Przygotowanie reakcji PCR
Przygotowaliśmy mieszaniny reakcyjne dla 8 próbek badanych
a) 4 próbki grupy
b) 2 próbki kontroli pozytywnej
c) 2 próbki kontroli negatywnej
Do eppendorfu 500μl trzymanego na schłodzonej podstawce dodaliśmy 158 μl Master Mix, 20 μl mieszaniny dNTPs i 2 μl polimerazy DNA (w sumie 180 μl mieszaniny reakcyjnej). Zawartość eppendorfu przepipetowaliśmy 6-7 razy bardzo powoli.
Do eppendorfu 200μl dodaliśmy 22,5 μl mieszaniny reakcyjnej oraz 2,5 μl DNA. Zawartość przepipetowaliśmy 3 razy bardzo powoli i schowaliśmy do lodówki.
I Próby wspólne
Do 2 eppendorfów 200 μl podpisanych „188 pz” i „220 pz” dodajemy :
1) 188pz- 22,5 μl mieszaniny reakcyjnej oraz 2,5 DNA kontroli pozytywnej 188 pz
2) 220 pz- - 22,5 μl mieszaniny reakcyjnej oraz 2,5 DNA kontroli pozytywnej 220 pz
Przepipetowaliśmy 2-3 bardzo powoli, a następnie schowaliśmy do lodówki.
II Próby wspólne
Przepipetowaliśmy bardzo powoli 2-3 razy i przenieśliśmy na schłodzonej podstawce do bloku w termocyklerze i puszczamy reakcje PCR
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej dla jednej próby badanej
Dodaliśmy 39,5 μl Master Mix, 5 μl mieszaniny dNTPs oraz 0,5 μl polimerazy DNA + 5 μl Dna otrzymanego wg protokołu.
Rozdział elektroforetyczny uzyskanego produktu z użyciem markera wielkości.
Wykonanie elektroforegramu z wykorzystaniem systemu do obrazowania żeli.
I. Przygotowanie próbek ( 8 prób)
Próby wspólne
Do pierwszej dodaliśmy 5 µl markera Ready to use DNA M100-500
Do drugiej 2 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli negatywnej
Do trzeciej 2µl barwnika 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli pozytywnej 220 pz
Do czwartej 2 µl barwnika 10µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli pozytywnej 188 pz
Próby indywidualne
Dodaliśmy 2µl barwnika I 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR badanej próbki
II Przygotowanie formy na żel.
Wkładamy tackę na żel do formy do wylewania żeli (ciemny pasek musi znajdować się pomiędzy rowkami przytrzymującymi grzebień), następnie wybraliśmy grzebień o odpowiedniej grubości i liczbie zębów-13) i umieścić w formie.
III Wykonanie 2% żelu
Do kolby szklanej dodaliśmy 1,4 g agarozy i 70 ml TBE. Rozpuszczaliśmy przez ok. 2 min w mikrofalówce, ostudziliśmy do temp ok. 50-60 stopni Celsjusza. I dodaliśmy 14 µl bromku etydyny. Wymieszaliśmy i wylaliśmy do saneczek. Końcówką do pipety usunęliśmy powstałe nieliczne pęcherzyki powietrza. Żel spolimeryzował po ok. 15 minutach.
IV wykonanie elektroforezy
Z otrzymanego żelu wyjeliśmy grzebień. Umieściliśmy saneczki w aparacie do elektroforezy, a następnie wypełniliśmy zbiornik buforem do elektroforezy, aż do przykrycia żelu (ok. 2 mm nad powierzchnią żelu). Końcówką od pipety przepłukaliśmy kieszonki buforem do elektroforezy. Przygotowane wcześniej próby wspólne i indywidualne nanieśliśmy do kieszonek. Przykryliśmy zbiornik pokrywą, podłączyliśmy elektordy do zasilacza, zasilacz do prądu i włączyliśmy przycisk znajdujący się z tyłu urządzenia. Elektroforezę prowadziliśmy przy napięciu 90 V i natężeniu 26 mA. Nacisnęliśmy przycisk „start” i prowadziliśmy elektroforezę.
Po zakończeniu elektroforezy wyłączyliśmy całą aparaturę, zlaliśmy bufor z saneczek osuszyliśmy je, a następnie przenieśliśmy do komory systemu wizualizacji.
Otrzymany obraz elektroforetyczny
Wnioski: Wszyscy badani są homozygotami typu dzikiego. Nie posiadają oporności na wirusa HIV. Wszystkie prążki znajdują się na wysokości 220 pz.
Niewidoczność prążka pierwszego i słaba widoczność prążka 2 może być spowodowana błędami w pipetowaniu materiału do kieszonek. Co więcej próbka pierwsza (prążek pierwszy) zawierała prawie o połowę zmniejszoną ilość materiału w stosunku do pozostałych.
Koleją przyczyną nieprawidłowości może być fakt, iż początkowo elektroforeza zachodziła w odwrotnym kierunku do zamierzonego: DNA powinno migrować w kierunku anody, elektrody dodatniej czerwonej, a z nieuwagi wykonujących migrowało w kierunku katody.
Wyszukiwarka