Wykładowca: mgr A. Szczepanek
Biochemia - ćwiczenia 7-8.01.2011
(piątek - sobota)
Opracowane na podstawie podręcznika Hames'a i Hooper'a - Biochemia, krótkie wykłady; oraz źródeł Internetowych.
Temat: Białka
Białko to liniowa sekwencja aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi. Wiązanie peptydowe jest wiązaniem kowalencyjnym miedzy grupą a-aminową jednego aminokwasu i grupą a-karboksylową kolejnego. Wiązanie peptydowe ma częściowo charakter wiązania podwójnego i prawie zawsze występujew konfiguracji trans. Konformacja szkieletu łańcucha polipeptydowego jest determinowana przez wartości kątów rotacji wiązań Ca-N i Cy-C występujących w jego każdej reszcie aminokwasowej. Przestrzennie dozwolone wartości można odczytać z wykresu Ramachandrana. Kiedy dwa aminokwasy są połączone wiązaniem peptydowym, tworzą dipeptyd. Przyłączanie kolejnych aminokwasów prowadzi do powstania oligopeptydów i polipeptydów.
Aminokwasy
Wszystkie białka są zbudowane z 20 standardowych aminokwasów. W typowym aminokwasie centralnie położony atom węgla (C) jest połączony z pierwszorzędową grupą aminową, grupą karboksylową, atomem wodoru i łańcuchem bocznym. Prolina stanowi pod tym względem wyjątek, ponieważ zawiera drugorzędową grupę aminową.
Aminokwasy hydrofobowe:
Alifatyczne
Egzogenne
Aromatyczne
Zawierające atom siarki
Aminokwasy polarne
Polipeptydy - polimer zawierający w cząsteczce dużą liczbę reszt aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi -CO-NH-. Polipeptydy zawierające (umownie) ponad sto reszt aminokwasowych nazywa się białkami.
Wiązanie peptydowe - powstaje pomiędzy grupą karboksylową jednego aminokwasu a grupą aminową drugiego. R1 i R2 - reszty aminokwasowe
Struktura białek
Struktura pierwszorzędowa
Liniowa sekwencja aminokwasów połączonych ze sobą za pomocą wiązania peplydowego jest nazywana strukturą pierwszo rzędową białka. W strukturze pierwszorzędowej białka zawierają się również kowalencyjne wiązania dwusiarczkowe między resztami cysteiny.
Struktura drugorzędowa
Struktura drugorzedowa białka dotyczy regularnego pofałdowania rejonów łańcucha polipeptydowego. Najczęściej występującymi typami struktury drugorzędowej są α helisa i struktura ß. α Helisa stanowi cylindryczne, spiralne ułożenie aminokwasów w łańcuchu polipeptyd owym, utrzymywane dzięki wiązaniom wodorowym, przebiegającym równolegle do osi helisy. W strukturze ß wiązania wodorowe powstają między przylegającymi częściami polipeptydu, które są ułożone w tym samym kierunku (równoległa struktura ß) lub w przeciwnych kierunkach (antyrównoległa struktura ß). Zwroty ß odwracają kierunek przebiegu łańcucha polipeptydowego i często łączą końce antyrównoległych struktur ß.
Struktura trzeciorzędowa
Struktura trzeciorzędowa to przestrzenne ułożenie wszystkich aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Ta biologicznie aktywna, narywna konformacja jest utrzymywana dzięki szeregowi wiązań niekowalencyjnych.
Struktura czwartorzędowa
W przypadku białek, w których skład wchodzi więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy, występuje struktura czwartorzędowa. Dotyczy ona przestrzennego ułożenia polipeptydowych podjednostek i natury oddziaływań miedzy nimi.
Funkcje białek
• kataliza enzymatyczna - od uwadniania dwutlenku węgla do replikacji chromosomów
• transport - hemoglobina, transferyna
• magazynowanie - ferrytyna
• kontrola przenikalności błon - regulacja stężenia metabolitów w komórce
• ruch uporządkowany - skurcz mięśnia, ruch - np. aktyna, miozyna
• wytwarzanie i przekazywanie impulsów nerwowych
• bufory
• kontrola wzrostu i różnicowania
• immunologiczna - np. immunoglobuliny
• budulcowa, strukturalna - np. &-keratyna, elastyna, kolagen
• przyleganie komórek (np. kadheryny)
• regulatorowa - reguluje przebieg procesów biochemicznych - np. hormon wzrostu, insulina.
Ze względu na budowę i skład, dzielimy białka na proste i złożone.
Białka proste (proteiny) zbudowane są wyłącznie z aminokwasów. Dzielimy je na następujące grupy:
1. protaminy - są silnie zasadowe, charakteryzują się dużą zawartością argininy oraz brakiem aminokwasów
zawierających siarkę. Są dobrze rozpuszczalne w wodzie. Najbardziej znanymi protaminami są: klupeina, Salmina, cyprynina, ezocyna, gallina.
2. histony - podobnie jak protaminy są silnie zasadowe i dobrze rozpuszczają się w wodzie; składniki jąder komórkowych (w połączeniu z kwasem deoksyrybonukleinowym), czyli są obecne także w erytroblastach. W ich skład wchodzi duża ilość takich aminokwasów jak lizyna i arginina.
3. albuminy - białka obojętne, spełniające szereg ważnych funkcji biologicznych: są enzymami, hormonami i innymi biologicznie czynnymi związkami. Dobrze rozpuszczają się w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli. łatwo ulegają koagulacji. Znajdują się w tkance mięśniowej, osoczu krwi i mleku.
4. globuliny - w ich skład wchodzą wszystkie aminokwasy białkowe, z tym że kwas asparaginowy i kwas glutaminowy w większych ilościach; w odróżnieniu od albumin są źle rozpuszczalne w wodzie, natomiast dobrze w rozcieńczonych roztworach soli; posiadają podobne właściwości do nich. Występują w dużych ilościach w płynach ustrojowych i tkance mięśniowej.
5. prolaminy - są to typowe białka roślinne, występują w nasionach. Charakterystyczną właściwością jest zdolność rozpuszczania się w 70% etanolu.
6. gluteliny - podobnie jak prolaminy - to typowe białka roślinne; posiadają zdolność rozpuszczania się w rozcieńczonych kwasach i zasadach.
7. skleroproteiny - białka charakteryzujące się dużą zawartością cysteiny i aminokwasów zasadowych oraz kolagenu i elastyny, a także proliny i hydroksyproliny, nierozpuszczalne w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli. Są to typowe białka o budowie włóknistej, dzięki temu pełnią funkcje podporowe. Do tej grupy białek należy keratyna.
Białka złożone (proteidy):
1. chromoproteiny - złożone z białek prostych i grupy prostetycznej - barwnika. Należą tu hemoproteidy (hemoglobina, mioglobina, cytochromy, katalaza, peroksydaza)
zawierające układ hemowy oraz flawoproteiny.
2. fosfoproteiny - zawierają około 1% fosforu w postaci reszt kwasu fosforowego. Do tych białek należą: kazeina mleka, witelina żółtka jaj, ichtulina ikry ryb.
3. nukleoproteiny - składają się z białek zasadowych i kwasów nukleinowych. Rybonukleoproteimy są zlokalizowane przede wszystkim w cytoplazmie: w rybosomach,
mikrosomach i mitochondriach, w niewielkich ilościach także w jądrach komórkowych, a poza jądrem tylko w mitochondriach. Wirusy są zbudowane prawie wyłącznie z
nukleoproteidów.
4. lipidoproteiny - połączenia białek z tłuszczami prostymi lub złożonymi, np. sterydami, kwasami tłuszczowymi. Lipoproteidy są nośnikami cholesterolu (LDL, HDL, VLDL). Wchodzą na przykład w skład błony komórkowej.
5. glikoproteiny - ich grupę prostetyczną stanowią cukry, należą tu m.in. mukopolisacharydy (ślina). Glikoproteidy występują też w substancji ocznej i płynie torebek stawowych.
6. metaloproteiny - zawierają jako grupę prostetyczną atomy metalu (miedź. cynk. żelazo, wapń. magnez, molibden, kobalt). Atomy metalu stanowią grupę czynną wielu
enzymów.
DNA - Kwas deoksyrybonukleinowy (dawn. kwas dezoksyrybonukleinowy), w skrócie DNA (od ang. Deoxynbonucleic acid) - wielkocząsteczkowy organiczny związek chemiczny należący do kwasów nukleinowych. Występuje w chromosomach i pełni rolę nośnika informacji genetycznej organizmów żywych.
Budowa DNA
DNA jest liniowym, nierozgałęzionym biopolimerem, dla którego monomerem są nukleotydy. Nukleotydy zbudowane są z: pięciowęglowego cukru deoksyrybozy, którego grupa hydroksylowa znajdująca się przy ostatnim atomie węgla jest zestryfikowana resztą fosforanową, a pierwszy atom węgla połączony jest wiązaniem N-glikozydowym z jedną z czterech zasad azotowych: adeniny A i guaniny G (zasady purynowe) oraz cytozyny C i tyminy T (zasady pirymidynowe).
Powszechnie spotykaną modyfikacją DNA jest występowanie 5-metylocytozyny (m5C) w wyniku metylacji cytozyny. W DNA niektórych wirusów, np. bakteriofagów PBS2. zamiast tyminy występuje uracyl, (U), tworząc nukleozyd Z-deoksyurydynę^'. 2-Deoksyurydyna powstaje też w wyniku deaminacji C do U.
W skład cząsteczki DNA zwykle wchodzą dwa łańcuchy (DNA dwuniciowy). które biegną antyrównolegle (tzn. koniec jednego jest dokładnie naprzeciw początku drugiego). Łańcuchy owijają się wokół wspólnej osi i tworzą tzw. prawoskrętną podwójną helisę. Reszty cukrowe i fosforowe, połączone ze sobą wiązaniem fosfod i estrowym, znajdują się na zewnątrz helisy, natomiast zasady skierowane są do wnętrza i tworzą pary zasad połączone według wzoru:
A-T (A-U)
G-C
T-A (U-A)
C-G
Zasady połączone są wiązaniami wodorowymi. Cząsteczki DNA mogą być bardzo długie. U Homo sapiens ich długość (po "rozkręceniu chromosomów") dochodzi w sumie do 2 m, gdzie najdłuższa cząsteczka ma 23 cm. W ścisłym skręceniu DNA do postaci chromosomu biorą udział białka histonowe lub niehistonowe. Każda z nici DNA ma na jednym końcu (oznaczanym jako koniec 5'). przy ostatnim nukleotydzie wolną grupę fosforanową przy węglu 5' deoksyrybozy, a na drugim końcu (oznaczanym jako koniec 3') ostatni nukleotyd posiada wolną grupę hydroksylową przy węglu 3' deoksyrybozy. Ze względu na to. że helisa dwóch nici DNA jest spleciona w ten sposób, że jedna z nici zaczyna się od końca 5' a druga od końca 3", mówi się, że obie nici są względem siebie anty równoległe.
Łańcuch nici DNA zawiera informację genetyczną o kolejności aminokwasów w białkach kodowaną w postaci trójek nukleotydowych odpowiadających odpowiednim aminokwasom podczas syntezy białka. Nazywamy to kodem genetycznym. Po "rozpakowaniu" z chromosomów, cząsteczka ludzkiego DNA miałaby około 180 cm.
Przestrzenna budowa DNA
Cząsteczka DNA składa się z 2 owiniętych wokół siebie łańcuchów polinukleidowych, co tworzy strukturę podwójnej helisy (jako pojedynczy łańcuch DNA występuje tylko u niektórych wirusów). Nici ułożone są względem siebie antyrównolegle - naprzeciw końca 5' (z wolnym 5-tym atomem węgla -dezyksorybozy) jednej nici znajduje się koniec 3' (z wolnym 3cim atomem węgla) drugiego łańcucha polinukleidowego.
W helisie DNA owinięte wokół siebie są dwie nici DNA, których zasady są skierowane do wnętrza helisy, a rdzeń cukrowo-fosforanowy jest eksponowany na zewnątrz. Dwie nici DNA są utrzymywane razem przez wiązania wodorowe występujące w parach zasad. Adenina (A) zawsze tworzy parę zasad z łyminą (T), a guanina (G) z cytozyną (C).
Replikacja DNA
Proces, w którym podwójna nić DNA ulega skopiowaniu. Replikacja jest semikonserwatywna - w każdej z dwóch uzyskanych podwójnych nici DNA będzie jedna nić macierzysta i jedna nowa. Nie licząc niewielkiej szansy wystąpienia błędu obie cząsteczki DNA będą identyczne.
Substratami tego procesu są: DNA i trifosforany nukleozydów. W procesie tym bierze udział wiele enzymów, w tym:
helikaza - tnie wiązania wodorowe między niciami DNA umożliwiając rozpoczęcie kopiowania
primaza - syntetyzuje primer (starter) - krótki fragment z RNA umożliwiający rozpoczęcie procesu
polimeraza DNA - z trifosforanów nukleozydów syntetyzuje (dobudowuje na zasadzie komplementacji) brakujące nici DNA
egzonukleaza - usuwa primery RNA z nici, bez niej nowa nić zawierałaby zarówno DNA jak i niewielkie ilości RNA.
ligaza DNA - uzupełnia brakujące wiązania fosfodiestrowe w szkielecie nowo-zsyntezowanej nici DNA
różne enzymy pomocnicze
Zasady replikacji są podobne u wszystkich organizmów, przy czym największe różnice występują między bakteriami z jednej strony, a eukariontami z drugiej. U bakterii replikacja zaczyna się w ustalonym miejscu i postępuje bardzo szybko, z prędkością rzędu 1000 nukleotydów na sekundę. U eukariotów replikacja jest o wiele wolniejsza, ok. 50 nukleotydów na sekundę, jednak zachodzi równocześnie w wielu miejscach.
Polimeraza DNA działa jedynie w kierunku od końca 3' do końca 5' (czyli syntezuje od końca 5' do końca 3'). Ztego powodu jedna z nici jest syntezowana w sposób ciągły, druga (ta, którą chcielibyśmy zsyntezować w przeciwną stronę) fragmentami.
Przebieg procesu w punktach:
1) Dwie nici podwójnej helisy w pewnym miejscu rozplatają się; powoduje to rozerwanie par zasad komplementarnych
2) W pobliżu miejsca rozplecenia zawsze znajduje się dostateczna ilość wolnych nukleotydów; do każdej z zasad w rozplecionych niciach dołącza zasada komplementarna, stanowiąca część wolnego nukleotydu - jednostki budulcowej DNA
3) Między nowo dołączonymi nukleotydami powstają trwałe połączenia - w ten sposób tworzy się nowa nić DNA.
Inicjacja replikacji, elongacji i terminacji
Kopiowanie podwójnej helisy DNA jest procesem złożonym. Rozpoczyna się w miejscu inicjacji, liczącym ok. 200-300 par nukleotydów. Miejsce to oznacza się skrótem ori od ang. origin. Aby replikacja przebiegła prawidłowo, rozdzielenie obu nici musi zajść bez zniszczenia ich struktury podstawowej (I-rzędowej) i w odpowiednich warunkach, jak: dokładne odczytanie matrycy DNA, obecność odpowiedniej liczby wolnych nukleotydów, zachowania komplementarności. Na koniec musi dojść do terminacji replikacji, ewentualnego uzupełnienia braków na końcu nowopowstałej cząsteczki i połączenia nowych cząsteczek w helisę. U bakterii zakończenie replikacji jest niemal automatyczne (po skopiowaniu całego kolistego DNA, który jest pojedynczym replikonem. U eukariotów miejsc replikacji (replikonów) jest wiele, a jej terminacja zachodzi po zakończeniu wielu
procesów replikacyjnych zachodzących niemal jednocześnie w różnych miejscach replikujących cząsteczek DNA.
Do terminacji dochodzi, gdy widełki replikacyjne replikonu natkną się na specjalną sekwencję terminacyjną. Proces replikacji nie-kolistych (eukariotycznych) cząsteczek DNA wiąże się z problemem wolnych zakończeń powstających cząsteczek DNA. Zakończenia te, zwane telomerami składają sie z krótkich, ale wielokrotnie powtórzonych sekwencji. Replikazy wydłużają jedynie istniejące już nici, nie są natomiast w stanie
zsyntetyzować końcowych odcinków telomerów. W rezultacie odcinki te narażone są na regularne skracanie.
Skracaniu temu zapobiega obecność telomerazy, która przeprowadza odwrotna transkrypcję tych odcinków, posługując się jako "matrycą" nie DNA, ale RNA, będącym częścią składową tego enzymu. Zapobiega to odsłonięciu znaczących fragmentów DNA.
Primaza - enzym biorący udział w replikacji DNA, odmiana polimerazy RNA zależne] od DNA. Primaza jest aktywowana przez helikazę DNA i po aktywacji syntezuje na obu niciach DNA krótkie (11 zasad) komplementarne odcinki (primery) starterowego RNA wykorzystywane przez polimerazę DNA do rozpoczęcia syntezy nowych nici DNA w procesie replikacji DNA. Do syntezy RNA nie potrzebuje w odróżnieniu od polimeraz DNA odcinków starterowych z wolnym końcem 3'-OH. Po połączeniu się z helikazą tworzy kompleks enzymatyczny zwany primosomem. Bakteryjna primaza jest produktem genu dnaG. U eukariota primaza zbudowana jest z dwóch podjednostek, z których mniejsza ma aktywność polimerazy RNA. U eukariota z dwoma podjednostkami primazy związana jest polimeraza DNA-a i podjednostka B'1'
Helikaza DNA - jest to enzym, którego zadaniem jest rozplątywanie DNA. Dokonuje tego poprzez przesuwanie się wzdłuż podwójnej helisy. Ułatwia to rozkręcanie obu nici.
Polimeraza DNA
Polimeraza DNA - enzym katalizujący syntezę DNA w czasie replikacji lub naprawy DNA. Synteza ta polega na polimeryzacji deoksyrybonukleotydów przez wytwarzanie wiązań fosfod i estrowych między nimi. Substratami do tej reakcji są nukleotydy trójfosforanowe, a jej produktem ubocznym jest pirofosforan, złożony z dwóch reszt fosforanowych. Dlatego składnikami DNA są nukleotydy jednofosforanowe (monofosforanowe). Większość polimeraz DNA wymaga matrycy, w formie jednoniciowego DNA lub RNA. z krótkim obszarem dwuniciowym. Odcinek dwuniciowy powstaje przez przyłączenie się do jednoniciowej matrycy krótkiego komplementarnego do matrycy odcinka DNA lub RNA. zwanego primerem lub starterem (zwykle ma długość od kilku do ok. 20 nukleotydów).
Polimeraza DNA I
Enzym monomeryczny (zbudowany z pojedynczego łańcucha polipeptydowego. Posiada trzy aktywności enzymatyczne, co jest nietypowe dla monomeru:
• polimerazowa
• egzonukleazowa 3' —» 5" weryfikuje poprawność wbudowanych nukleotydów i jeśli trzeba wycina je
• egzonukleazowa 5" —* 3" - jak rybonukleaza wycina startery RNA i syntetyzuje w to miejsce DNA. Wycina także dimery pirydynowe.
Jednorazowo polimeraza DNA I sytetyzuje do 20 wiązań fosfodiestrowych. Syntezuje ok. 10 wiązań na sekundę tj. ok. 100 razy wolniej od polimerazy DNA III. Występuje w liczbie ok. 400 cząsteczek na jedną komórkę.
Aktywność egzonukleazy 5" —* 3" daje się stosunkowo łatwo oddzielić od pozostałych funkcji enzymu (każdą z nich katalizuje inny odcinek polipeptydowego łańcucha). Białko pozbawione aktywności 5' —• 3' egzonukleazy nazywamy fragmentem Klenowa.
Polimeraza DNA II
Enzym monomeryczny, posiadający dwie aktywności:
• polimerazowa
• egzonukleazowa 3"—>5"
Jest głównie zaangażowana w sprawdzanie poprawności replikacji i w naprawę DNA.
Polimeraza DNA III
Enzym heteromultimeryczny (złożony z kilku niejednakowych łańcuchów polipeptydowych), będący głównym inicjatorem replikacji DNA. Syntetyzuje z prędkością ok. 1000 wiązań na sekundę główną masę nowo powstałej, komplementarnej do matrycowej nici DNA.
W odróżnieniu od polimerazy DNA I działa w sposób ciągły, to znaczy oddysocjowuje od matrycy dopiero po zakończeniu replikacji. Łączy się tylko z jednoniciowym DNA. do którego przyłączony jest starter, wytwarzany przez enzym - prymazę - wchodzący w skład prymosomu. Przyłączając się do prymosomu polimeraza III przekształca go w replisom. Aktywności enzymatyczne:
• polimerazowa
• egzonukleazowa 3' —* 5'
Występuje w liczbie 10-20 cząsteczek na jedną komórkę.
Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki.
Typowa reakcja PCR
denaturacja
hybrydyzacja
elongacja
Elektroforeza - metoda rozdziału cząsteczek DNA wykorzystująca przemieszczenie się naładowanych cząsteczek w polu elektrycznym
Enzymy restrykcyjne, inaczej restryktazy - enzymy z grupy endonukleaz przecinające nić DNA w miejscu wyznaczanym przez specyficzną sekwencję DNA. Rozpoznawana sekwencja z reguły ma charakter symetryczny o długości od 4 do 8 par zasad (pz), choć zdarzają się częste wyjątki. Restryktazy wraz z metylazami DNA stanowią system restrykcji i modyfikacji DNA, który w organizmach prokariotycznych stanowi mechanizm obronny zapobiegający włączeniu DNA bakteriofaga do genomu bakterii. Niespecyficzność enzymów restrykcyjnych w niektórych warunkach nazywa się aktywnością star.
Sekwencjonowanie DNA - technika odczytywania sekwencji, czyli kolejności par nukleotydowych w cząsteczce DNA. Sekwencjonowanie dokonuje się przy pomocy zautomatyzowanych sekwencjonatorów. Manualne sekwencjonowanie stosuje się przy opracowywaniu nowatorskich metod, w niektórych laboratoriach dla krótkich fragmentów, lub podczas ćwiczeń. Odbywa się za pomocą:
metody chemicznej degradacji
metody terminacji łańcucha
Sekwencjnowanie metodą terminacji łańcucha
Jako matrycę wykorzystuje się tu jedno lub dwuniciowy DNA, który jest produktem reakcji PCR. Taki produkt jednak przed procesem sekwencjonowania, należy oczyścić z nie zużytych odczynników. Do reakcji w przypadku taj metody wystarczy już niewielka ilość matrycowego DNA, nie ma, więc potrzeby jego klonowania przed rozpoczęciem sekwencjonowania. Cały proces jest bardzo podobny do reakcji PCR, lecz używa się tu tylko jednego, wyznakowanego np.: radioaktywnie startera, a każda reakcja ma inny ddNTP. W wyniku obecności tylko jednego startera syntetyzowana jest jedna nić analizowanej cząsteczki. Więc produkt reakcji akumuluje się liniowo, a nie wykładniczo, jak przy prawdziwym PCR. Obecność ddNTP w mieszaninie reakcyjnej prowadzi do terminacji łańcucha, jak w przypadku standardowych metod. Powstałą pulę można analizować w żelu poliakrylamidowym, a posługując się np.: metodą autoradiograficzną uwidocznić efekt końcowy na kliszy. Sekwencje odczytywać w tradycyjny sposób (od dołu ku górze).
Transkrypcja w genetyce oznacza proces syntezy RNA na matrycy DNA przez różne polimerazy RNA, czyli przepisywanie informacji zawartej w DNA na RNA.
Matryca jest odczytywana w kierunku 3' → 5', a nowa cząsteczka RNA powstaje w kierunku 5' → 3'. Transkrypcji podlega odcinek DNA od promotora do terminatora. Nazywamy go jednostką transkrypcji.
Podczas transkrypcji polimeraza RNA buduje cząsteczkę RNA łącząc zgodnie z zasadą komplementarności pojedyncze rybonukleotydy według kodu matrycowej nici DNA.
Transkrypcja u prokariotów
Inicjacja transkrypcji u prokariotów polega na związaniu się polimerazy RNA z odpowiednim odcinkiem pasma matrycowego DNA - tzw. promotorem. Polimeraza rozpoznaje sekwencje -35 i -10 promotora (a transkrypcja zaczyna się od nukleotydu +1). Specyficzność wiązania zapewnia czynnik σ (sigma). Rozsunięcie nici DNA na odcinku kilkunastu nukleotydów (czyli powstanie tzw. kompleksu otwartego) umożliwia wstawianie (włączenie) kolejnych, odpowiednich nukleotydów. Substratami są trifosforany rybonukleozydów (ATP, GTP, CTP i UTP). Transkrypcja zaczyna się od produkcji kilku krótkich (kilka nukleotydów) transkryptów. Dopiero po oddysocjowaniu czynnika σ może rozpocząć się kolejny etap - elongacja transkrypcji (wydłużanie RNA). Polimeraza RNA przesuwa się systematycznie wzdłuż helisy DNA, rozplatając ją (na odcinku kilkunastu par zasad) i wydłużając łańcuch RNA, przy czym nukleotydy włączane są zgodnie z zasadą komplementarności. Powyżej aktualnego miejsca syntezy powstający hybrydowy kompleks DNA - RNA ulega rozpadowi, DNA powraca do swojej pierwotnej dwuniciowej struktury, a łańcuch powstającego mRNA oddziela się. Etap elongacji kończy się, gdy polimeraza RNA dotrze do terminatora - sekwencji kończącej, wyznaczającej miejsce terminacji (zakończenia) transkrypcji. Transkrypt prokariotyczny nie wymaga dalszej obróbki, a translacja rozpoczyna się, zanim transkrypcja dobiegnie końca.
Transkrypcja u eukariotów
U eukariotów występuje kilka rodzajów polimeraz RNA, w tym zbudowane z wielu podjednostek polimerazy RNA działające w jądrze komórkowym oraz specyficzne dla mitochondriów i chloroplastów polimerazy RNA, które budową przypominają polimerazy RNA prokariontów. Różne jądrowe polimerazy RNA biorą udział w transkrypcji różnych klas RNA. Polimeraza RNA II (Pol II) syntetyzuje pre-mRNA i większość snRNA, polimeraza RNA I (Pol I) transkrybuje część rRNA, a polimeraza RNA III (Pol III) odpowiada za syntezę tRNA, 5S rRNA i innych małych jądrowych RNA.
W przeciwieństwie do polimerazy RNA bakterii, jądrowe polimerazy RNA organizmów eukariotycznych potrzebują do rozpoczęcia transkrypcji zestawu właściwych dla danej polimerazy podstawowych czynników transkrypcyjnych, ponieważ rozpoznają nie sekwencję promotora, ale kompleks kwas nukleinowy-białko.
Temat: Biosynteza białek
RNA - jest polimerem złożonym z jednostek monomery cznych — rybonukleotydów — połączonych wiązaniami 3',5'-fosfodiestrowymi. Kowalencyjna (pierwszorzędowa) struktura KNA jest bardzo podobna do struktury DNA, z wyjątkiem tego, że zamiast tyminy RNA zawiera uracyl, a zamiast deoksyrybozy — rybozę. Cząsteczki RNA są |ednoniciovve, ale zawierają odcinki wzajemnie komplementarne, umożliwiające tworzenie się wewnątrzcząsteczkowych regionów dwuniciowych.
Kod genetyczny - reguła, według której informacja genetyczna, zawarta w sekwencji nukleotydów kwasu nukleinowego (DNA lub RNA), w komórkach wszystkich organizmów może ulegać „tłumaczeniu” na kolejność (sekwencję) aminokwasów w ich białkach (w procesie biosyntezy białek, czyli translacji).
Kod genetyczny jest kodem trójkowym.
Kod genetyczny jest zestawem reguł, które określają sposób, w jaki sekwencja nukleotydów w mRNA zostaje przetłumaczona na sekwencję aminokwasów w polipeptydzie. Sekwencja nukleotydów jest czytana trójkami o nazwie kodony. Kodony UAG, UGA i UAA nie specyfikują żadnego aminokwasu i są określone jako kodony
tenninacyjne, czyli kodony „stop". Kodon AUCi koduje metioninę i działa również jako kodon inicjujący, czyli „start".
Kod genetyczny jest zdegenerowany.
Większość aminokwasów jest kodowana przez więcej niż jeden kodon (tj. kod genetyczny jest zdegenerowany). Kodony specyfikujące ten sam aminokwas (synonimowe) często różnią się tylko trzecią zasadą, w pozycji tolerancji, w której parowanie zasad z antykodonem może być mniej dokładne niż w dwóch pierwszych pozycjach kodonu.
Kod genetyczny jest uniwersalny.
Kod genetyczny nie jest uniwersalny, ale jest laki sam w większości organizmów. Wyjątki występują w genomach mitochondrialnych, gdzie pewne kodony specyfikują aminokwasy odmienne od tych, które są normalnie kodowane przez geny jądrowe. W mitochondriach pewnych typów organizmów kodon UAG nie jest sygnałem zakończenia translacji, ale koduje tryptofan. U niektórych pierwotniaków kodony UAA i UAG nie oznaczają również Kod genetyczny nie jest uniwersalny, ale jest laki sam w większości organizmów. Wyjątki występują w genomach mitochondrialnych, gdzie pewne kodony specyfikują aminokwasy odmienne od tych, które są normalnie kodowane przez geny jądrowe. W mitochondriach
pewnych typów organizmów kodon UAG nie jest sygnałem zakończenia translacji, ale koduje tryptofan. U niektórych pierwotniaków kodony UAA i UAG nie oznaczają również terminacji translacji, lecz kwas glutaminowy, terminacji translacji, lecz kwas glutaminowy.
Ramki odczytu
Sekwencja mRNA może być odczytywana przez rybosom w trzech możliwych ramkach odczytu. Zazwyczaj tylko jedna ramka koduje funkcjonalne białko, ponieważ pozostałe dwie ramki zawierają liczne kodony „stop". W pewnych bakteriofagowych DNA występują geny nakładające się, które używają różnych ramek odczytu.
Otwarte ramki odczytu
Otwartą ramką odczytu (ORF) nazywamy ciąg kodonów rozpoczynających się kodonem ATG, a kończących jednym z kodonów terminujących translację, TGA, TAA lub TAG. Rejony kodujące genów zawierają stosunkowo długie ORF, w przeciwieństwie do niekodującego DNA, gdzie ORF są krótkie. Dlatego obecność długiej ramki odczytu w sekwencji DNA może wskazywać na obecność w tym miejscu rejonu kodującego. Analiza komputerowa ORF może być wykorzystana do identyfikacji kodowanego białka.
Translacja - proces syntezy łańcucha polipeptydowego białek na matrycy mRNA. W jego wyniku dochodzi do ostatecznego przetłumaczenia informacji genetycznej zawartej pierwotnie w kodzie genetycznym DNA na konkretną strukturę białka, zależną od uszeregowania aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym.
Translacja jest drugim (po transkrypcji) procesem w biosyntezie białka. Powstawanie łańcucha polipeptydowego sterowane jest przez sekwencję mRNA. Translacja odbywa się w cytoplazmie lub na błonach szorstkiej siateczki wewnątrzplazmatycznej. Proces ten jest katalizowany przez rybosom obejmujący podjednostkami przesuwającą się nić mRNA. Rybosomy składają się z dwóch podjednostek, większej i mniejszej, które są zbudowane z białek i rRNA, a funkcję katalityczną pełnią enzymy (rybozymy) zawarte w dużej podjednostce rybosomu. Translacja na jednej cząsteczce mRNA może być prowadzona przez wiele rybosomów równocześnie. Taki kompleks mRNA związanego z wieloma rybosomami nazywa się polisomem lub polirybosomem.
Translacja składa się z czterech faz:
aktywacji
inicjacji
elongacji
terminacji
Wśród kwasów rybonukleinowych wyróżnia się m.in.:
Mutacja to nagłe, skokowe zmiany materiału genetycznego, możliwe jest jego dziedziczenie. Oznacza zmianę zapisu informacji genetycznej, pierwotne źródło zmienności genetycznej organizmów.
Mutacja jest zjawiskiem losowym, podlegającym jednak wpływom środowiska (mutagenom - np. chemicznym, promieniowaniu). Częstość mutacji nie jest stała pomiędzy gatunkami (np. RNA wirusa HIV mutuje bardzo szybko, ) i zależy między innymi od doskonałości aparatu powielania DNA i jego naprawy.
Odmienną klasą mutacji są zmiany spowodowane transpozycją (tzw. skaczące geny), gdzie odcinek DNA o długości kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów zmienia położenie w obrębie genomu. Tego typu mutacje są bardziej rozpowszechnione u niektórych roślin (np. kukurydza) i zwierząt (np. muszka owocowa).
Wprowadzanie mutacji do materiału genetycznego nazywa się mutagenezą. Współczesna genetyka umożliwia mutagenezę ukierunkowaną, realizowaną za pomocą inżynierii genetycznej.
Ze względu na rozmiar (długość odcinka DNA ulegającego mutacji) i mechanizm wyróżnia się trzy główne rodzaje mutacji:
strukturalna
liczbowa
Mutacje mogą być niekorzystne (w danych warunkach), obojętne lub korzystne dla organizmu (np. anemia sierpowata na obszarach, gdzie występuje malaria). Gdyby nie istniały mutacje ewolucja biologiczna byłaby niemożliwa.