu azot atm przemieniany jest w amoniak. Przeprowadzane przez mikroorganizmy diazotrofy azotobacter, Clostridium, cjanobakteriei bakt symbiotyczne. Bakt symbiotyczne dokonuja inwazji korzeni rosl motylkowatych motylkowatych tworza brodawki korzeniowe. Tam zachodzi wiązanie azotu. Wiązą one 10 ¹¹ kg N. Wiazanie azotu przeprowadzany jest przez kompleks nitrogenazy zbudowany z reduktazy i nitrogenazy. Reduktaza to diner, ma mase 64kDa i 2 miejsca wiąząze ATP. Nitrogenaza to białko sklada się z 2 podjedn alba i 2 beta+ Fe-S. Zawiera tez komp. żelazo-molibdenowy. Reduktaza prowadzi pr hydrolizy ATP:

N2 + 6e- + 6H+ --- 2 NH3

N2+ 8e- + 8H+ --- 2 NH3 + H2 8 elektronow pochodzi z zredukowanej ferredoksyny.

N2+ 8e+ 16ATP+16H20 ---2 NH3+ h2+ 16 ATP+ 16 Pi+ 8H+

Leghemoglobina jest syntetyzowana w brodawkach korzeniowych gdyz kompleks nitrogenazy jest wrażliwy na inaktywacje tlenem. Część globinowa tego białka wiążącego tlen jest syntetyzowana przez roślinę, zaś hem wytwarzany jest przez Rhizobium. Leghemoglibina utrzymuje małe stężenie tlenu, chroniąc nitrogenaze.

Asymilacja azotu asymilacja nieorganicznego azotu w postaci amoniaku do zw organicznych. Amoniak jest włączany w 2 reakcjach: z dehydrogenaza glutaminianowa i syntetaze glutaminowa.

dehydrogenaza glutaminianowa katalizuje reakcje aminacji.alfa- ketoglutaranu. Dehydrogenaza działa z NAD i NADP. Enzym ten bierze udział w katabolizmie aminokwasów

alfa-ketoglutaran + NH3+ NADPH +2H+ --glutaminian+ H2O+ NADP+

syntetaza glutaminowa katalizuje wlaczanie amoniaku do glutaminy. Zużywa energie z hydrolizy ATP.

Glutaminian+ NH3+ ATP--- Glutamina+ ADP+ Pi

NO3- w NO2- azot przyswajalny z gleby musi być zredukowany.. Reakcja katalizowana jest przez reduktaze azotanową (cytoplazma) NO3- + 2e+ 2H+ -- NO2- + H2O

NO3- + NAD(P)H + H+ ----NO2- + H2O + NAD(P)+

NO3- musi być obecny bo enzym jest szybko degradowany w wielu typach komórek.

Reduktaza azotynowa (plastycy) NO2- + 6e+ 8H+ --- NH4+ + 2H2O; NO2- +6Fd zred + 8H+---NH4+ +6Fd utl +2H2O

NO2- + 3NAD(P)H+ 5H+---NH4+ + 3 NAD(P)+ 2H2O

Reduktaza ta ma duze powinowactwo do NO2- i kilka-kilkanastokrotnie wyższa aktywność od reduktazy azotanowej.

fosforylacja substratowa - przeniesienie na ADP reszty ortofosforanu z wysokoenergetycznego metabolitu komórkowego.

Np.: Pi+ bursztynylo CoA+GDP—(syntetaza burszytynyloCoA)---bursztynian+ CoASH+ GTP lub

Fosfoenolopirogronian+ ADP—(kinaza pirogronianowa, jony Mg2+) --- pirogronian+ ATP

Wit C- kwas askorbinowy

Dziala jak przeciwutleniacz, utrzymuje Fe 2+ w stanie zredukowanym, pochodna glukozy o wzorze C₆H₈O₆. W warun standardowych jest krystalicznym ciałem stałym. Dobrze rozpuszcza się w wodzie, roztwór ma odczyn kwasowy. Enancjomer L(+) kw askorbinowego zwany jest witaminą C. wpływa na wytwarzanie i zachowywanie kolagenu, Właściwości wit C wykazuje tez kw dehydroaskorbinowy (utleniony). Kw askorbinowy ma właśc. silnie redukujące, gdyż ugrupowanie miedzy c2 a c3 zwane en-diolowym oddaje 2 protony i 2 elektrony. I przechodzi w ugrupowanie diketonowe kw dehydroaskorbinowego.ułatwia gojenie się ran, złamań, hamuje tworzenie się sińców, powstawanie krwotoków, krwawień dziąseł, podnosi odporność na zakażenia, uszkodzenia oraz na choroby, szczególnie w okresach przeciążenia fizycznego, skraca czas trwania zaziębienia i zakażenia, aktywizuje system immunologiczny, ma działanie antywirusowe, zapewnia sprawne funkcjonowanie układu krwionośnego i serca, reguluje i obniża poziom cholesterolu, chroni przed miażdżycą i chorobą wieńcową, obniża ciśnienie krwi. Niedobór: szkorbut.

Aktywacja kw. Palmitynowego Kwas tluszczowy zanim dotrze do matriks musi ulec aktywacji. Tworzone jest wiązanie tioestrowe z CoA. Reakcja katalizowana jest przez syntetaze acylo-CoA( tiokineza kw tłuszczowych). Enzym ten działa na zewnętrznej błonie mitochondrialnej. Zużywana jest czasteczka ATP. Reakcja jest nieodwracalna.

Kwas tluszczowy+ ATP+ HS-CoA-----AMP+ PPi+ R-CO-S- CoA

Fosforan Pirydoksalu koenzym aminotransferaz. Jest pochodną pirydoksyny. Witaminy B6. Ulega podczas transaminacji przekształceniu w fosforan pirydoksaminy. Tworzone jest wiazanie typu Shiffa gdy brak jest substratu i grupa aldehydowa tworzy wiazanie kowalencyjne. Jest to wiazanie iminowe z grupa aminowa łańcucha bocznego określonej reszty lizany w centrum aktywnym.

Fosforan pirydoksalu jest koenzymem w reakcjach przemian aminokwasów tj: dekarboksylacje, recemizacje, rozszczepienie altowe, deaminacje

Replikacja, jej enzymy

Polimeraza DNA I z E. coli katalizuje dołączenie deoksyrybonukleotydów do grupy 3'-OH już istniejącego fragmentu DNA: (DNA)_{n reszt} +dNTP→(DNA)_n+1 +PP_i.Musząbyć obecne dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP).Polimeraza DNA I jest enz. który rozpoznaje nukleotydy i do grupy 3'-OH juz istniejącego odcinka DNA lub startera sparowanego z matrycą dołącza nukleotydy komplementarne do zawartych w nici DNA stanowiącej matrycę. Między przyłączonymi nukleotydami tworzy wiązania 3',5'- fosfodiestrowe, w trakcie czego zostaje uwolniony pirofosforan. Polimeraza ta dokonoje także korekty błędów w DNA, polegającej na usuwaniu niepoprawnie dobranych nukleotydów (aktywność edytorska)

Polimeraza DNA II i III katalizują synteze DNA z 5'- trifosforanów deoksyrybonukleozydów zgodnie z instrukcjami matrycowego DNA, wymaga startera z wolną grupą 3'- OH i wydłużają go w kierunku 5'→3', wykazują aktywność egzonukleazową w kierunku 3'→5'

Replikacja kolistego chromosomu bakteryjnego rozpoczyna się w pojedynczym miejscu początku replikacji (miejsce ori), rejon ten jest nazwany oczkiem replikacyjnym, po przeciwnych stronach wytwarzają sie widełki replikacyjne, które przesuwają się wzdłuż chromosomu.Ostatecznie spotykają sięi ulegają fuzji. Na drugiej nici matrycowej (orientacja 5'→3'), polimeraza DNA syntezuje krótkie odcinki nazwane fragmentami Okazaki. Odcinki te ulegają połączeniu za pomocą ligazy DNA w całość (nić opóźniona). Startery są syntezowane przez polimerazę RNA nazwane prymazą. Może syntezować RNA bezpośrednio na jednoniciowej matrycy DNA. Polimeraza DNA III katalizuję syntezę zarówno nici wiodącej jak i opóźnionej. Przed replikacją nici musząbyć rozplecione. Do rozwinięcia dwuniciowej helisy jest używana helikaza DNA a białka SSB przeciwdziałają ponownemu utworzeniu sie par zasad w rozplecionym odcinku DNA. Aby zapobiec zapętleniu i uszkodzeniu nici topoizimeraza I zrywa wiązania fosfodiestrowe w jednej z 2 nici DNA w niewielkiej odległości przed widełkami, umożliwiając swobodną rotację DNA wokół drugiej nici, a następnie łączy zerwaną nić. Po replikacji kolistego DNA powstają 2 dwuniciowe koliste cząsteczki DNA wzajemnie złączone jak ogniwa łańcucha. Cząsteczki są rozdzielone od siebie przez topoizimerazę II. W DNA zrywa przejściowo obydwie nici helisy. Wiąże się jedną z dwóch potomnych kolistych cząsteczek DNA i rozcina ją następnie łączy.

Zestaw 7 pyt 8

Podaj enzymy zaliczane do oksydoreduktaz uczestniczące w CKC, napisac jedna z nich.

1-dehydrogenaza pirogronianowa (kompleks złożony z 3enz i 5koenzymów)utlenia pirogronian wykorzystując NAD+ który zostaje zredukowany do NADH, powstaje acetyloCoA i CO2. Pr nazwany dekarboksylacja oksydacyjną.

2 dehydrogenaza izocytrynianowa- utlenianie izocytrynianu do alfa-ketoglutaranu.

3 kompleks dehydrogenazy alfa- ketoglutaranowej - utlenianie alfa-ketoglutaranu do bursztynylo CoA i CO2. NAD+ to kofaktor

4 dehydrogenaza bursztynianowa- utlenianie burszytnianu do fumaranu. FAD przechodzi w FADH2.

5 dehydrogenaza jabłczanowa - jabłczan do szczwiooctanu. NAD+ to kofaktor, odbiera on wolna pare elektronów i powstaje NADH.

(proponuje tu zeskanowac caly cykl ze str 391 i wkleic to )

tRNA - transportujący RNA. Cząsteczki kwasu rybonukleinowego (RNA), których zadaniem jest przyłączanie wolnych aminokwasów w cytoplazmie i transportowanie ich do rybosomów, gdzie zostają włączone do powstającego łańcucha polipeptydowego.. Budowa(4 ramiona):ramię DHU - struktra spinki z dihydroksyuracylem (nukleotyd nietypowy dla RNA), zawiera informację jaki rodzaj aminokwasu może być przyłączont do danego tRNA, ramię akceptorowe - sparowane zasady końców 3' i 5', oprócz końca CCA-3' niesparowanego, do którego przyłączają się chemicznie aktywowane aminokwasy, ramię zmienne - tylko w niektórych tRNA , ramię Tφc - rybotymidowe, psi to modyfikowana zasada zwana pseudouracylem , pętla antykodonowa - odpowiedzialna za rozpoznanie i związanie z kodonem w mRNA

---