Materiał biologiczny wykorzystywany w badaniach cytogenetycznych (diagnostyka przedimplantacyjna):
- komórka z zarodka (zapłodnienie pozaustrojowe)
- komórki szpiku kostnego - wykorzystywane w diagnostyce białaczek
Do analizy kariotypu:
- 10 ml krwi od osoby dorosłej, 2-5 ml krwi od noworodka
- u noworodka z wadami wrodzonymi, który zmarł zanim zdołano pobrać krew na badanie kariotypu, można jeszcze jak najwcześniej (ewentualnie do 1 godz po zgonie) pobrać krew bezpośrednio z serca
- krew pobierana jest do próbówki z heparyną (nie z EDTA)- heparyna jest czynnikiem, który zapobiega krzepnięciu krwi
- krew powinna być dostarczona jak najszybciej do laboratorium cytogenetycznego
- jeżeli transport jest przewidziany na dzień następny, próbówki z krwią przechowujemy w lodówce w temp +4oC
- próbówki z krwią NIE zamrażamy!!!
- próbówki z krwią można wysyłać szybką pocztą
- w przypadku pobierania krwi do badania cytogenetycznego pacjent nie musi być specjalnie przygotowany
- w badaniu cytogenetycznym istotny jest natomiast sposób pobierania (aseptyczność) i przechowywania (temp) materiału biologicznego
- dla materiału biologicznego sterylne pobranie, odp przechowywanie i czas dostarczenia do laboratorium ma bezpośredni wpływ na powodzenie hodowli i uzyskane wyniki
- materiał biologiczny uzyskany po poronieniu (kosmówka) który jest przeznaczony do badań cytogenetycznych przechowujemy w specjalnie przeznaczonym do tego płynie hodowlanym w temp +37oC
- jeżeli przechowywanie w takiej temp jest niemożliwe przechowujemy w temp pokojowej (najlepiej dodatkowo zabezpieczony przed ochłodzeniem) a nastepnie jak najszybciej dostarczamy do laboratorium cytogenetycznego. Nie przechowujemy w lodówce!!
- płyn hodowlany bez materiału biologicznego przechowujemy w lodówce w +4oC, a na 1-2 godz przed umieszczeniem kosmówki pozostawiamy do ogrzania przynajmniej w temp pokojowej
DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA
W zależności od rodzaju kolekcjonowanych tkanek do ekstrakcji DNA wykorzystuje się:
- próbówki próżniowe z antykoagulantem (krew)
- jałową watę (wymazówka)
- bibułę nasączoną konserwantem (karty FTA) (krew, komórki nabłonka(mocz, ślina) i sperma)
- pojemnik z roztworem soli fizjologicznej (kał)
- szczelne woreczki foliowe (tkanki miękkie i twarde)
- papierowe koperty (włosy, etc)
Najlepszy materiał wyjściowy do ekstrakcji DNA u zwierząt - krew obwodowa:
- pobieranie i przechowywanie - próbówki próżniowe z antykoagulantem (sól sodowa lub potasowa kwasu wersetowego- EDTA)
- inne antykoagulanty- można stosować pod warunkiem że nie będą interferowały w nastepnych etapach pracy z DNA
Materiały biologiczne najcześciej wykorzystywane do izolacji DNA:
I. W przypadku zwierząt ( w tym człowieka):
- tkanki miękkie pozyskiwane post mortem( mięśnie poprzecznie prążkowane, skóra, serce, wątroba, nerka i inne)
- tkanki twarde( substancja gąbczasta kości, szpik, chrząstki)
-materiał biologiczny pozyskany przyżyciowo w sposób nieinwazyjny( komórki nabłonka(wymaz z błosy śluzowej jamy ustnej), włosy z cebulkami))
W badaniach zwierząt można również używać materiału biologicznego wykorzystywanego w genetyce człowieka
- w diagnostyce prenatalnej - kom kosmówki
- z hodowli komórek płynu owodniowego - w 15 tyg ciąży
II. W badanich medyczno-sądowych
1. materiały biologiczne dobrze widoczne: plamy krwawe, plamy nasienia, włosy, odchody, kości, wyskrobiny spod paznokci i inne tkanki
2. wysoką czułość technologii DNA pozwala otrzymać profile DNA nawet ze śladów kontaktowych niewidocznych, przypuszczalnie obecnych na przedmiotach czy urządzeniach
- odciski palców
- smugi na ciele
- Ślina na- ustnikach papierosów, gumie do żucia, szczoteczce do zębów, pojemnikach do picia
- wydzielina z nosa, pot (chusteczki higien, odzież)
- materiał wydalony na skutek kichania, kasłania
- ślady małżowiny usznej
3. w przypadku gwałtów materiał genetyczny można uzyskać np. ze:
- śladów po ugryzieniu
- wymaz spod napletka
- wymazu z pochwy
4. materiał zdegradowany na skutek długotrwałego narażenia na czynniki środowiskowe
5. włosy cebulek
6. stare kości
7. materiał biologiczny pochodzący z katastrof
- identyfikacja ofiar zamachów terrorystycznych
- identyfikacja ofiar ekshumowanych z grobów masowych
Materiały biologiczne wykorzystywane do izolacji DNA w archeologii molekularnej:
- w przypadku materiałów muzealnych i skamielin do badań starożytnego DNA wykorzystuje się czaszkę, kości i zęby
Badania medyczno-sądowe Laboratorium
1.laboratorium wykonujące badania dla potrzeb medyczno -sądowych musi spełniać wszystkie warunki bezpieczeństwa pracy
- z materiałem biologicznym
- jak również pracy z materiałem unikatowym, którego powtórne uzyskanie jest często niemożliwe
- przede wszystkim nie wolno dopuścic do zanieczyszczenia laboratorium DNA
Diagnostyka molekularna
- po pobraniu uzyskany materiał należy przekazać jak najszybciej do laboratorium molekularnego
- w przypadku kiedy materiał nie może być od razu przekazany do laboratorium można go przechowywać w temp +4oC przez kilka dni. Jeżeli jednak materiał nie będzie poddany izolacji w krótkim czasie należy go zamrozić i przechowywać w temp -20 oC lub -80 oC
- po izolacji DNA z tkanki, nie ma żadnych ograniczeń czasowych w przypadku przechowywania DNA w stanie zamrożonym (-20 oC lub -80 oC), a w temp +4 oC może być przechowywany przez kilka nastepnych miesięcy
- można go także przesyłać szybko pocztą w temp pokojowej ( przypadku długotrwałego transportu zaleca się jednak umieszczenie preparatu w pojemniku z suchym lodem)
- jakość wyizolowanego preparatu DNA zależy w dużym stopniu od prawidłowego, sterylnego pobrania materiału biologicznego, przechowywania w odp temp, oznaczenia próbek i transportu. Jakość materiału przekłada się na wynik badań molekularnych
Podst zalecenia są następujące:
1. Wszystkie etapy pracy powinny być wykonywane w fartuchach labolatoryjnych
2. praca w jednorazowych rękawiczkach
3. praca w okularach ochronnych
4. praca w maskach ochronnych gdy mamy do czynienia szkodliwymi odczynnikami
5. każde nowe postepowanie powinno być wykonywane na stole laboratoryjnym
6. trzeba znać zasady prawidłowego pipetowania, aby nie doprowadzic do zafałszowania wyniku jak również do zanieczyszczenia pipety
7. składanie reakcji należy wykonywać pod boksem laboratoryjnym
8. sprzęt laboratoryjny, szczególnie wirówki i wstrząsarki należy często czyścić
9. należy używać oddzielnych zestawów pipet do izolacji i amplifikacji DNA
Przyczyny błędów laboratoryjnych- potencjalne źródła zanieczyszczeń
- egzogenny DNA człowieka znajdujący się w otoczeniu
- wzajemne zanieczyszczenie próbek, wynikające z ich sąsiedztwa zarówno w procesie izolacji DNA, jak i końcowych rozdziałów elektroforetycznych, w których może dojsc do „przelewek” między sąsiadującymi kieszonkami
- brak każdorazowej zmiany końcówki pipety
- zanieczyszczenie próbki produktem PCR z poprzednich reakcji wykonanych w laboratorium to najtrudniejsze do opanowania zanieczyszczenie, szczególnie gdy produktem PCR zostaną zanieczyszczone odczynniki do tej reakcji takie jak bufor nukleotydy czy polimeraza
NIETYPOWE ŹRÓDŁA DNA
- biologiczne materiały kopalne zawierające szczątki sprzed wielu tysięcy lat
*w przypadkach gdy szczątki organizmow przetrwały w jałowych warunkach lub w zamknięciu , na przykład w lodach lub w bursztynie
*kontaminacja obcym DNA
- odchody włosy i mocz
*gatunki trudne do schwytania (wilki, rysie, wombaty)
-nasienie pobierane z błon jaj ptasich
-analiza DNA zawartości przewodów pokarmowych biedronek i złotooków pozwoliła z kolei określić jakimi gatunkami mszyc odżywiają się te owady
-analiza DNA okazów muzealnych może być szczególnie przydatna w badaniach nad historia zmian w rozmieszczeniu gatunków lub lokalnych ekstynkcji ich populacji
-analiza DNA grzybów znajdowanych w lodach sprzed 14 tysięcy lat może dostarczyć danych na temat ich ekologii i ewolucji
CEL IZOLACJI
-uzyskanie z maksymalna wydajnością wysokoczasteczkowego DNA, przy jednoczesnym oczyszczeniu preparatu DNA z białek i inhibitorów enzymów które mogą utrudniać następne etapy pracy z DNA
METODY IZOLACJI DNA( bakterie, komorki roślin, zwierzat, w tym człowieka)
- izolacja dna z zastosowaniem fenolu i chloroformu celem odbialczenia preparatow
- izolacja dna przebiegajaca poprzez wysolenie bialek z lizatow komorek
-izolacja dna poprzez związanie z nosnikiem , odmycie zanieczyszczen i uwolninie dna
IZOLACJE DNA MOŻNA PODZIELIC NA CZTERY ETAPY:
- dezintegracja probek do jak najdrobniejszych struktur;
-liza blon komorkowych, jadrowyh i organellowych;
- usuniecie bialek, RNA oraz innych substancji nieorganicznych
-wytracenie DNA
DEZINTEGRACJA PROBEK :
- metody mechaniczne ( np.: rozcieranie z tlenkiem glinu, z perełkami szklanymi lub homogenizacja w homogenizatorze mechanicznym)
- metody fizyczne (np.: zamrazanie i rozmrazanie prob w ciekłym azocie)
- metody chemiczne ( wykorzystuja rozpuszczalniki chemiczne np. fenol lub detergenty czyli substancje obniżające napiecie powierzchniowe wody np. SDS, SARKOZYL, TRYTON-X100)
METODY OCZYSZCZANIA DNA Z BIALEK I INNYCH SUBSTANCJI:
-wysalanie (chlorek sodu)
-ekstrakcja organicznymi rozpuszczalnikami (fenol, chloroform, alkohol izoamylowy)
-wirowanie w gradiencie chlorku cezu;
-jonowymienna chromatografia;
-absorbcja na dwutlenku krzemu;
-RNA usuwany enzymatycznie przez inkubacje Rnazą wolną od Nadzy. DNA odzyskiwany jest przez wytracenie alkoholem etylowym lub izopropylowym.
NAJBARDZIEJ POPULARNE TECHNIKI ROZDZIAŁÓW MAKROCZĄSTECZEK TECHNIKI ELEKTROFORETYCZNE- POZWALAJĄ OSIĄGNĄĆ BARDZO WYSOKI POZIOM ROZDZIELCZOŚCI
- zjawisko elektroforezy zachodzi dzieki obecności pola elektryczngo
-termin elektroforeza stosuje się do określania ruchu jonow i naladowanych czasteczek w polu elektrycznym
-elektroforeza jest zjawiskiem elektrokinetycznym w którym pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego przemieszczaja się makrocząsteczki obdarzone niezrównoważonym ładunkiem elektrycznym.
TECHNIKĘ ELEKTROFOREZY WYKORZYSTUJE SIĘ DO ROZDZIALU W POLU ELEKTRYCZNYM BIALEK ORAZ FRAGMENTOW DNA
-rozdzial elektroforetyczny ujawnia formy rozniace się ruchliwością która zalezy od:
*wielkości i ładunku elektrycznego czasteczki fragmentu DNA (lub bialka)
*jej konformacji przestrzennej (kształtu)
-parametrow fizycznych rozdzialu ( napiecie, temperatura, stężenie nosnika - zelu (opory ruchu środowiska), właściwości elektrolitu tj. jego sily jonowej oraz wartości pH, itp)
SZYBKOŚĆ ELEKTROFORETYCZNEJ MIGRACJI DNA W ZELU ZALEZY OD:
-masy cząsteczkowej DNA- czasteczki liniowe migruja w zelu z szybkością odwrotnie proporcjonalna do log10 z ich masy cząsteczkowej
-konformacji DNA- czasteczki o takiej samej masie i w takim samym zelu wędrują z rozna prędkością
-stezenia agarozy
-natezenia pola elektrycznego
-skladu buforu do elektroforezy
ŻEL POLIAKRYLOAMIDOWY (PAA) A ŻEL AGAROZOWY
- akryloamid pozwala przygotowac nosniki o bardzo gestym usieciowaniu i niewielkich porach co umozliwia separacje polinukleotydow o wielkości 5-2000 pz.
-nosniki agarozowe charakteryzuja się znacznie uboższym sieciowaniem i większymi porami. Pozwala to na separacje znacznie większych fragmentow kwasow nukleinowych(50-30000 pz.)
BUFORY STOSOWANE DO ELEKTROFOREZY DNA (skład buforu na 1 litr)
- bufor Tris - octanowy - TAE ( 4,98 g Tris; 1,142 ml 99 % kwasu octowego, 2 ml 0,5MEDTA, pH8,0)
-bufor Tris - boranowy - TBE ( 10,8 g Tris; 5,5 g kwasu borowego; 4 ml 0,5 MEDTA, pH 8,0)
-bufor Tris-fosforanowy - TPE ( 10,8 g Tris; 1,55 ml 85% kwasu fosforowego; 4 ml 0,5M EDTA, pH 8,0)
-bufor alkaliczny ( 5 ml 10N NaOH; 2 ml 0,5M EDTA, pH 8,0)
bufory przygotowuje się w postaci steznonej ( 5-25 razy, najczęściej 10 razy)
ZE WSZGLEDU NA SPOSÓB UMIESZCZANIA NOCNIKA ELEKTROFORETYCZNEGO MOŻNA WYROZNIC:
- elektrofaze kapilarna okreslana skrotem HCPE
-elektrofaze pionowa
-elektrofaze pozioma
WARTOŚĆ pH BEDACA MIARA STĘŻENIA JONOW WODOROWYCH W ELEKTROLICIE MA SZCZEGÓLNIE ISTOTNE ZNACZENIE W ODNIESIENIU DO BIALEK I PEPTYDOW
-bialka i peptydy maja właściwości amfoteryczne ( dwufunkcyjne) sa obdarzone wypadkowym ładunkiem elektrycznym dodatnim lub ujemnym w zależności od warunkow środowiskowych
- ponieważ kwasy nukleinowe nie maja właściwości amfoterycznych ich separacja jest znacznie prostsza. Kwasy nukleinowe obdarzone sa trwałym ładunkiem ujemnym w warunkach elektrolitow stosowanych do elektroforezy, ze względu na obecność grup fosforanowych.
NOSNIK ELEKTROFORETYCZNY ( bibula, azotan, celulozy agarowa, poliakryloamid i inne)
- przyczynia się do lepszej separacji makrocząsteczek
- szczególne zastosowaie porowatych nośników ( agarowa, poliakryloamid) poteguje efekt separacji przez dodatkowe frakcjonowanie makrocząsteczek na zasadzie sita molekularnego
-żele agarozowe i poliakryloamidowe maja postac przestrzennie usieciowionych struktur
PRZYGOTOWANIE PROBEK DO ELEKTROFOTOREZY
- zalecanym sposobem postepowania jest obciążanie i zabarwienie probki dobrze rozpuszczalna substancja pozbawiona ładunku elektrycznego
* dodatek taki pozwala na umieszczenie probki bezpośrednio na powierzchni zelu bez zbędnego mieszania jej z elektrolitem . probka powinna być zabarwiona tak aby można było obserwowac jej nanoszenie na nosnik . eliminuje to możliwość pomyłkowego naniesienia dwóch lub wiecej probek na ta sama ścieżkę rozdzialu
- dla ułatwienia obserwacji do probki można dodac błękitu bromofenolu, cyjanoksylenu lub oranżu G.
MARKERY WIELKOŚCI
-do określenia wielkości analizowanych fragmentow należy zastosowac wzorce o znanej wielkości mas cząsteczkowych
BARWIENIE ŻELI- BROMEK ETYDYNY- SILNY MUTAGEN!!! -czynnik interkalujacy miedzy pary zasad DNA i fluoryzujący po aktywacji promieniowaniem UV
OCENA ELEKTROFORETYCZNA DNA - JAKOSCIOWA
-żel do elektroforezy - przygotowanie
* odważyć 1kg agarowy,
* dodac 100 ml buforu TBE 1 x stężonego,
*podgrzewac do całkowitego rozpuszczenia
* ostudzic do temp. 60 st C
*dodac 10 μl roztworu bromku etydyny,
* wymieszac i wylac zel
OCENA SPEKTROFORETYCZNA dna - ILOSCIOWA
Przygotowanie prób:
- do 1900 μl H2O destylowanej dodać 100 μl wyizolowanej próby
OCENA SPEKTROFORETYCZNA DNA - ILOSCIOWA
Wykonanie pomiarów
-pomiaru absorbancji badanej próby dokonuje się przy długości fali 260 nm i 280 nm wobec próby ślepej która stanowi woda destylowana lub roztwór w którym rozpuszczono wyizolowane DNA
OCENA SPEKROFORETYCZNA DNA - ILOSCIOWA
- zawartość DNA w roztworze wyrażony w μg/ml liczy się zgodnie ze wzorem :
A260 x 50 x R gdzie:
-50 - stały współczynnik ( 1,0 jednostka absorbancji = 50 μg DNA dwuniciowego)
-R - rozcieńczenie
-czystosc wyizolowanego DNA obliczna jest ze stosunku absorbancji 260 nm/280 nm.
- wartość 1,5 - w badanym preparacie DNA jest 50 % białka
- poniżej 1,6 - preparat zanieczyszczony bialkami
- 1,6-1,8 uznaje się za poprawne
-powyzej 1,8 - preparat zanieczyszczony odczynnikami do izolacji
OCENA ELEKTROFORETYCZNA DNA - JAKOSCIOWA
- przygotowanie prób do elektroforezy
*do 2 μl buforu obciążającego dodać 10 μl roztworu DNA.