ĆWICZENIE XIV

Temat: Formy współżycia między organizmami

Populacje drobnoustrojów, bytując we wspólnym siedlisku, na ogół nie pozostają obojętnymi na współpartnerstwo innych organizmów. Jedynie, gdy środowisko zasiedlają drobnoustroje o minimalnych wymaganiach lub o skrajnie różnych zapotrzebowaniach pokarmowych, można mówić o neutralizmie.

W naturalnych środowiskach drobnoustroje tworzą zespoły, złożone z różnych grup fizjologicznych i taksonomicznych. Skład tych zespołów regulowany jest nie tylko przez fizyczne i chemiczne warunki środowiska, lecz także przez całokształt oddziaływań między poszczególnymi grupami, a nawet między gatunkami lub szczepami drobnoustrojów. Charakter tych oddziaływań jest różnorodny i stanowią one ważny czynnik w regulacji składu biocenoz. W zależnościach między różnymi grupami drobnoustrojów możemy rozróżnić bezpośrednie lub pośrednie ich oddziaływania. 

Oddziaływanie bezpośrednie polegać może na pasożytowaniu, jednego organizmu na drugim (np. fagi na bakteriach) lub na ścisłym współżyciu (np. układy symbiotyczne glonów lub sinic z grzybami, nazywane porostami). Wśród drobnoustrojów występuje też drapieżnictwo (np. odżywianie się pierwotniaków różnymi bakteriami).

Oddziaływanie pośrednie polega na zmianie fizycznych i chemicznych właściwości środowiska pod wpływem drobnoustrojów. W ten sposób jedne gatunki drobnoustrojów mogą stwarzać nieodpowiednie lub korzystne dla innych warunki

Formy współzależności między organizmami dają się sprowadzić, ogólnie biorąc, do pozytywnych (symbiotycznych) lub antagonistycznych. 

Wśród układów pozytywnych wyróżniamy:

a. mutualizm (symbioza),
b. komensalizm,
c. protokooperację.
d. metabioza
e. synergizm

Mutualizmem nazywamy relację korzystną i konieczną dla obu partnerów. Cechy morfologiczne, fizjologiczne czy ekologiczne poszczególnych komponentów tworzących układ mutualistyczny mogą różnić się od cech organizmów wolno żyjących. Do mutualizmu może dochodzić między dwoma mikroorganizmami lub między mikroorganizmami a organizmem wyższym. Klasycznym przykładem pierwszego wariantu są porosty, u których współżycie glonów i grzybów doprowadziło do powstania nowej jednostki systematycznej. Przykładem współżycia między mikro- i makrosymbiontem jest układ rośliny motylkowej z bakteriami Rhizobium oraz mikoryza, w przypadku której partnerami są drzewa, krzewy czy rośliny zielne i odpowiednie grzyby.

Rozróżnia się mikoryzę endotroficzną (wewnętrzną), ektotroficzną (zewnętrzną) oraz pseudomikoryzę. W mikoryzie wewnętrznej strzępki grzybów wypełniają komórki kory pierwotnej korzenia, gdzie zwijają się w kłębuszki. W mikoryzie zewnętrznej strzępki tworzą dookoła korzenia opilśń, wrastając tylko w przestwory międzykomórkowe zewnętrznych warstw kory pierwotnej. W wypadku pseudomikoryzy grzyb obrasta korzeń, nie wnikając do jego wnętrza.

Większość organizmów mutualistycznych charakteryzuje pewne cechy wspólne:

a. wirulentność - zdolność do zasiedlania gospodarza,
b. podatność gospodarza na infekcję,
c. oporność na destruktywne działanie partnera,
d. efektywność obu partnerów w pełnionej przez siebie funkcji.

Komensalizm to forma zależności jednostronnej, a ściślej biorąc korzyści wynikającej dla jednego z partnerów układu, bez ponoszenia szkody przez drugiego. Korzyść ta wynika np. z możności użytkowania produktów wytwarzanych przez jedną ze stron układu, z wyczerpania ze środowiska tlenu, detoksykacji siedliska. Bardzo często przytaczanym przykładem komensalizmu są zależności między bakteriami przeprowadzającymi obie fazy nitryfikacji.

Protokooperacja jest formą obopólnej zależności między partnerami, jednak znacznie luźniejsza niż to ma miejsce w mutualizmie. Związek tego typu nie jest niezbędnym dla żadnej ze stron. Za przykład protokooperacji może posłużyć dostarczanie przez drobnoustroje celulolityczne źródła węgla i energii w postaci cukrów powstałych z rozkładu celulozy bakteriom wiążącym azot atmosferyczny. Te ostatnie z kolei zaopatruje drobnoustroje celulolityczne w azot. Obie grupy mikroorganizmów mogą jednak korzystać z innych źródeł węgla czy azotu.

Współżyciem symbiotycznym jest też metabioza. Polega ona na kolejnym rozwoju poszczególnych gatunków lub grup drobnoustrojów w środowisku. Każda kolejna grupa, wytwarzając określone metabolity i modyfikując środowisko (podłoże), stwarza korzystne warunki rozwoju dla swoich następców. Zjawisko metabiozy jest powszechne w świecie drobnoustrojów. Klasycznym przykładem są zmiany w mikroflorze mięsa oraz rozwój mikroorganizmów w mleku. Proces psucia mięsa zapoczątkowują paciorkowce, następnie rozwijają się G(+) pałeczki. W ostatnim etapie rozwijają się G(-) laseczki. 

Synergizm - współdziałanie prowadzące do takiej zmiany środowiska, jakiej oddzielnie żaden z mikroorganizmów nie może wywołać. Przykładem jest degradacja przez hodowle mieszane złożonych związków organicznych. W wyniku powstają związki chemiczne, których żaden z drobnoustrojów nie wytwarza samodzielnie. I tak na przykład Staphylococcus aureus i Salmonella parathypi B, rosnąc na podłożu z laktozą, fermentują ją z wytworzeniem gazu. Gdy natomiast na takie podłoże wysieje się oddzielnie pałeczkę duru rzekomego B, nie fermentuje ona w ogóle laktozy, natomiast gronkowiec złocisty rozkłada ją tylko z zakwaszeniem pożywki, bez wytworzenia gazu. Mechanizm synergistycznego działania jest w tym przypadku jasny. Staphylococcus rozkłada dwucukier laktozę, a Salmonella parathypi B, mając teraz do dyspozycji glukozę, fermentuje ją z wytworzeniem gazu i kwasu. 

Wśród typów współżycia antagonistycznego wyróżnia się:

a. konkurencję,
b. amensalizm,
c. drapieżnictwo,
d. pasożytnictwo.

Konkurencja prowadzi. do określonej selekcji w danym siedlisku. Odmienne są konsekwencje konkurencji między gatunkowej niż konkurencji w obrębie gatunku. Organizmy konkurują ze sobą o różne czynniki środowiska, w którym bytują, o pokarm, wodą, tlen, przestrzeń życiową. W siedliskach bogatych, i niezbyt gęsto zasiedlonych konkurencja jest ograniczona. O zdolności konkurencyjnej decydują w głównej mierze:

1. szybkie tempo wzrostu i związane z tym możliwość opanowania przestrzeni,
2. tolerancja na czynniki abiotyczne i biotyczne,
3. proste wymagania pokarmowe,
4. aktywność enzymatyczna,
5. produkcja substancji toksycznych dla innych drobnoustrojów.

Amensalizm to typ współżycia polegający na ograniczaniu rozwoju jednej populacji przez inną, która sama nie podlega żadnym zmianom. Ograniczenie rozwoju jest skutkiem działania wydzielanych do środowiska metabolitów. Wyróżnić można 3 grupy tak oddziałujących związków:

a. nieorganiczne, np. H₂S, H₂SO₄, CO₂;
b. proste związki organiczne: kwasy tłuszczowe, etanol;
c. związki o złożonej i zróżnicowanej budowie chemicznej, objęte nazwa antybiotyków.

Produkty metabolizmu zmieniając środowisko hodowlane, hamują wzrost drobnoustrojów lub powodują nawet ich śmierć. Przykładem może być kwas mlekowy wydzielany przez bakterie mlekowe, zakwaszający podłoże i hamujący rozwój bakterii gnilnych. Innym przykładem jest redukcja siarczanów do H₂S, który jest silną trucizną dla wszystkich drobnoustrojów, z wyjątkiem przeprowadzających ten proces bakterii z rodzaju Desulfovibrio. Następnym przykładem może być przykład drożdży których produkty metabolizmu takie jak lotne kwasy tłuszczowe i etanol hamują wzrost potencjalnych konkurentów. Antybiotyki są wytwarzane przez liczne drobnoustroje, zarówno grzyby, jak i bakterie. Wytwarzanie antybiotyków występuje szczególnie często u promieniowców. Większość antybiotyków stosowanych w terapii wytwarzają właśnie te drobnoustroje Statyczne bądź zabójcze działanie poprzez wydzielanie antybiotyków nosi nazwę antybiozy i jest specyficzną formą amensalizmu. W odróżnieniu od wymienionych uprzednio związków, antybiotyki działają w sposób wybiórczy i selektywny w niskich stężeniach. U podstaw hamującego czy letalnego efektu leży m.in. blokada syntezy białek, kwasów nukleinowych i ściany komórkowej.

Nazwę pasożyt daje się zwykle organizmowi, który rozwija się w komórce, tkance lub płynie ustrojowym innego, zwykle większego żywiciela (gospodarza), przynosząc mu szkodę. Gospodarz jest źródłem pokarmu dla patogenna. Niektóre gatunki pasożytnicze mogą bytować w przypadku braku żywiciela saprofitycznie i te noszą nazwę patogenów fakultatywnych, w odróżnieniu od bezwzględnych czyli obligatoryjnych. Przykładem pasożytnictwa w obrębie drobnoustrojów są układy bakterie - fagi; grzyby - bakterie mikolityczne.

Jeżeli jeden organizm żywi się drugim powodując jago śmierć, mówimy o drapieżnictwie. Przykładem tej formy współżycia są pierwotniaki odżywiające się bakteriami lub grzyby nicieniami. Rola ekologiczna drapieżnictwa, tak jak i pasożytnictwa, sprowadza się do ograniczenia ilości osobników pewnej populacji, pośrednio prowadząc do zmian jakościowych.

Część praktyczna

1. Antybioza

a) obserwacja płytek rysowych (antagonistyczne działanie promieniowców z rodz. Streptomyces na bakterie)

Zjawisko antybiozy w warunkach laboratoryjnych demonstrowane jest na przykładzie tzw. płytek rysowych na których wzdłuż rysy głównej wysiano szczep promieniowca z rodzaju Streptomyces, produkujący antybiotyk o działaniu przeciwbakteryjnym, a prostopadle wysiano rysowo szczepy bakterii testowych.

Na powierzchni zestalonej pożywki w płytce Petriego wysiewa się ezą przez środek (rysa główna) drobnoustrój, którego zdolność wytwarzania antybiotyków chcemy zbadać. Płytkę wstawia się następnie do cieplarki. W czasie inkubacji rozmnażający się drobnoustrój wytwarza antybiotyk, który dyfunduje do agaru. Im dalej od rysy głównej, tym stężenie antybiotyku jest mniejsze. Po okresie inkubacji (różnym dla różnych drobnoustrojów, np. dla bakterii 24 - 48 godz., dla promieniowców 6 dni w temp. 28^oC), gdy badany drobnoustrój osiągnie dobry wzrosty wysiewa się na tę samą pożywkę szczepy testowe. Szczepy testowe wysiewa się ezą wzdłuż tzw. rys bocznych pod kątem prostym do rysy głównej, zaczynając szczepienie w odległości 1-2 mm od rysy głównej. Płytkę wstawia się ponownie do cieplarki na 24 - 48 godz. i po tym czasie odczytuje się wynik doświadczenia.

Na podstawie pomiaru zaobserwowanych stref zahamowania wzrostu określa się wrażliwość wybranych bakterii. Metoda ta może służyć zarówno do określenia produkcji substancji antybiotycznych przez interesujący nas szczep, jak również do ustalenia widma danego antybiotyku. Otrzymana płytkę należy po obejrzeniu narysować, zaznaczając rysę główną, rysy boczne i strefy zahamowania wzrostu. Ponadto należy zmierzyć i zanotować wielkość stref zahamowania wzrostu.

b) obserwacja płytek z krążkami antybiotycznymi (działanie antybiotyków na bakterie).

Nasycone standaryzowaną ilością antybiotyków krążki bibuły (lub gotowe krążki z antybiotykiem) umieszcza się na powierzchni zestalonej pożywki agarowej z testowanym szczepem. Po inkubacji w cieplarce dokonuje się odczytu, mierząc strefy zahamowania wzrostu testowanego mikroorganizmu.

2. obserwacja płytek Fortnera z hodowlą Azotobactera i Clostridium pasteurianum.

Na płytce Petriego z wybiórczym, bezazotowym podłożem wysiano Azotobactera i Clostridium pasteurianum. Płytki zaklejono plasteliną w celu ograniczenia dostępu tlenu. Rozwój bakterii beztlenowych następuje po wyczerpaniu tlenu przez Azotobactera w utworzonej komorze.
Studenci rysują płytkę, opatrując rysunek komentarzem.

3. Mikoryza - obserwacja mikroskopowa korzeni sosny z ektomikoryzą (pow. 125x lub 250x).

Studenci otrzymują zakonserwowane w mieszaninie 70-proc. etanolu i gliceryny fragmenty korzeni mikoryzowych sosny, które oglądają pod pow. 125x lub 250x. W obserwacji należy zwrócić uwagę na charakterystyczne dla mikoryzy sosny dichotomiczne rozgałęzienia krótkich korzeni i strzępki grzybni wokół nich.

Temat II: Mikroflora owoców, warzyw i nasion.

Na powierzchni warzyw i owoców występują bakterie, drożdże i pleśnie z różnych gatunków. W skład tej mikroflory wchodzą nie tylko gatunki przystosowane do bytowania na tych produktach, lecz także drobnoustroje pochodzące z gleby, nawozów organicznych i wody. 

Mikroflora warzyw i owoców jest silnie zróżnicowana, zarówno pod względem ilościowym, jak i jakościowym. Zróżnicowanie to zależy w głównej mierze od rodzaju produktu. Czynnikiem decydującym jest jego skład chemiczny, głównie zawartość białka, tłuszczów i węglowodanów. Rozwój mikroflory zależy też od kwasowości, zawartości wody w produkcie, dostępu tlenu oraz od temperatury i wilgotności otoczenia. 

Skład jakościowy i ilościowy tej mikroflory zależy również od gatunku rośliny i bywa różny dla różnych jej części. Na przykład inne gatunki drobnoustrojów mogą występować w ryzosferze, a inne na częściach nadziemnych roślin (tzw. mikroflora epifityczna). Mikroflora ryzosfery, złożona z drobnoustrojów glebowych, zalety ad stosunków bio-fizyko-chemicznych w glebie (zawartość substancji organicznej, warunki tlenowe, odczyn i in.) oraz od składu wydzielin korzeniowych rośliny. Na mikroflorę epifityczną oddziałuje temperatura, wilgotność, stopień mikrobiologicznego zanieczyszczenia powietrza itp. W jej skład wchodzą gatunki stale zasiedlające (np. drożdżaki na powierzchni niektórych owoców czy kwiatów). Na roślinach może występować też mikroflora patogenna w stosunku do roślin (jest ona właściwie nieszkodliwa dla człowieka) i mikroflora patogenna w stosunku do człowieka. Na owocach stwierdzono m.in. obecność Staphylococcus aureaus, Vibrio comma, Shigella i Salmonella. Zabiegi chemizacji uprawy roślin maje niewątpliwy wpływ na mikroflorę tak ryzosfery; jak i epifityczną.

Ziemniaki, buraki, marchew, kapusta i szpinak są dobrym podłożem, przede wszystkim dla rozwoju bakterii. Spotyka się tlenowe i beztlenowe bakterie przetrwalnikujące wywołujące gnicie, fermentację mlekową i masłową oraz E. coli, niektóre gatunki z rodzajów Micrococcus i Serratia. Stwierdza się też drożdże i pleśnie.. Na powierzchni owoców występują najczęściej grzyby. Są to drożdże z rodzaju Saccharomyces, Pseudosaccharomyces i Mycoderma oraz pleśnie - Penicillium, Mucor, Rhizopus. Rozwojowi drożdży sprzyja duża zawartość cukrów, a rozwojowi pleśni - duża zawartość kwasów organicznych. Na owocach oprócz drożdży i pleśni występują bakterie z rodzaju Micrococcus i Bacillus oraz prawie zawsze pałeczki z grupy coli. Na owocach psujących się (fermentujących) rozwijają się bakterie octowe (w cyklu metabolicznym po drożdżach) oraz bakterie mlekowe i heteromlekowe.

Drobnoustroje występują nie tylko na powierzchni, ale również czasami wewnątrz tkanki. Wynikiem działalności bakterii pektolitycznych wewnątrz tkanki jest m.in. mięknięcie kiszonych ogórków. W komorach nasiennych zdrowych optycznie jabłek wykryto Penicillium expansum, niektóre gatunki z rodzajów Monilia i Mucor mucedo.
Rozwój zespołu drobnoustrojów na warzywach i owocach zależy też w znacznym stopniu od sposobu ich zbioru i przechowywania. Nadmiar wilgotności albo uszkodzenia warzyw i owoców szczególnie sprzyjają rozwojowi drobnoustrojów.

Biochemiczna aktywność mikroorganizmów rozwijających się na uszkodzonych warzywach i owocach przejawia się różnym stopniem ich zepsucia. Zepsucie to jest następstwem zmian, jakie mogą zachodzić głównie na skutek rozkładu białek, tłuszczów i węglowodanów. Rozkład ten powoduje nagromadzenie się kwasów organicznych, alkoholi, aldehydów itp. Psucie się warzyw i owoców przejawia się makroskopowo zmianą konsystencji, barwy i zapachu, oznakami gazowania oraz występowaniem na ich powierzchni kożucha powstałego w wyniku silnego rozwoju drobnoustrojów. Przeprowadzenie obserwacji mikroskopowych umożliwia poznanie składu zespołu tych organizmów. Zmiany zachodzące w warzywach i owocach po ich uszkodzeniu można poznać obserwując po różnym czasie miazgę sporządzoną z tych produktów.

Biochemiczna działalność drobnoustrojów występujących na warzywach i owocach, przy odpowiednim jej ukierunkowaniu, może odgrywać znaczną rolę w przerobie tych produktów. Ma to miejsce przy zakiszaniu niektórych warzyw, jak kapusta i ogórki. W produkcji win z owoców nie należy jednak dopuszczać do namnożenia się w moszczu drożdży występujących na owocach poddanych przerobowi, ponieważ są to drożdże "dzikie", a więc drożdże, które nie dają wina o odpowiednich właściwościach organoleptycznych. Dlatego też moszcz owocowy doszczepia się drożdżami "szlachetnymi".

Część praktyczna

1. Obserwacja makroskopowa hodowli drobnoustrojów wyrosłych ze skrawków wybranych owoców, warzyw i nasion na agarze odżywczym i podłożu wg Martina.

2. Obserwacja mikroskopowa mikroflory owoców, warzyw i nasion w preparacie odciskowym barwionym metodą prostą z hodowli na agarze odżywczym (pow. 1250).

Z kolonii wyrosłych na agarze odżywczym robimy preparat odciskowy: Czyste szkiełko przedmiotowe przyciskamy do powierzchni podłoża i zdejmujemy, podważając pincetą. Po wysuszeniu i utrwaleniu w płomieniu barwimy preparat metoda Grama. Oglądamy pod obiektywem imersyjnym jak największą liczbę pól widzenia, zwracając uwagę na występowanie przetrwalnikujęcych laseczek gramdodatnich, pałeczek gramdodatnich i gramujemnych, ziarniaków oraz drożdżaków. Dostrzeżona drobnoustroje rysujemy, notując, które spośród nich przeważają w preparacie.

3. Obserwacja mikroskopowa mikroflory owoców, warzyw i nasion w preparacie w kropli płaskiej z hodowli na podłożu wg Martina (pow. 500x).

Grzyby rosnące na podłożu wg Martina mikroskopujemy w preparatach w kropli płaskiej pod powiększeniem 500x. Szukamy fragmentów grzybni i organów rozmnażania charakterystycznych dla przedstawicieli poszczególnych klas grzybów. Rysujemy obrazy mikroskopowe i notujemy spostrzeżenia.

Literatura wykorzystana przy opracowaniu ćwiczenia XIV

• Chruściak E., Kulińska D., Romanowa I., Russel S. - Ćwiczenia z mikrobiologii. SGGW

• Duszkiewicz - Reinhard W. i inni - Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej. Wydawnictwo SGGW.

• Gołębiowska J. - Mikrobiologia rolnicza - Państwowe wydawnictwo Rolnicze i Leśne. Warszawa.

• Jabłoński L. - Podstawy mikrobiologii lekarskiej. - Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich.

• Kunicki - Goldfinger W. - Życie bakterii.

• Nowak A. i inni - Przewodnik do ćwiczeń z mikrobiologii. - Wydawnictwo AR w Szczecinie.

• Różalski A. - Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. Wydawnictwo Uniw. Łódzkiego

• Schlegel H. G. - Mikrobiologia ogólna. Wydawnictwo Naukowe PWN.

---