Podstawy biotechnologii żywności

Ćwiczenie 1

Kinetyka produkcji kwasu mlekowego przez bakterie z rodzaju Lactobacillus

Cel doświadczenia: Ocena kinetyki produkcji kwasu mlekowego w hodowli Lactobacillus rhamnosus (bakterii fermentacji mlekowej) oraz pomiar ilości rozłożonej glukozy metodą miareczkowania.

Część teoretyczna

Pierwsze doniesienia o odkryciu kwasu mlekowego w skwaszonym mleku pochodzą z 1780 roku. Już za czasów Pasteura wykazano, że za fermentację cukrów obecnych w mleku odpowiedzialne są bakterie. Z chwilą uruchomienia przemysłu fermentacyjnego produkcja kwasu mlekowego stała się jego ważną gałęzią. Popularne produkty nabiałowe, takie jak ostre i łagodne sery, jogurty i kwaśna śmietana, produkowane są do dzisiaj z użyciem kultur starterowych — szczepionek złożonych z mieszaniny bakterii kwasu mlekowego. Kwas mlekowy obecny w tych produktach pełni funkcję naturalnego konserwanta. Fermentację mlekową przeprowadzają bakterie z rodzajów: Streptococcus i Pediococcus oraz Lactobacillus (włączając L. casei i L. plantarum), a także pewne gatunki z rodzaju Rhizopus rozkładając glukozę, głównie do kwasu mlekowego oraz śladowych ilości lotnych kwasów organicznych, etanolu, fumaranów i CO₂. Bakterie mlekowe należą do rodziny Lactobacteriaceae, w której rodzaj Lactobacillus zawiera najwięcej gatunków. Bakterie mlekowe cechuje odmienność form morfologicznych. Są to długie lub krótkie laseczki oraz ziarniaki ułożone w łańcuszki. Cechą charakterystyczną bakterii z rodziny Lactobacteriaceae jest wzrost w obecność tlenu (tolerancyjne beztlenowce) pomimo braku wytwarzania hemin (cytochromów, katalazy). Najlepiej rozwijają się one w środowisku o pH od 4,5 do 6,5. U bakterii fermentacji mlekowej glikoliza (szlak EMP) jest połączona z redukcją pirogronianu do mleczanu, w przeciwieństwie do fermentacji prowadzonej przez drożdże, gdy pirogronian ulega dekarboksylacji, a następnie redukcji do etanolu.

Prezentowane równanie reakcji jest uproszczonym schematem przemian chemicznych energetycznych zachodzących w procesie homofermentacji mlekowej:

C₆H₁₂O₆ + 2 ADP + 2 P_i 2 CH₃CHOH COOH + 2 ATP

Glukoza kwas mlekowy

Materiały

Podłoża wzrostowe dla Lactobacillus - MRS

• Ekstrakt mięsny 5g,

• Ekstrakt drożdżowy 2,5g,

• Pepton 5g,

• K₂HPO₄ 1g

• Cytrynian sodu 1g

• Octan sodu trójwodny 2,5g,

• Roztwór soli A* 2,5ml

• Tween 80 0,5ml,

• Woda destylowana 500ml

pH 6,2 - 6,6

* Roztwór soli A:

11,5% MgSO₄ 7H₂O + 2,8% MnSO₄ 4H₂O

Autoklawować w szklanych butelkach z zakręcanym korkiem i gumową uszczelką przez 15 min. w 121^oC.

Odczynniki

• 0,05 M glukoza 100ml

• 0,1 M NaOH 1 litr

• roztwór alkoholowy purpury bromokrezolowej 1%

(50% roztwór etanolu)

• 0,85% NaCl

Szczepy

Liofilizowane kultury Lactobacillus rhamnosus.

Skład ampułki LAKCID:
2 mld CFU pałeczek Lactobacillus rhamnosus: Szczep Lactobacillus rhamnosus  Pen - 40 %, Szczep Lactobacillus  rhamnosus E/N - 40 %, Szczep Lactobacillus rhamnosus Oxy - 20 %.

Sprzęt:

• cieplarka na 37^oC

• wirówka

• pH-metr

• biureta

• mieszadło

• kolby stożkowa, pipety

Cześć praktyczna

Procedura:

Cześć I:

(wykonana przed zajęciami)

• 200ml podłoża (wzrostowego) dla Lactobacillus zaszczepiono 1 ampułką liofilizowanej kultury bakterii z rodziny Lactobacteriaceae.

• inkubowano 72h godzin w temperaturze 37^oC

• podłoża powzrostowe odwirować (4 500 rpm przez 15 min) w temperaturze 4^oC w celu uzyskania osadu bakterii

• osad przepłukano roztworem fizjologicznym chlorku sodu (0,9% NaCl) i powtórnie odwirowano (w warunkach jak uprzednio)

Część II:

(wykonywana przez studentów na zajęciach)

• przygotować 20 ml zawiesiny bakteryjnej

• do tak przygotowanej zawiesiny dodać kilka kropli (1 - 2) roztworu purpury bromokrezolowej i miareczkować 0,1 M NaOH do momentu, w którym wskaźnik przyjmie barwę purpurową - jest to barwa wyjściowa, która powinna zgadzać się z wynikami późniejszych miareczkowań

• zapisać ilość zużytego NaOH

• dodać 3 ml 0,05 M glukozy (150 μM glukozy)

•   co 5 min dodawać NaOH z biurety w celu utrzymania stałej wartości pH

• zapisać ilość zużytego NaOH w każdym miareczkowaniu oraz czas, w którym następuje zobojętnienie mieszaniny

• kiedy uzyskane wyniki wskażą, że fermentacja dalej nie zachodzi, dodać 3 ml glukozy
  (aby wykazać, że glukoza była czynnikiem ograniczającym) i kontynuować eksperyment

Należy przygotować sprawozdanie, które powinno zawierać:

      1. Obliczony współczynnik fermentacji glukozy (μM · min^-1):

1 ml 0,1 M NaOH = 100 μEq (mikroelektrorównoważniki) kwasu = 50 μM rozłożonej glukozy

   2. Narysowany wykres przedstawiający zależność produkcji kwasu mlekowego od czasu

oraz rozłożonej glukozy od czasu.

3. Narysowany szlak metaboliczny rozkładu glukozy na drodze homofementacji.

4. Wnioski: Porównanie stopnia fermentacji (rozkładu) glukozy na początku doświadczenia i po jego przedłużeniu, tj. po dodaniu glukozy.

---