ĆWICZENIE VII
Temat: Mikroflora środowisk naturalnych cd.
1. Określanie ogólnej liczby drobnoustrojów w powietrzu - odczytanie doświadczenia założonego na Ćwiczeniu 6.
W powietrzu stwierdzono około 100 różnych gatunków drobnoustrojów, w przeważającej większości saprofitycznych. Drobnoustroje chorobotwórcze spotyka się głównie tylko w otoczeniu człowieka i zwierząt. Z bakterii najliczniej występują w powietrzu przedstawiciele rodzajów Micrococcus i Sarcina, które na podłożach hodowlanych rosną w postaci barwnych (żółtych, białych, pomarańczowych) kolonii, pałeczki z rodzaju Achromobacter oraz tlenowce przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus. Zwykle w powietrzu spotyka się zarodniki grzybów i drożdże. Z drożdży najczęściej występują rodzaje Rhadotorula i Torulopsis, a z pleśni rodzaje Penicillium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Cladosporium i Demiatum.
Zdolność do przetrwania mikroorganizmów w powietrzu zależy od ich wrażliwości na wysuszenie. Mycobacterium tuberculosis (prątek gruźlicy), Bacillus anthracis (wąglik), Pseudomonas aeruginosa (pałeczka ropy błękitnej), a także liczne gronkowce są oporne na wysuszenie i giną w powietrzu powoli. Wrażliwe drobnoustroje takie jak Neisseria meningitidis (dwoinka zapalenia opon mózgowych), Vibrio comma (przecinkowiec cholery) czy Pasteurella pestis (pałeczka dżumy) giną w powietrzu stosunkowo szybko.
Powietrze uznaje się za bardzo czyste, jeśli liczba drobnoustrojów w 10 dm3 powietrza nie jest większa od 10, natomiast gdy przekracza 100 to powietrze jest bardzo zanieczyszczone mikrobiologicznie.
Barwienie preparatów
Utrwalanie preparatów - ma na celu przytwierdzenie komórek do szkiełka, by uchronić je przed zmyciem przy dalszych manipulacjach. Podczas utrwalania drobnoustroje zostają zabite, co ułatwia przeniknięcie barwnika do wnętrza komórki. Najczęściej utrwalamy preparat w płomieniu: szkiełko z wysuszonym w temperaturze pokojowej rozmazem przesuwamy 2-3 razy nad płomieniem palnika. Możemy utrwalać preparat odczynnikami takimi jak alkohol bezwodny lub 96%, wodny roztwór sublimatu, 10% roztwór formaliny. Po utrwaleniu preparat jest przygotowany do barwienia. Do stosowanych w mikrobiologii barwników należą: fuksyna, błękit metylenowy, fiolet goryczkowy, nigrozyna.
Barwienie proste - polega na nalaniu roztworu barwnika na powierzchnię utrwalonego rozmazu. Czas pozostawienia barwnika na preparacie jest różny i zależy tylko od rodzaju barwnika np. fuksyna 1-2 min. Nadmiar barwnika z preparaty opłukujemy wodą i osuszamy bibułą.
Barwienie złożone - umożliwia stwierdzenie różnic o charakterze systematycznym w strukturach fizykochemicznych.
Metoda Grama - w tej metodzie wykorzystuje się fakt że w komórkach. niektórych drobnoustrojów po traktowaniu ich roztworem fioletu goryczkowego i płynu Lugola (roztwór J w KJ) - powstają trwałe kompleksy o barwie fioletowej, trudno rozpuszczalne w alkoholu. Bakterie wykazujące tę właściwość nazywamy Gram+ pozostałe u których takie połączenia nie powstają Gram-. Technika barwienia metodą Gram+ jest następująca. Utrwalony preparat zalewa się na 1-2 min roztworem fioletu goryczkowego, płucze wodą i zalewa się płynem Lugola. Po upływie 1-2 min zlewa się płyn Lugola, po czym przemywa się preparat alkoholem etylowym aż do momentu wypłukania fioletu. Po spłukaniu wodą preparat dobarwiamy roztworem 1:10 fuksyny fenolowej i spłukuje wodą. Bakterie gramdodatnie zachowują zabarwienie fioletowe, a gramujemne wskutek dobarwienia kolor różowy charakterystyczny dla fuksyny.
Barwienie negatywne - barwimy tylko tło preparatu, co umożliwia dzięki kontrastowi obserwacje kształtów nie zabarwionych komórek. W celu przygotowania preparaty negatywowego kroplę zawiesiny drobnoustrojów mieszamy na szkiełku podmiotowym z zawiesiną tuszu chińskiego lub nigrazyny. Wytworzoną mieszaninę rozmazujemy za pomocą drugiego szkiełka przedmiotowego cienką warstwą po powierzchni szkiełka i suszymy. qwert
Część praktyczna
a). Ustalenie liczby drobnoustrojów zawartych w badanym powietrzu - liczenie wyrosłych na podłożu kolonii.
Liczymy wszystkie kolonie widoczne gołym okiem (dla uniknięcia pomyłek polegających najczęściej na kilkakrotnym liczeniu tej samej kolonii, policzone kolonie zaznacza się kropeczką narysowaną markerem na powierzchni płytki).
Liczbę drobnoustrojów zawartych w 10 dm3 powietrza obliczamy na podstawie następującego wzoru:
gdzie:
X - liczba drobnoustrojów zawarta w 10 dm3 powietrza,
a - średnia liczba kolonii z co najmniej 5 płytek
p × r2 - średnia powierzchnia płytek z których liczono kolonie (cm2).
t - współczynnik czasu ekspozycji (1 dla 5 minut, 2 dla 10 minut, 3 dla 15 minut)
Prawidłowy zapis doświadczenia powinien zawierać charakterystykę badanego pomieszczenia, datę nastawienia i likwidacji doświadczenia, nazwę lub skład podłoża użytego do hodowli drobnoustrojów, temperaturę i czas hodowli oraz liczbę równoległych płytek.
b). W celu uzyskania pełniejszego obrazu składu mikrobiologicznego badanego powietrza charakteryzujemy wyrosłe na podłożu kolonie.
Kolonie różnią się od siebie takimi cechami, jak: kształt, rozmiary, barwa, charakter powierzchni i brzegów. Studenci ustalają ile typów kolonii wyrosło na płytce. Opisują 3 wybrane kolonie. Przygotowują również preparaty barwione metodą Grama z wybranych kolonii bakterii, obserwują wykonane preparaty mikroskopowe (pow. 1250) i rysują obraz spod mikroskopu.
2. Określanie ogólnej liczby drobnoustrojów w glebie - odczytanie doświadczenia założonego na Ćwiczeniu 6.
Ilość bakterii w glebie może być różna w zależności od jej struktury, wilgotności i zawartości substancji organicznej i waha się od kilku tysięcy do kilku miliardów w 1 gramie suchej masy.
Wśród bakterii glebowych można wyróżnić 3 zasadnicze typy:
- Bakterie autochtoniczne - występują nawet w glebach nieuprawianych i są spotykane w glebach zawsze.
- Bakterie zymogenne - rozwijają się w glebie po wprowadzeniu do gleby substancji organicznej. Pochodzą one z innych środowisk.
Autochtoniczna mikroflora glebowa obejmuje przede wszystkim liczne gramdodatnie lub zmienne w reakcji Grama, nieprzetrwalnikujące pałeczki, rozpadające się na formy ziarenkowate (Arthrobacter, Corynebacterium, Mycobacterium). Są to na ogół bakterie dość powoli rosnące, tlenowe, nie fermentujące węglowodanów, lecz wykorzystujące jako źródło energii i węgla bardzo wiele związków. Stanowią one od 50 do 80 % ogólnej ilości bakterii, poza nimi do autochtonicznej mikroflory gleby zaliczamy część promieniowców, bakterie autotroficzne, bakterie śluzowe i azotobaktera i liczne Pseudomondales. Oprócz bakterii żyją w glebie inne drobnoustroje. Bardzo ważną rolę spełniają również grzyby.
Część praktyczna
Liczenie wyrosłych na podłożu kolonii jak przy określaniu liczby drobnoustrojów w powietrzu.
Przy obliczaniu liczby drobnoustrojów w glebie należy brać pod uwagę tylko te płytki, na których wyrosło nie mniej niż 30 i nie więcej niż 300 kolonii.
Zakładając, że każda kolonia powstała z jednej komórki macierzystej, możemy, mnożąc wartość rozcieńczenia przez liczbę wyrosłych kolonii, ustalić liczbę drobnoustrojów zdolnych do rozmnażania na danym podłożu komórek zawartych w 1 g świeżej gleby.
Prawidłowy zapis doświadczenia powinien zawierać: charakterystykę badanej gleby, opis kolejnych czynności związanych z nastawieniem doświadczenia, rodzaj podłoża użytego do hodowli drobnoustrojów, temperaturę i czas hodowli oraz liczbę równoległych płytek. Następnie należy obliczyć liczbę komórek drobnoustrojów w 1 g świeżej i suchej masy gleby.
- ogólna liczba bakterii - liczenie kolonii bakterii wyrosłych na podłożu Bunta i Roviry, wyliczenie średniej z 5 płytek, przeliczenie liczby komórek na 1 g świeżej i suchej masy gleby.
- ogólna liczba grzybów - liczenie kolonii grzybów wyrosłych na podłożu Martina, wyliczenie średniej z 5 płytek, przeliczenie liczby komórek na 1 g świeżej i suchej masy gleby.
Waga naczynka =
Waga naczynka z glebą świeżą =
Waga naczynka z glebą suchą =
Średnia liczba kolonii z 3 płytek =
Zastosowane rozcieńczenie gleby =
3. Określanie ogólnej liczby drobnoustrojów i miana coli w wodzie - odczytanie doświadczenia założonego na Ćwiczeniu 6.
Część praktyczna
a). Liczenie wyrosłych na podłożu kolonii.
Liczymy kolonie i ustalamy ogólną liczbę drobnoustrojów zawartych w 1 cm3 badanej wody.
b). Odczyt wyników doświadczenia określania miana coli w wodzie
Przy odczytywaniu wyników porównujemy pożywki zaszczepione z kontrolnymi i stwierdzamy obecność lub brak zmian typowych dla pałeczki okrężnicy.
O obecności bakterii z grupy coli świadczy:
- występowanie gazu w rurkach Durhama
- zakwaszenie pożywki (zmiana barwy z brunatnej na żółtą)
- zmętnienie pożywki
Wg norm polskich dla aglomeracji miejskich liczących:
- co najmniej 50 tys. mieszkańców miano coli dla wody wodociągowej powinno wynosić > 100, a ogólna liczba drobnoustrojów w 1 cm3 wody oznaczonej na agarze odżywczym nie powinna być większa niż 5.
- mniej niż 50 tys. mieszkańców miano coli dla wody wodociągowej powinno przekraczać 50, a ogólna liczba drobnoustrojów w 1 cm3 wody oznaczonej na agarze odżywczym nie powinna być większa niż 20.
Najbardziej Prawdopodobna Liczba (NPL) bakterii z grupy coli w 100 cm3 próbki. System posiewu: 1 x 50 cm3 i 5 x 10cm3.
Liczba próbek wykazujących obecność bakterii z grupy coli, w objętościach próbki |
NPL w 100 cm3 |
Miano coli obliczone wg wzoru 100/NPL |
|
1 x 50cm3 |
5 x 10cm3 |
|
|
0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 |
0 0 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 |
0 2 3 6 9 16 18 1 2 4 5 7 |
>100 50 33 17 11 6 5 100 50 25 20 14 |
Literatura wykorzystana przy opracowaniu ćwiczenia VI i VII:
Chruściak E., Kulińska D., Romanowa I., Russel S. - Ćwiczenia z mikrobiologii. SGGW
Duszkiewicz - Reinhard W. i inni - Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej. Wydawnictwo SGGW.
Kunicki - Goldfinger W. - Życie bakterii.
Różalski A. - Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. Wydawnictwo Uniw. Łódzkiego.
Zmysłowska I. - Mikrobiologia ogólna i środowiskowa. Teoria i ćwiczenia. - Wydawnictwo UWM Olsztyn
Nowak A. i inni - Przewodnik do ćwiczeń z mikrobiologii. - Wydawnictwo AR w Szczecinie.
Copyright © 2001-2002
Wyszukiwarka