Ćwiczenie 4

Elektroforeza DNA komórkowego w żelu agarozowym. Wyznaczanie masy fragmentów restrykcyjnych (DNA /EcoRI).
Projektowanie doświadczeń z trawieniem enzymami restrykcyjnymi.

I. Elektroforeza DNA komórkowego w żelu agarozowym

Odczynniki

Agaroza - naważka 0.24g/0.8g

Bufor przewodzący TAE 50x ((0.2 M Tris:octan; 0.05 M EDTA)

Roztwór bromku etydyny 10 mg/ml

Preparaty DNA komórkowego wyizolowane na ćwiczeniach 2

a. Przygotowanie 0.8% żelu agarozowego do elektroforezy (30 ml lub 100 ml):

1. Przygotować saneczki z blokadą (lub taśmą) i grzebieniem.

2. Naważkę agarozy (0.24g/0.8g) rozpuścić w 29.4ml/98ml H₂O, zagotować w kuchence mikrofalowej, przestudzić do temp. ok. 50⁰C.

3. Dodać 0.6ml/2ml (1/50 objętości) buforu TAE 50x i 2/4,6 μl bromku etydyny (uwaga, rakotwórczy!) - u prowadzącego.

4. Wylać do przygotowanych saneczek (z blokadą i grzebieniem). Zostawić do zżelowania.

5. Przygotować 800 ml buforu przewodzącego 1x TAE (sekcja 1).

6. Wyjąć grzebień i blokady, wstawić saneczki z żelem do aparatu i zalać buforem przewodzącym.

b. Przygotowanie prób DNA i elektroforeza

Odczynniki

Bufor obciążający: 0.25% błękit bromofenolowy; 0.25% cyanol ksylenu; 30% glicerol

Wzorzec masy: DNA faga lambda/HindIII z buforem obciążającym (0.5 μg/5µl)

1. Z prób DNA komórkowego odpipetować do 2 ependorfów 0.25 μg i 1 μg (obliczyć odpowiednie rozcieńczenia), dopełnić do 10 μl i dodać 2 μl buforu obciążającego do elektroforezy.
W przypadku, gdy DNA nie wystarczy na dwie próby, pobrać całość (maksymalnie 20 μl)
i dodać 1 μl buforu obciążającego na każde 5 μl DNA.

2. Nanoszenie prób:

• Marker - 5 μl

• Próby kolejnych sekcji (kolejno niższe i wyższe stężenie DNA)

3. Elektroforeza DNA 80 V, około 1-2 godzin

4. Oglądanie DNA w świetle UV (foto)

II. Wyznaczanie mas cząsteczkowych fragmentów restrykcyjnych λ/EcoRI.

Na podstawie obrazów elektroforetycznych i znanego wzorca cząsteczkowego (λ/HindIII) należy wyznaczyć masy cząsteczkowe otrzymanych w ćwiczeniu IV fragmentów restrykcyjnych. Prędkość migracji fragmentów w żelu (czyli ich odległość od miejsca startu) jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu z masy cząsteczkowej badanych cząsteczek, przy założeniu, że mają one podobny kształt (tak jak w przypadku fragmentów DNA).

Wzorzec masy (λ/HindIII) ma następujące długości prążków (pz)

Do wyznaczenia długości fragmentów (w parach zasad - pz) korzystamy ze wzoru:

Log_ab=c, gdzie a=10

b=długość fragmentu

c=odczytany z wykresu logarytm z długości fragmentu (ilości pz)

wobec tego długość fragmentu = 10^c

III. Projektowanie doświadczeń z trawieniem enzymami restrykcyjnymi - praca z katalogiem; odczytywanie sekwencji (na zajęciach).

Sprawozdanie

1. Trawienie DNA faga lambda enzymem EcoRI - opis z ćwiczenia 3

2. Elektroforeza potrawionych fragmentów - wynik - obraz żelu z ćw. 3

3. Obliczenie długości fragmentów - wykres wzorcowy na podstawie markera masy (/Hind III) i naniesione punkty doświadczalne.

4. Wnioski - porównanie rzeczywistych długości fragmentów (należy wyszukać je w katalogu firmy Fermentas z internetu) z uzyskanymi - źródła błędu.

5. Jako osobny punkt - wynik elektroforezy (z ćw. 4) DNA komórkowego (wyizolowanego na ćw. 2 i oznaczonego na ćw. 3). Na podstawie opisu zanalizować obraz i wyjaśnić źródła ew. niepowodzeń. Na rysunku poniżej podany prawidłowy opis obrazka. W sprawozdaniu obowiązkowo należy zaznaczyć własne preparaty.

Przykładowe obrazy z elektroforezy DNA komórkowego wyizolowanego tą samą metodą, która była wykorzystana na ćwiczeniach.

kpz

---