BIOTECHNOLOGIA
ODMIANY GENETYCZNIE ZMODYFIKOWANYCH ROŚLIN UPRWANYCH W ROLNICTWIE - SPÓR O CO?
Wzrost powierzchni uprawy odmiany GM wykazuję wyjątkowo duża dynamikę. Niektóre kraje starają się jednak nie dopuścić odmian GM do uprawy, w tym Polska. W Unii Europejskiej zostały wprowadzone odpowiednie za ubezpieczenia prawne i instytucjonalne mające uchronić przed ewentualnymi skutkami szkodliwości organizmów GM oraz zabezpieczające prawa własności intelektualnej.
Wobec odmian GM są wysuwane różne zastrzeżenia. Przede wszystkim wskazywało na zagrożenie środowiska naturalnego, bioróżnorodności oraz zdrowia konsumentów. Żadne z nich nie zostało dotychczas potwierdzone. Natomiast uprawa odmian GM przyniosła rolnikom bezpośrednie korzyści ekonomiczne oraz spowodowała zmniejszenie uciążliwości upraw dla środowiska. Przypuszcza się, że dzięki obecności odmian GM realne stanie się spełnienie oczekiwań, aby rolnictwo mniej obciążało środowisko oraz podejmowało nowe zadania, takie jak dostarczenie nowych surowców i produktów. Stefan Malepszy 2007.
DEFINICJA BIOTECHNOLOGII
JEST TO INTERDYSCYPLINARNA dziedzina nauki i techniki, która zajmuje się zmianą materii żywej i nieożywionej poprzez zastosowanie metod naukowych i technologii z wykorzystaniem organizmów żywych, ich części, bądź pochodzących od nich produktów i modeli życia z użyciem technik DNA/RNA, białek i innych cząsteczek, komórek, kultur komórkowych i inżynierii komórkowej, genomowych i wektorów RNA, bioinformatyki i nanobiotechnologii, w celu tworzenia wiedzy, dóbr i usług.
Biotechnologia wg. dziedzin:
- nauki inżynieryjne i technologie:
Biotechnologia środowiskowa
Biotechnologia przemysłowa
- nauki medyczne i zdrowie:
Biotechnologia medyczna
- nauki rolnicze:
Biotechnologia rolnicza
Działy agrobiotechnologii:
K- klonowanie roślin
SB - produkcja substancji bioaktywnych
DM - diagnostyka molekularna
GMO - hodowla genetycznie zmodyfikowanych odmian
HN - metodyka hodowli roślin
MNU - mikroorganizmy niepatogeniczne w uprawie roślin
Tylko GMO uważa się za nieprzydatne w rolnictwie ekologicznym, zrównoważonym?
Kraje o największym areale upraw GMO:
USA - 54,6 mln ha (soja kukurydza, bawełna, rzepak, kabaczek, papaja, lucerna)
Argentyna - 18mln ha ( soja kukurydza bawełna)
Brazylia 11,5 (soja bawełna)
Kanada 6,1 mln ha rzepak kukurydza soja
India 3,8 bawełna
Chiny 3,5 mln ha bawełna
Paragwaj 2mln ha soja
RPA 1,4 mln ha kukurydza soja bawełna
Urugwaj 0,4 mln ha soja kukurydza
Filipiny 0,2 mln ha kukurydza
Australia 0,2 mln ha bawełna
Rumunia 0,1 mln ha soja
Meksyk 0,1 mln ha bawełna doja
Hiszpania 0,1 mln ha kukurydza
Kolumbia Francja Iran Honduras, Czechy Portugalia, Niemcy,Słowenia
WPROWADZENIE:
Definicja: Biotechnologia- jest to wykorzystanie metod biologicznych do produkcji dóbr i usług. Jest to definicja dla potrzeb OECD i EFB obowiązująca również przy tworzeniu polskich regulacji prawnych dot. Biotechnologii.
Definicja z 1978: jest to zintegrowane zastosowanie wiedzy i techniki w dziedzinie biochemii, mikrobiologii i nauk inżynieryjnych w celu technologicznego wykorzystania zdolności drobnoustrojowych kultur tkankowych lub części z nich.
Definicja biotechnologii:
Białka i inne cząsteczki: sekwencjonowanie/synteza/inżynieria białek i peptydów, poprawa metod transportu dużych cząsteczek leków, protepmika, izolacja o oczyszczanie., przekazywanie receptorów komórkowych.
Komórki, komórki komórkowe i inżynieria komórkowa: kultury komórkowe i tkankowe, inżynieria tkankowa, fuzja komórkowa, szczepionki i immunizacja, manipulacja na zarodkach
Geny i wektory RNA: terapia genowa, wektory wirusowe
Bioinformatyka: konstrukcja genowych/ białkowych baz danych, modelowanie złożonych procesów biologicznych, biologia systemowa.
Nanobiotechnologia: zastosowanie narzędzi i procesów Nano/mikroproduktów do konstrukcji urządzeń do badań biosystemów oraz w transporcie leków, udoskonalenia diagnostyki etc.
WARUNKI OGÓWLNE, KTÓRE MUSZĄ BYĆ SPEŁNIONE, ABY MOŻNA BYŁO UZNAĆ ROZWIĄZANIE BIOTECHNOLOGICZNE U ROŚŁIN ZA SATYSFAKCJONUJĄCCE:
ODMIANA TFARSGENICZNA:
- dostępny jest gen, który determinuje daną cechę
- wiadomo jakimi sekwencjami regulacyjnymi gen uzupełnić, aby uległ oczekiwanej ekspresji
- istnieje sposów wprowadzanie danego genu do dawcy
- rośliny z nowym genem mają nową właściwość w typowych warunkach uprawy
- nowa właściwość jest przekazywana na potomstwo
- nowa właściwość jest korzystnie reprezentowana w pewnym zakresie warunków klimatyczno-glebowych
- rośliny z nowym genem są konkurencyjne do dotychczasowych odmian
* PRODUKCJA MATERIAŁU SIEWNEGO
- zarodki somatyczne można wytwarzać w dużych ilościach
- zarodki somatyczne można zamknąć w otoczce - sztuczne nasiona
- somatyczne nasiona mają wszystkie cechy dobrego materiału siewnego
- cena somatycznych nasion jest konkurencyjna
* PRODUKCJA OKTREŚLONEJ SUBSTANCJI W BIOREAKTORZE
- istnieją warunki do stabilnego wytwarzania substancji
- wydajność produkcji jest odpowiednia
- produkt handlowy spełnia odpowiednie wymogi jakościowe
- technologia jest opłacalna
Podstawowe umiejętności niezbędne do rozwijania badań z roślinami transgenicznych
Odmiana transgeniczna: Izolacja genów - dostępność genów
Konstrukcja genów i wektorów
Wprowadzenie wyizolowanych genów do dawcy
Uzyskanie roślin transgenicznych
Sprawdzenie stabilności genu w różnych warunkach, występowanie linii transgenicznych w warunkach uprawy polowej
Sprawdzenie wartości linii transgenicznych w doświadczeniu porównawczym
Opracowanie technologii uprawy i nasiennictwa
Podstawowe umiejętności niezbędne do rozwijania badań z somatycznymi nasionami
Produkcja materiału siewnego: Wytwarzanie zarodków w bioreaktorze
Sprawdzanie jakości zarodków: genetycznej, adaptacyjnej, wzrostu i rozwoju, plonowania
Sposób hartowania i adaptacji
Dobór otoczki i jej składników
Fizjologia somatycznego nasienia
Kryteria jakości materiału siewnego somatycznych nasion
PODSUMOWANIE:
Biotechnologia może wprowadzić postęp w trzech sferach produkcji roślinnej:
- genetycznemu ulepszaniu
- wysokiej jakości materiału siewnego / sadzonkowanego
- produkcji określonej substancji chemicznej w bioreaktorach
Transgeniczne odmiany są efektem rozwoju metod i hodowli roślin
Transgeniczne odmiany zostały wprowadzone do uprawy głownie w USA, Kanadzie i niektórych krajach Ameryki Południowej
Odmiany transgeniczne będą ulepszane o nowe właściwości
W ciągu ostatnich kilku lat gospodarcze znaczenie biotechnologii rolniczej na świecie wykazuje silną tendencję wzrostową.
Definicja inżynierii genetycznej
Inżynieria - nauka! Wykonywania robót inżynierskich, umiejętność wznoszenia wszelkich budowli z wyjątkiem budynków
Budowla = genom
Genom można konstruować metodami. Ale dlaczego hodowcy nie stosującego metod inżynierii genetycznej nie określa się jako inżyniera genetyka?
Ponieważ inżyniera genetyczna jest nauką zajmującą się wprowadzaniem zmian w materiale genetycznym z pominięciem metod genetyki i mutagenezy klasycznej.
OBSZAR ODDZIAŁYWANIA IONŻYNIERII GENETYCZNEJ:
I Nauki podstawowe:
Nauki biologiczne
- genetyka
- biochemia
- cytogenetyka, cytologia
- biologia rozwoju
- systematyka
- embriologia
- fizjologia
- ekologia
- biofizyka
- paleobiologia
Wydaję się, że prędzej czy później wszystkie dziedziny biologii będą Krzystały z osiągnięć inżynierii genetycznej
Medycyna doświadczalna
Informatyka
Nauki humanistyczne
II nauki stosowane, gospodarka
Biotechnologia
Hodowla
Medycyna kliniczna
Ochrona środowiska
Ochrona roślin
Farmacja
Diagnostyka
- profilaktyka
- medycyna sądowa
- przemysł rolno-spożywczy
- nasiennictwo
- inne
Tak olbrzymi obszar zastosowań inżynierii genetycznej bierze się stąd, że pozwala ona na manipulacje jednym z dwóch elementów decydujących o funkcjonowaniu każdego elementu organizmu - substancją dziedziczną (drugi element to środowisko).
Wydaje się, że celem inżynierii genetycznej dostarczenie metod i strategii wprowadzania zdefiniowanych zmian w materiale genetycznym, na ogół nie istniejących w warunkach naturalnych. Umożliwia to uzyskanie dwóch celów:
Poznawczego- poprzez badanie skutków tych zmian, wyjaśnienie struktury i funkcjonowania materiału genetycznego oraz wpływu na fenotyp
Utylitarnego - dostarczenie organizmów z nowymi układami genetycznymi zgodnie z potrzebami gospodarki.
Narzędzia inżynierii genetycznej:
Podstawowe terminy używane w inżynierii genetycznej:
Matryca, lepkie końce, tępe końce, ligacja, trawienie, PCR, sekwencjonowanie, przeszukiwanie, trans geneza, transformacja, transdukcja, restrykcja, amplifikacja, trans gen, organizm transgeniczny, mapa restrykcyjna, hybrydyzacja, ekspresja.
Genom: pełen skład materiału genetycznego posiadanego przez wewnątrz komórkowe parazyty, komórkę czy organizm
Metagenom: obejmujące wartości genomów grup mikroorganizmów zasiedlających określone siedliska np. mikroorganizmów glebowych strefy korzeniowej danego gat ros
Biologia systemów integruje wiedzę omiczną
Biologia syntetyczna projektowanie i tworzenie sztucznych systemów biologicznych w oparciu o wiedzę z biologii systemów i inżynierii
SNP funkcjonalny SNP w genomie
Haplptyp zestaw SNPów polożonych na jednej chromatydzie, który dziedziczy się jako zestaw sprzężonych ze sobą alleli
INDEL polimorfizm insercji i delecji
CNP zmiennośc liczby kopii sekwencji w DNA
eSNP-SNP związany z regulacją genu (jednego lub więcej)
QTL zbiór genów regulujących ekspresję określonego genomu
Mapowanie morga nowskie (rekombinacyjne)
Mapowanie asocjacyjne - wyszukiwanie genów kandydatów poprzez porównanie częstotliwości wariantów genetycznych (polimorfizm w DNA) i fenotypowych
Genomika porównawcza polega na charakteryzowaniu bioinformatycznym przez porównanie sekwencji całuch genomów, lub dużych jego obszarów, oraz porównaniu sekwencji genomowych z innymi zbiorami sekwencji
NGS
inżynieria genomowa: jest definiowana jako obszerne i zamierzone modyfikacje systemu replikującego się mające prowadzić do realizacji określonych celów (poznawczych lub gospodarczych) inaczej mówiąc jest to inżynieria genetyczna na skalę genomową
MAGE szybka zautomatyzowana metoda in vitro kierowanej ewolucji szlaków metabolicznych
GWAS wielkoskalowa analiza funkcjonalna polegająca na identyfikacji polimorfizmu (głównie SNPów) w skali genomowej i jego przypisaniu (asocjacji) określonym cechom
Omika jest ogólnym terminem dla szerokiej dyscypliny naukowej i inżynieryjnej do analizy interakcji obiektów informacji biologicznej zawartej w różnych omach.
Skupia siew ona głównie na:
Mapowaniu obiektów informacyjnych takich jak geny, białka, ligandy
Wyszukiwaniem związków interakcji między obiektami
Inżynierii sieci i obiektów w celu zrozumienia oraz manipulowania mechanizmami regulatorowymi
Integracji różnych onów i omik z podkategorii
OMY: kluczowym podejściem w badaniach omicznych jest dzielenie zawartości komórkowej w oddzielne subpopulacje, każda określona terminem om z odpowiednim przedrostkiem. Ogólniej ujmując omy mogą być dzielone na takie które reprezentują populacje molekuł i takie, które definiują ich działania (akcje).
Cel jeżeli poszczególne subpopulacje zostaną zdefiniowane i zanalizowane, to można spróbować zrekonstruować cały organizm poprzez interpelacje ich, ostatecznie pozwalając na uzyskanie pełnego i dynamicznego obrazu komórki (organizmu). Problemem w porównywaniu różnych omów jest to, że każdy reprezentuje inny zbiór genów.
Enzymy i biała używane w inżynierii genetycznej:
- enzymy syntetyzujące kwasy nukleinowe:
a) polimerazy DNA, polimeraza I (reperaza), polimeraza Klenowa, polimeraza T7, polimeraza T4, polimeraza Taq, odwrotna transkryptaza
b) polimerazy, polimeraza RNA E.coli, polimeraza RNA SP6, polimeraza RNA T3, polimeraza RNA T7
- enzymy modyfikujące kwasy nukleinowe:
a) działające na końce, TdT, polinukleotypowa Kinaza T4, alkaliczna Fosfataza CIP i BAP,
b) etylujące DNA dam metylaza, dcm metylaza
- topoizomery RNA
a) topoizomeraza I, topoizomeraza II
-enzymy degradujące kwasy nukleinowe
- białka wiążące się z DNA
- enzymy łączące cząsteczki kwasu nukleinowego
- enzymy rekombinujące cząsteczki DNA
Sekwencje kwasów nukleinowych jako narzędzie IG (zastosowanie)
Sondy: zast. Przegląd bibliotek, mapowanie molekularne, badanie ekspresji genów, sekwencjonowanie, identyfikacja genotypów
Wektory: klonowanie, transgenaza, ekspresja genów, transkrypcja in vitro
Oligonukleotydy: sekwencjonowanie, metody oparte na pCR, odwrotna transkrypcja, sondy, synteza DNA (w tym chemiczna)
Rybozymy: projektowanie rybozymów hamujących ekspresję genów, nadających odporność na wirusy poprzez niszczenie ich genomów.
Substancje używane do znakowania kwasów nukleinowych:
Metody izotopowe:
P32 znakowanie sond, sekwencjonowanie
P33 sekwencjonowanie, znakowanie primerów
P35 in situ hybrydyzacja, sekwencjonowanie
Metody nieizotopowe
System biotyna-koniugat avidyny z cząsteczką generującą sygnał
System hapten koniugat przeciwdziała z cząsteczką generującą sygnał
Ważniejsza aparatura i urządzenia laboratoryjne:
System oczyszczania wody
System mycia szkła i postępowania z odpadami
System sterylizacji szkła i odczynników
Przechowywanie i praca z materiałami wymagającymi obniżonych temperatur:
- zamrażarki głębokiego zamrażania (-75—95) materiał biologiczny, sztoko bakteryjne, bakterie komplementarne
- zamrażarki zwykłe -20 -30 enzymi, białka, oligonukleotydy, kw nuk, nukleotydy, roztwory odczynniki i inne
- lodówki enzymi białaka roztwory odczynniki kw nukleinowe
aparatura do pomiarów zawartości substancji w roztworach (spektrometry)
inkubatory- cieplarki
wirówki
aparatura do elektroforetycznych rozdziałów kwasów nukleinowych (elektroforeza pionowa i pozioma)
fotodokumentacja
aparatura do hybrydyzacji kwasów nukleinowych
cykler do PCR
aparatura do transformacji ( do elektroporacji, mikrioiniekcji)
dostęp do komputerowych baz danych
dostęp do usług w zakresie sekwencjonowania ( w tym wielkoskalowego) syntezy, mikromacierzowej hybrydyzacji DNA
WEKTORY
Z laciny : ten który wozi
O jakie wożenie chodzi w przypadku IG? O wprowadzenie wybranego fragmentu DNA do układu w którym ma on zostać poddany określonemu procesowi np. namnażaniu integracji lub ekspresji.
Wobec tego wektorem może być każdy fragment kwasu nukleinowego, który zdolny jest spełnić wyżej wymieniony warunek.
Minimalne warunki które powinien spełniać wektor:
- w komórce biorcy być zdolny do namnażania się autonomicznie lub po integracji do DNA biorcy.
- mieć miejsca cięć restrykcyjnych (najczęściej wymagane pojedyncze) w regionach nie zakłócających funkcji plazmidu
- zawierający geny markerowe pozwalające na wyróżnienie komórek w których się znajduje (nie puste)
- namnażać się w szczepach bakteryjnych nie zdolnych do życia poza bardzo zdefiniowanymi warunkami laboratoryjnymi i nie posiadających zdolności do koniugacji
Ponadto powinien:
- posiadać miejsce klonowania, charakteryzując się obecnością wielu unikalnych miejsc restrykcyjnych. Jest tpo najczęściej syntetyczny ologonukleotyd
- posiadać sekwencje umożliwiające spełnienie wektorowi specyficznych funkcji zgodnie z jego przeznaczeniem np.: sterując w pobliżu miejsca insercji umożliwiające ekspresję insertu, umożliwiając insercję w specyficzne miejsce, amplifikację PCR, sekwencjonowanie i inne.
- posiadać system markerów pozwalających odróżnić różne stany wektora i insertu np.: obecność lub nieobecność wektora, zrekombinowany pusty
- namnażać się w odpowiedniej liczbie kopii na komórkę (przy zahamowanej syntezie DNA gospodarza)
- mieć jak najmniejszą wielkość (umożliwia to najczęściej wstawianie większego insertu)
- nie posiadać genów, których rozpowszechnianie mogłoby stanowić zagrożenie dla innych z organizmów.
Ogólna budowa wektora:
Wektor zbudowany jest z sekwencji kodujących, dwa różne typy:
funkcje pozwalające na utrzymanie i namnażanie się wektora w komórce - zależne od specyfikacji wektora.
- sekwencje ori, ARS, cos, białka A, telomerowi, centomerowe, markerowe, reporterowe, inne
funkcje pozwalające na spełnienie specyficznych zadań jako wektora:
- polilinkery (MCS)
- markery i reporterowe sekwencje
- sekwencje sygnalne dla wydobywania informacji z insertu
Klasyfikacja wektorów i ich ogólna charakterystyka:
typ komórek gospodarza (prokariotyczne, eukariotyczne, wahadłowe)
sposób namnażania ( autonomiczne, integracyjne)
„pochodzenie” ( plazmidowe, fagowe, kosmity, fagemidy, sztuczne chromosony - batkeryjne BAC drożdżowe YAC człowieka HAC)
Funkcje (Klonujące- do subklonowanie, konstrukcji bibliotek cDNA, konstrukcji bibliotek DNA genomowych, Ekspesyjne- ekspresja mRNA, ekspresja białek (prokariotyczny, eukariotyczny) wielofunkcyjne, wektory somatycznej terapii genowej, retrowirusy, adenowirusy, wirusy towarzyszące adenowirusom, liposomy, poliaminokwasy.
Wykład 7
Niektóre objaśnienia:
NHS-ester - ester kwasu amino kaprynowego i hydroksyl bursztyno amidu
POD - peroksydaza
RT reverse transcriptase
Lumonil amino pochodna kwasu ftalowego
AP kwaśna fosfataza
DIG digoxigenine
Sondy :
Ważniejsze sposoby identyfikacji molekuł w mieszańcach
Stosowanie znaczników (Flogs)
Przy pomocy markerów (cząsteczki reporterowe, tagujące)
Sondowanie
DEFINICJA SONDY MOLEKULARNEJ jest rodzajem molekularnego próbnika, który poprzez specyficzne powinowactwo z określonym związkiem umożliwia jego identyfikację
Rodzaje sond molekularnych:
DNA - długość- zależne od okoliczności od kilkunastu nukleotydów (ologonukleotydy) DO KILKUNASTU TYSIĘCY (HYBRYDYZACJA IN SITU)
RNA hybrydyzacja in situ
Białka - przeciwciała
- białka specyficzne łączące się z DNA
Metody znakowania sond:
Znakowanie końców
końców 5': -dwustopniowe (AP następnie kinaza polinukl. T4); - jednostopniowe (kinaza polinuk. T4); -przez ramię NHS; -wydłużanie znakowanego startera (polimeraza Taq, rewertaz, DMA polimeraza T7)
końców 3': -z użyciem terminalnej transferazy; -substrat DTP; - substrat ddNTP; -wypełnienie zwisających końców; - dołączenie końców (polimeraza DNA T4)
Znakowanie całych sond przez inkorporację znakowanych nukleotydów:
PCR; - wydłużanie starterów o losowej sekwencji; - Nick translation; - transkrypcja in vitro, - odwrotna transkrypcja.
Znaczniki sond:
Radioaktywne: - izotopy fosforu (P32, P33); -izotopy siarki (S35)
Nie radioaktywne: - związane bezpośrednio z sondą; - wiążące się pośrednio z sondą system biotyna - koniugat awidyny (sterpawidyny) z cząstką generującą sygnał (sygnalną), system hapten (dioksygenina) - koniugat przeciwciało z cząstką generującą sygnał
Rodzaje sygnałów generowanych przez znaczniki: - promieniowanie jonizujące (cząstki beta o róznej energii); - promieniowanie niejonizujące (fluorescencja, chemiiluminiscencja); rakacje barwne; - cząstki rozpraszające elektrony (np. metale ciężkie).
Użycie sond
Do identyfikacji, lokalizacji i/lub izolacji cząstek kwasów nukleinowych, białek i innych makromolekuł
Hybrydyzacja na mambranach
Hybrydyzacja na mikropłytkach
Hybrydyzacja in situ (mapowanie fizyczne, badanie ekspresji genów, mikroskopia immunoelektronowa)
Hybrydyzacja w roztworach (izolacja mRNA, izolacja bezpośrednio z genomu lub bibliotek).