IMMUNODIAGNOSTYKA

POJĘCIA:

• miano → stężenie przeciwciał w surowicy

• powinowactwo → siła oddziaływania między pojedynczym epitopem (na antygenie) i odpowiadającym mu paratopem (na immunoglobulinie)

• awidność (powinowactwo funkocjonalne) → siła z jaką oddziałują ze sobą wielowartosciowe antygeny i populacja przeciwciał indukowana przez taki antygen; na awidnośc ma wpływ powinowactwo oraz wartościowość antygenu i przeciwciał

REAKCJE ANTYGEN-PRZECIWCIAŁO:

Reakcje precypitacji - antygeny biorące udział w reakcji to antygeny białkowe, zarówno pełnowartościowe jak i resztkowe (hapteny); cechą charakterystyczną jest ich wielowartościowość (jednowartościowe, posiadające tylko jedną determinantę antygenową [EPITOP] nie precypitują, choć też nie wszystkie wielowartościowe precypitują) oraz to, że są rozpuszczalne (w przeciwieństwie do antygenów biorących udział w aglutynacji!); przeciwciała biorące udział w reakcji precypitacji noszą nazwę precypityn. Nieprecypitujące przeciwciała mają niskie powinowactwo do antygenu, albo wykazują dwuwartościowość monogamiczną (dwa miejsca wiązania dla dwóch determinant tej samej cząsteczki antygenu).

Reakcje precypitacji zachodzą w dwóch etapach:

• antygen reaguje z precypityną → powstaje hydrofobowy kompleks antygen-przeciwciało;

• utworzenie strątu → wytrącenie kompleksu pod wpływem elektrolitów obecnych w środowisku reakcji; etap ten zachodzi tylko w optymalnych warunkach - w strefie ekwiwalencji (odpowiednie proporcje antygenu i przeciwciała; w przypadku nadmiaru któregoś z reagentów powstają niewidoczne kompleksy rozpuszczalne).

Przeciwciała o bardzo wąskiej strefie ekwiwalencji (wąski zakres stężeń reagentów, w którym ulegają one precypitacji) nazywamy przeciwciałami flokulującymi. Antygen jest czasteczką nierozpuszczalną. Powstały w wyniku flokulacji precypitat ma postać luźnych kłaczków.

Optymalne warunki precypitacji: 0.15-molowy roztwór NaCl, pH 6.4-8.5

W przypadku surowic ludzkich, reakcje przebiegają identycznie w temperaturach 20 i 37ºC.

Należy w reakcjach precypitacji stosować surowice zinaktywowane (pozbawione dopełniacza, który wiąże się z kompleksem antygen-przeciwciało powodując częściowe jego rozpuszczenie).

Odczyny precypitacji w środowisku płynnym:

• Odczyn precypitacji pierścieniowej → do probówek wprowadzamy surowicę odpornościową i ostrożnie nawarstwiamy roztwór, w którym poszukujemy antygenu. Na granicy płynów powstaje pierścień (poszukując przeciwciał, badany roztwór nawarstwiamy na roztwór odpowiedniego antygenu);

• Odczyn precypitacji szkiełkowej → na szkiełko przedmiotowe nakraplamy roztwór antygenu i surowicy i intensywnie mieszamy. Na dnie kropli pojawia się strąt;

• Odczyn flokulacyjny → zasadą tego odczynu jest reakcja przeciwciał obecnych w surowicy chorego z antygenem kardiolipinowym (otrzymywany z mięśnia serca wołu → wspólny dla prawidłowego serca bydlęcego jak i krętków kiły). Zinaktywowaną surowicę badaną nakraplamy do zagłębienia szkiełka Lindnera (szkiełko z łezką) i dodajemy zawiesinę antygenu kardiolipinowego (opłaszczone kardiolipiną cząsteczki cholesterolu). Wytrząsamy i oceniamy pod mikroskopem obecność kłaczków (pojawiają się gdy w surowicy obecne są przeciwciała dla kiły). Odczyn flokulacyjny stosowany w diagnostyce kiły znany jest jako odczyn VDRL (veneral disease research laboratory test), jego modyfikacją jest test mikroflokulacyjny, w którym do antygenu dodawany jest chlorek choliny inaktywujący dopełniacz, tak, że surowica nie musi być wstępnie inaktywowana.

Odczyny precypitacji w środowisku stałym (immunodyfuzja):

Pozwalają badać jednocześnie wiele układów antygen-przeciwciało; oparte są na zjawisku dyfuzji w żelu (agarowym, agarozowym lub poliakrylamidowym) - na granicy zetknięcia się dyfundujących reagentów (w ich strefie ekwiwalencji) powstają linie precypitacyjne. Przebieg immunodyfuzji zależy od wielkości cząsteczek i ich stężenia. Optymalne pH to 6.0-9.0, temperatura zazwyczaj pokojowa. Po zakończeniu badania preparaty się utrwala (płucze w NaCl, potem w wodzie destylowanej by usunąć cząstki reagentów nie związane w kompleksach; suszy przykrywając bibułą; wybarwia - najczęściej czernią amidową).

Immunodyfuzja pojedyncza → gdy jeden reagent dyfunduje, a stężenie drugiego jest stałe w podłożu

Immunodyfuzja podwójna → gdy oba reagenty dyfundują

Obie można przeprowadzać w probówkach (metoda Oudina) lub na płytkach (metoda Outcherlony'ego):

• Pojedyncza immunodyfuzja probówkowa → liczba pierścieni zależy od liczby reagujących antygenów i przeciwciał (niejednorodny/jednorodny antygen, mono-/poliwalentna surowica). Na dno probówki wlewa się agar zmieszany z surowicą odpornościową i czeka na zestalenie podłoża, następnie nawarstwia się roztwór antygenu, który dyfunduje do agaru. W strefie ekwiwalencji pojawi się pierścień precypitacyjny;

• Podwójna immunodyfuzja probówkowa → na dno probówki wlewa się agar z surowicą, następnie warstwę samego agaru, potem roztwór antygenu, lub żel zawierający antygen - reagenty dyfundują do żelu obojętnego;

• Pojedyncza immunodyfuzja płytkowa (immunodyfuzja radialna, Mancini) → przeciwciała miesza się z płynnym agarem i wylewa na płytkę, po zastygnięciu wycina się studzienki i wypełnia roztworem badanego antygenu. Antygen dyfunduje pierścieniowo, tworząc pierścieniowe strefy precypitacyjne (tzw. halo) o średnicy wprost proporcjonalnej do stężenia antygenu, które można wyliczyć porównując do krzywej kalibracyjnej; stosowana do oznaczania ludzkich immunoglobulin surowicy poprzez umieszczenie w agarze np. przeciwciał anty-IgG;

• Podwójna immunodyfuzja płytkowa (PDA) → w żelu agarowym na płytce szklanej wycina się studzienki, do jednych wprowadza się roztwór antygenu, do drugich przeciwciała - reagenty dyfundują, a w strefie ekwiwalencji zaobserwujemy linie precypitacyjne (prosta - masy cząsteczkowe przeciwciała i antygenu są zbliżone; wygięcie w stronę danego reagentu natomiast świadczy o jego wyższej masie cząsteczkowej). Można badać jednocześnie różne surowice z jednym antygenem, lub różne antygeny z jedną surowicą i określić stopień podobieństwa antygenowego (reakcja identyczności - linie precypitacyjne łączą się łukowato; reakcja nieidentyczności - linie się krzyżują; reakcja częściowej identyczności - linie łączą się, ale z ostrogą).

Immunoelektroforeza - metoda łącząca elektroforezę z podwójną immunodyfuzją:

• mieszanina białek jest wstępnie rozdzielana w polu elektrycznym (próbka umieszczona w studzience wyciętej w 1% żelu agarowym → ruchliwość zależy od ładunku, masy i kształtu cząsteczki, a także od siły jonowej, pH środowiska i rodzaju podłoża);

• immunodyfuzja rozdzielonych elektroforetycznie antygenów i odpowiednich przeciwciał (w agarze wycina się rowek równoległy do kierunku migracji, i dodaje się do niego surowicę → antygeny i przeciwciała dyfundują, dając linie precypitacyjne w ich strefie ekwiwalencji; im wyższe było stężenie antygenu, tym bliżej rowka z surowicą znajduje się linia precypitacyjna).

Wyróżniamy:

• Immunoelektroforezę wg. metody Scheideggera → metoda tak jak opisano wyżej; przy badaniu surowicy ludzkiej do rowka nalewa się końską surowicę odpornościową poliwalentną przeciwko białkom surowicy ludzkiej;

• Immunoelektroforezę rakietkową wg. metody Laurella → pozwala na ilościową ocenę poszczególnych białek; na płytkę wylewa się agar z przeciwciałami, do studzienek dodaje się badany płyn ustrojowy i poddaje elektroforezie. Linie precypitacyjne przyjmą kształt stożka (rakietki), którego wysokość jest wprost proporcjonalna do stężenia antygenu (które odczytamy z krzywej wzorcowej);

• Elektroimmunodyfuzję (immunoelektroforeza przeciwprądowa) → w żelu agarowym wycina się dwie studzienki, do jednej wprowadza się antygen, do drugiej przeciwciała i poddaje się elektroforezie (warunki dobrane tak, by reagenty wędrowały do siebie → antygeny obdarzone ładunkiem ujemnym kierują się do anody; przeciwciała bez ładunku wędrują w wyniku endoosmozy w kierunku przeciwnym) - łuki precypitacyjne widoczne już po 30 minutach!

• Immunoelektroforeza krzyżowa → metoda jak rakietkowa, tylko pozwala na wykrycie kilku antygenów (pierwszy etap - elektroforeza badanego materiału na żelu, czyli rozdzielenie antygenów; drugi etap - dolanie przeciwciał i prowadzenie elektroforezy w kierunku prostopadłym do poprzedniego; w strefie ekwiwalencji dla poszczególnych antygenów powstają łuki precypitacyjne o kształcie stożków)... → Hyde opisał tę metodę tak samo jak przeciwprądową... (?)

Aglutynacja - reakcja, w której dochodzi do zlepiania się elementów upostaciowanych (aglutynogenów, którymi mogą być komórki np. erytrocyty lub sztuczne nośniki antygenu, np. cząsteczki lateksu, bentonitu, polistyrenu) pod wpływem swoistych przeciwciał (aglutynin) skierowanych przeciwko antygenom znajdującym się na ich powierzchni (własnym lub obcym, uprzednio opłaszczonym na ich powierzchni).

Przeciwciała niekompletne → nie mają zdolności aglutynacyjnych (mały kąt rozwarcia regionu zawiasowego powoduje powstawanie wiązania monogamicznego, tylko z jedna cząsteczką antygenu).

Cząsteczki antygenu posiadające ładunek elektrostatyczny nie aglutynują.

Reakcja aglutynacji zachodzi dwuetapowo:

• wiązanie aglutynogenu z aglutyniną (etap swoisty);

• wypadanie z roztworu powstałych kompleksów w postaci dobrze widocznych agregatów (aglutynatów).

Warunkami optymalnymi są: pH 6.8-7.2, 0.15-molowy roztwór NaCl, temperatura pokojowa.

Reakcje aglutynacji można podzielić na dwa typy:

• aglutynacja bezpośrednia (czynna) → przeciwciała reagują bezpośrednio z antygenami naturalnie występującymi na powierzchni komórek

• metoda szkiełkowa - na szkiełku przedmiotowym umieszcza się kroplę zawiesiny badanego antygenu i kroplę wstępnie zinaktywowanej surowicy zawierającej swoiste przeciwciała (aglutynaty tworzą na dnie kropli wyraźny strąt) → metoda stosowana do oznaczania grup krwi w zakresie układu AB0, lub w diagnostyce leptospirozy (odczyn Fletschera)

• metoda probówkowa - metoda półilościowa; w szeregu probówek przygotowuje się kolejne rozcieńczenia badanej surowicy, do każdej dodaje się taką samą ilość aglutynogenu; miano przeciwciał podaje się jako odwrotność największego rozcieńczenia surowicy, przy którym wystąpiła jeszcze aglutynacja → metoda stosowana w diagnostyce duru brzusznego (odczyn Widala), duru plamistego (odczyn Weil-Felixa) czy brucelozy (odczyn Wrighta)

Biorąc pod uwagę rodzaj antygenu powierzchniowego, wyróżniamy 3 typy aglutynacji bakterii:

1. aglutynację H (rzęskową, obłoczkową) - u bakterii posiadających antygen rzęskowy H (bakterie zlepiają się rzęskami tworząc delikatny strąt ulegający rozbiciu przy wstrząsaniu);

2. aglutynację O (komórkową, grudkową) - związaną z obecnością antygenu somatycznego O (bakterie zlepiają się biegunami, aglutynaty tworzą zwarte grudki opadające na dno probówki);

3. aglutynację Vi - związaną z obecnością antygenu powierzchniowego Vi (bakterie przylegają do siebie całą powierzchnią, aglutynaty osadzają się na dnie i bocznych ściankach probówki)

• aglutynacja pośrednia (bierna) → przeciwciała reagują z antygenem rozpuszczalnym, uprzednio opłaszczonym na nośniku (erytrocyty, cząsteczki lateksu, betonitu)
  (aglutynacja bierna odwrócona → cząsteczki nośnika opłaszcza się przeciwciałami, co pozwala na wykrycie antygenu w badanym materiale)

• odczyn lateksowy - cząsteczki lateksu opłaszczone danym antygenem inkubuje się z badaną surowicą i ocenia wystąpienie aglutynacji → metoda stosowana do wykrywania czynnika reumatoidalnego (RF) przy diagnozowaniu reumatoidalnego zapalenia stawów (test polega na opłaszczeniu cząsteczek lateksu IgG i umieszczeniu ich w surowicy, jeśli obecny jest RF [IgM skierowany przeciwko własnym IgG], to nastąpi aglutynacja), czy do wykrywania obecności antystreptolizyny O w diagnozowaniu trwających i przebytych chorób paciorkowcowych;
  (test w wersji odwróconej wykorzystywany jest do wykrywania obecności białka C-reaktywnego CRP w surowicy)

• odczyn hemaglutynacji - zjawisko aglutynacji erytrocytów opłaszczonych uprzednio danym antygenem, w obecności swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko temu antygenowi (erytrocyty będące nośnikiem nie powinny same reagować z badaną surowicą, dlatego stosujemy erytrocyty barana, lub ludzkie grupy 0 Rh-); oceniamy makroskopowo wystąpienie aglutynacji (dno płytki równomiernie pokryte krwinkami - wynik dodatni; na dnie zbity "guziczek" z erytrocytów - wynik ujemny)

• odczyn hamowania hemaglutynacji - jest odmianą odczynu hemaglutynacji, w którym przed dodaniem do surowicy opłaszczonych antygenem erytrocytów, surowicę inkubujemy z badanym materiałem, w którym poszukujemy tego antygenu (jeśli znajduje się on w próbie badanej, to zwiąże on przeciwciała, i po dodaniu erytrocytów nie zajdzie reakcja hemaglutynacji - wynik dodatni)

• odczyn antyglobulinowy Coombsa - służy do wykrywania przeciwciał niekompletnych, prowadzi się go w dwóch wariantach:

• odczyn bezpośredni - pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych opłaszczonych in vivo na erytrocytach (do zawiesiny erytrocytów dodaje się bezpośrednio przeciwciała antyglobulinowe, np. przy wykrywaniu obecności przeciwciał anty-D układu Rh w chorobie hemolitycznej noworodków)

• odczyn pośredni - pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych w surowicy (po opłaszczeniu erytrocytów wzorcowych badaną surowicą, dodajemy przeciwciała antyglobulinowe, np. przy wykrywaniu obecności przeciwciał anty-D układu Rh w surowicy matki w przypadku podejrzenia konfliktu serologicznego)

Pośredni odczyn Coombsa jest także wykorzystywany w teście Waalera-Rosego, do wykrywania obecności w surowicy czynnika reumatoidalnego RF (klasy IgM). W teście wykorzystuje się erytrocyty barana opłaszczone przeciwciałami króliczymi skierowanymi przeciwko erytrocytom barana (do opłaszczania stosuje się surowicę króliczą o stężeniu czterokrotnie mniejszym niż stężenie wywołujące aglutynację tych krwinek). Następnie inkubuje się je z kolejnymi rozcieńczeniami uprzednio zinaktywowanej surowicy badanej. Ponieważ w surowicach ludzkich znajdują się naturalne przeciwciała skierowane przeciwko białkom surowicy królika, aglutynacja może zajść nawet w przypadku nieobecności czynnika RF. Przyjęto, iż wynik dodatni to taki, w którym aglutynacja erytrocytów barana występuje przy rozcieńczeniu surowicy badanej 160x lub więcej.

ZŁOŻONE TECHNIKI SEROLOGICZNE:

Odczyn wiązania dopełniacza - kompleksy immunologiczne antygen-przeciwciało (IgG lub IgM) mają zdolność wiązania dopełniacza. Jeśli kompleks związany jest z erytrocytem, powoduje to jego lizę (hemoliza immunologiczna) - początkowo mętna zawiesina krwinek staje się klarowna o intensywnie czerwonym kolorze. Metodę tę stosuje się w diagnostyce wielu zakażeń bakteryjnych, grzybiczych i wirusowych. Przed wykonaniem odczynu należy przygotować:

• zinaktywowaną surowicę badaną,

• przeciwciała antyerytrocytarne (amboceptor, którym z reguły jest surowica królika uodpornionego erytrocytami barana),

• erytrocyty barana,

• dopełniacz (źródlem ktorego jest surowica świnki morskiej).

Odczyn wykonuje się dwuetapowo:

• układ testowy: inkubacja surowicy badanej ze znanym antygenem (lub odwrotnie) i dodanie dopełniacza (jeśli w surowicy obecne jest szukane przeciwciało, powstanie kompleks immunologiczny i zwiąże dopełniacz; jeśli nie, dopełniacz pozostanie w roztworze)

• dodanie układu wskaźnikowego - erytrocytów barana i hemolizyn (tj. przeciwciał antyerytrocytarnych) → jeśli uprzednio dopełniacz został związany, to nie nastąpi hemoliza krwinek - wynik dodatni (mętny roztwór)

Aktywność hemolityczna dopełniacza (CH₅₀) oznaczana jest przez ustalenie ilości surowicy wywołującej 50-procentową lizę opłaszczonych erytrocytów barana.

Odczyn antystreptolizyny O (ASO) - antystreptolizyna O jest przeciwciałem wytwarzanym w organizmie w odpowiedzi na zakażenie paciorkowcami beta-hemolizującymi grupy A; jest swoiście skierowana przeciwko streptolizynie O (SO). Zasada oznaczania poziomu ASO w surowicy oparta jest na hamowaniu przez antystreptolizynę zjawiska hemolizy erytrocytów zachodzącej pod wpływem SO:

• do probówek dodaje się kolejne rozcieńczenia badanej surowicy i roztwór streptolizyny o stałym stężeniu

• do każdej probówki dodaje się zawiesinę erytrocytów królika i inkubuje (jeśli erytrocyty nie uległy hemolizie - wynik dodatni)

Wynik podaje się w jednostkach międzynarodowych jako miano surowicy (odwrotność największego rozcieńczenia surowicy, przy którym hemoliza jeszcze nie wystąpiła) - miano do 200 j.m. przyjmuje się za prawidłowe; podwyższone świadczy o przebytych chorobach paciorkowcowych, choć u 5-10% ludzi zdrowych również stwierdza się podwyższone miano.

Poziom antystreptolizyny można też ocenić stosując odczyn lateksowy (do badanej surowicy dodaje się kroplę odczynnika lateksowego (zawiesina cząstek lateksu opłaszczonych oczyszczona streptolizyną O) → wystąpienie aglutynacji świadczy o obecności ASO w mianie wyższym niż 200 j.m.

Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników - polegają na wyznakowaniu jednego ze składników reakcji antygen-przeciwciało markerem; ze względu na użyty znacznik, wyróżniamy:

• metody fluorymetryczne (FIA) - znacznikami są fluorochromy fluoryzujace w świetle o krótkiej fali (izotiocyjanian fluoresceiny FITC emitujący światło zielone lub izotiocyjanian rodaminy B RITC emitujący światło czerwone); ze względu na środowisko reakcji, wyróżniamy:

• metody homogenne - przeprowadzane w środowisku płynnym; badany materiał inkubowany jest z przeciwciałami znakowanymi fluorochromem i mierzy się stopień wygasania fluorescencji w porównaniu do wyjściowej w miarę łączenia się przeciwciał z poszukiwanym antygenem

• metody heterogenne - jeden ze składników związany jest z fazą stałą (np. powierzchnią probówki polistyrenowej); po reakcji odpłukuje się supernatant i mierzy fluorescencję kompleksu związanego z fazą stałą; wyróżniamy:

• metody kompetycyjne - do przeciwciała związanego z fazą stałą dodaje się równocześnie antygen badany i homologiczny antygen znakowany fluorochromem, które konkurują o przeciwciała (natężenie fluorescencji będzie odwrotnie proporcjonalne do zawartości antygenu w próbie)

• metody pośrednie - antygen związany z fazą stałą inkubujemy z badaną surowicą (tworzą się kompleksy antygen-przeciwciało), po czym dodajemy wyznakowane fluorochromem przeciwciała homologiczne do tych poszukiwanych (im wyższe ich stężenie w badanym materiale, tym mniej przeciwciał wyznakowanych zwiąże się z antygenem)

• metody kanapkowe - przeciwciała związane z fazą stałą inkubujemy z badanym antygenem, po czym dodajemy znakowane fluorochromem przeciwciała, które "dołączają się" do powstałych kompleksów (natężenie fluorescencji wprost proporcjonalne do zawartości antygenu)

• metody radioimmunologiczne (RIA) - znacznikami są pierwiastki promieniotwórcze (najczęściej izotop ¹²⁵J); wyróżniamy:

• metodę kompetycyjną - przeciwciała inkubuje się z badanym antygenem w obecności homologicznego antygenu znakowanego izotopem, które współzawodniczą; ocenia się radioaktywność roztworu (wolny antygen) i kompleksu, oraz porównuje z krzywą kalibracyjną → stosuje się do oznaczania stężenia hormonów i białek związanych z nowotworami

• metoda bezpośrednia (Farra) - znakowany antygen inkubujemy z badanym materiałem, w którym poszukujemy przeciwciał; utworzony kompleks wytrąca się z roztworu np. siarczanem amonu i mierzy radioaktywność związaną z osadem → stosuje się do oznaczania poziomu przeciwciał anty-DNA

• metoda immunoradiometryczna (IRMA) - powierzchnię probówek pokrywa się nieznakowanymi przeciwciałami, dodaje badany materiał z poszukiwanym antygenem; po opłukaniu dodaje się przeciwciała znakowane i mierzy radioaktywność związaną ze ścianką probówki; dla IgE opracowano:

• test RAST (Radioallergosorbent Test) - służy do oceny stężenia przeciwciał IgE skierowanych przeciwko danemu antygenowi (alergen związany z nośnikiem inkubowany jest z badaną surowicą, po opłukaniu dodaje się przeciwciała anty-IgE znakowane jodem i ocenia radioaktywność, porównując z próbkami kontrolnymi)

• test RIST (Radioimmunosorbent Test) - służy do oceny całkowitego stężenia immunoglobuliny (nośnik opłaszczony nieznakowanymi anty-IgE inkubujemy z IgE, a po przepłukaniu dodajemy znakowane jodem anty-IgE, które dołącza do powstałych kompleksów); metoda stosowana do oceny poziomu IgG, stosując zamiast anty-IgE znakowane jodem białko A.

• metody immunoenzymatyczne (EIA) - znacznikami są enzymy, a produkty reakcji przeprowadzanych przez nie są barwne, co oceniamy spektrofluorymetrycznie; enzymy nie mogą występować w płynach biologicznych (stosuje się więc peroksydazę chrzanową HRP, fosfatazę alkaliczną AP, oksydazę glukozową GO); wiązane są one z białkiem (antygenem lub przeciwciałem) za pomocą aldehydu glutarowego; substratami dla reakcji jest H₂O₂ (redukowany do wody) i chromagen, przekształcany w barwny związek (stosowane chromageny: ortofenylenodwuamina, O-dwuanizydyna, kwas 5-aminosalicylowy i p-nitrofenylofosforan sodowy). Odczyn może być prowadzony metodą bezpośrednią (badany materiał inkubować ze znakowanym przeciwciałem, H₂O₂ i chromagenem) lub pośrednią (inkubacja materiału badanego z nieznakowanymi przeciwciałami, następnie ze znakowanymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko gammaglobulinie)

• test ELISA - stosowany w diagnostyce chorób zakaźnych (np. HIV) i pasożytniczych; powierzchnię dołków mikropłytki opłaszcza się antygenem, po opłukaniu dodaje się badaną surowicę w kolejnych rozcieńczeniach - po kolejnym przepłukaniu dodaje się przeciwciała skierowane przeciwko immunoglobulinie, płytkę opłukać i dodać H₂O₂ i chromagen → porównać z krzywą kalibracyjną.

Techniki immunomorfologiczne - pozwalają wykryć obecność przeciwciała lub antygenu związanego bezpośrednio z komórką lub tkanką. Biorąc pod uwagę przebieg reakcji, wyróżniamy metody bezpośrednie i pośrednie; biorąc za kryterium rodzaj użytego znacznika, wyróżniamy:

• techniki immunofluorescencyjne (IMF) - stosuje się barwniki FITC lub RITC; oprócz reakcji bezpośredniej i pośredniej, prowadzona jest też dwubarwna reakcja immunofluorescencji (wykorzystuje się fluorochromy emitujące światło o różnych barwach, dzięki czemu można równocześnie ocenić obecność dwóch różnych antygenów w jednym preparacie → jedne przeciwciała będą znakowane FITC, a drugie RITC)

• techniki immunoenzymatyczne (EIA) - stosowanymi chromagenami zazwyczaj są tetrachlorowodorek dwuaminobenzydyny (DAB, przekształca się w ciemnobrązowy nierozpuszczalny produkt) lub 3-amino-9-etylokarbazol (AEC, przekształca się w nierozpuszczalny produkt barwy czerwonej). Do najczęściej stosowanych odmian pośrednich reakcji immunoenzymatycznych należą:

• reakcja peroksydaza-antyperoksydaza (PAP) - po wstępnej inkubacji materiału badanego ze swoistymi przeciwciałami, do kompleksu antygen-przeciwciało dołącza się kompleks PAP za pomocą mostka (nieznakowanych przeciwciał o powinowactwie zarówno do przeciwciała pierwotnego jak i kompleksu enzym-antyenzym); dodanie H₂O₂ i chromagenu i ocena spektrometryczna

• reakcja fosfataza alkaliczna-antyfosfataza alkaliczna (APAAP) - zasada metody jak wyżej, lecz z zastosowaniem kompleksu APAAP; do substratu należy dodać lewamizol dla zahamowania aktywności fosfatazy endogennej

• reakcja przy użyciu układu biotyna-awidyna - utworzenie kompleksu antygen-przeciwciało (pierwotne); reakcja kompleksu z przeciwciałem wtórnym biotynylowanym (skierowanym przeciwko immunoglobulinie); reakcja powstałego kompleksu z kompleksem awidyna-biotynylowana peroksydaza (ABC - Avidin-Biotynylated peroxidase Complex), mającej zdolność przyłączania się do biotyny przeciwciała wtórnego.

Odmianą tej reakcji jest LAB (Labelled Avidin-Biotin), gdzie z biotynylowanym przeciwcialem wtórnym wiąże się wyznakowana enzymem awidyna.

TESTY KOMPETENCJI IMMUNOLOGICZNEJ

Test cytotoksyczny - zasada tego testu oparta jest na zjawisku niszczenia komórek docelowych w obecności swoistych przeciwciał i dopełniacza; reakcja przebiega w dwóch fazach: związanie przeciwciał z antygenami obecnymi na powierzchni komórek, oraz przyłączenie dopełniacza i uszkodzenie błony, co prowadzi do śmierci komórki.

Wynik reakcji oceniamy:

• metodą morfologiczną - dodając barwnik koloidalny (eozynę Y lub błękit trypanu), wychwytywany tylko przez komórki martwe;

• metodą izotopową - przed wykonaniem właściwego testu, komórki docelowe należy wyznakować izotopem chromu ⁵¹Cr; po reakcji z przeciwciałami komórki martwe uwalniają chrom do środowiska → oceniamy radioaktywność supernatantu.

Najczęściej test cytotoksyczny wykonuje się w modyfikacji opracowanej przez Terasaki i McClellenda (test mikrolimfocytotoksyczny):

• płytkę z zagłębieniami wypełniamy olejem parafinowym

• pod parafinę wprowadzamy surowicę anty-HLA o znanej swoistości i zawiesinę badanych limfocytów (w celu określenia antygenów zgodności tkankowej grupy II stosujemy limfocyty B, a czas inkubacji winien być dwa razy dłuższy)

• dodajemy dopełniacz, a po inkubacji barwnik i oceniamy pod mikroskopem

• poniżej 25% komórek martwych - wynik ujemny (nieobecny antygen)

• 26-45% komórek martwych - wynik wątpliwy

• >45% - wynik dodatni (antygen zgodności tkankowej obecny)

Metody izolacji komórek immunologicznie czynnych - najczęściej izoluje się limfocyty T, limfocyty B, monocyty, komórki NK, granulocyty; proces składa się z dwóch etapów:

• otrzymanie z tkanki zawiesiny komórkowej, zawierającej różne populacje komórek:

• z płynów ustrojowych - krew obwodową pobiera się na heparynę, cytrynian sodu lub EDTA (wersenian sodu) i poddaje sedymentacji; uzyskany nadsącz zawiera leukocyty z niewielką domieszką erytrocytów;

• z tkanek litych - rozdrabniamy tkankę mechanicznie by uwolnić komórki ze zrębu łącznotkankowego, po czym trawimy tkankę enzymami (kolagenazą, DNA-zą); zawiesinę komórek oddzielamy od tkanki przesiewając przez odpowiednie filtry.

• wyizolowanie z otrzymanej zawiesiny określonej populacji komórek:

• wirowanie na gradientach gęstości: najczęściej stosowanym gradientem jest mieszanina Ficoll-Uropolina (Ficoll → hydrofilny polimer cukrozy; Uropolina → rozpuszczalnik) wykorzystywany do izolacji limfocytów (a także do 15% monocytów i 5% granulocytów) z płynów ustrojowych czy komórek nowotworowych od limfoidalnych (równiez rozdzielane w roztworze surowicy cielęcej); stosowany jest też gradient Percollu (koloidalna krzemionka pokryta poliwinylopyrolidonem, rozcieńczacna roztworem NaCl) mający zastosowanie do rozdziału limfocytów T od B, izolacji komórek NK oraz do izolacji monocytów i granulocytów; przez wirowanie w gradiencie Gradisolu G (wodny roztwór Uropoliny i Dekstranu) uzyskujemy interfazę górną (zawierającą oczyszczone limfocyty) i interfazę dolną (neutrofile);

• metody adherencyjne: oparte na zdolności przylegania niektórych komórek do szkła lub plastiku; zawiesinę komórek inkubuje się w kolumnach wypełnionych np. watą nylonową, po czym wypłukuje się komórki nie zaadsorbowane; aby uzyskać komórki zaadsorbowane, podłoże przepłukujemy roztworem surowicy cielęcej (FCS);

• eliminacja komórek na drodze szoku osmotycznego: ma na celu usunięcie z mieszaniny erytrocytów przez dodanie wody destylowanej lub chlorku amonu;

• metody z zastosowaniem immunoadsorbentów: podczas inkubacji zawiesiny komórek z immunoadsorbentem następuje wiązanie się do opłaszczonych cząsteczek nośnika jedynie tych komórek, których antygeny reagują z danymi przeciwciałami; stosowana do izolacji poszczególnych subpopulacji limfocytów;

• metoda izolacji magnetycznej: paramagnetyczne cząstki polistyrenu (Dynabeads) opłaszczane są przeciwciałami i inkubuje z zawiesina komórek; komórki związane "wyciąga się" za pomoca magnesu

• metoda z wykorzystaniem zjawiska fagocytozy: dodając do zawiesiny komórek karbonylku żelaza, komórki fagocytujące możemy oddzielić za pomocą magnesu;

• tworzenie rozet: oparta na spontanicznym zjawisku wiązania się erytrocytów barana z limfocytami T poprzez antygen CD2; utworzone rozetki wirujemy na gradiencie.

Ocena fenotypu: metody różnicowania poszczególnych subpopulacji limfocytów oparta jest na identyfikacji antygenów różnicowania CD (Cluster Differentiation), np. CD2 (komórki NK), CD3 (limfocyty T), CD4 (limfocyty T pomocnicze), CD8 (limfocyty T supresorowo-cytotoksyczne), CD19 i CD20 (limfocyty B). Fenotyp komórek oceniamy techniką immunofluorescencji stosując przeciwciała anty-CD.

IgM są charakterystyczne dla dojrzałych limfocytów B. W pre-B łańcuchy μ są w cytoplazmie. Rozróżniamy barwiąc fluoresceiną, a po utrwaleniu (gdy błony stają się przepuszczalne dla białek) - rodaminą. Dojrzałe limfocyty będą miały czerwoną cytoplazmę z zielonym rąbkiem, a pre-B → tylko czerwoną cytoplazmę.

Metody oceny czynnościowej komórek układu immunologicznego:

• test transformacji blastycznej: pozwala określić ogólny stan czynnościowy limfocytów oraz wykryć ogólne defekty układu immunologicznego zależne od wad jego komórek; transformacja blastyczna to zjawisko polegające na przechodzeniu limfocytów dojrzałych w formy niedojrzale pod wpływem stymulacji swoistej (antygeny np. oczyszczona tuberkulina PPD, anatoksyna tężcowa, anatoksyna błonicza, LPS bakteryjny, surowice antylimfocytarne i antyimmunoglobulinowe) lub nieswoistej (czynniki mitogenne, czyli lektyny np. fitohemaglutynina PHA, konkanawalina A czy mitogen szkarłatki PWM); ocenę transformacji blastycznej można przeprowadzić:

• metodą morfologiczną (barwiąc metodą Pappenheima; w preparacie nie stymulowanym indeks blastyczny nie powinien przekroczyć 7%);

• metodą izotopową (opartą na pomiarze inkorporacji do kwasów nukleinowych radioaktywnie znakowanej tymidyny lub białek, np. leucyny).

• metody oceny sprawności czynnościowej fagocytów:

• ocena adherencji fagocytów → stosując kolumny wypełnione watą nylonową; po odpłukaniu komórek nie adherujących, dodaje się barwnik MTT, który przekształcany jest przez komórki w pochodną - farmazan barwy niebieskiej;

• badanie migracji fagocytów → prowadzone może być w komorach Boydena (składajacych się z dwóch przedziałów oddzielonych filtrem; w górnej części komory umieszcza się zawiesinę badanych komórek, natomiast w dolnej części czynnik chemotaktyczny; błonę filtru wybarwia się i bada mikroskopowo) lub na płytce w żelu agarowym (wycina się 3 studzienki: w środkowej umieszcza się zawiesinę komórek, a w studzienkach po obu jej stronach → płyn hodowlany i czynnik chemotaktyczny; po wybarwieniu metodą Pappenheima wyznaczamy indeks chemotaktyczny, czyli stosunek migracji w kierunku czynnika chemotaktycznego do migracji swobodnej w kierunku płynu hodowlanego);

• badanie fagocytozy → do probówki dodaje się zawiesinę badanych komórek i zawiesinę cząstek fagocytowanych w stosunku 1:6, a po odwirowaniu i wybarwieniem barwnikiem Giemza oblicza się indeks fagocytarny (stosunek liczby cząstek sfagocytowanych do komórek fagocytujących); można również znakować cząstki fagocytowane fluoresceiną lub pierwiastkiem promieniotwórczym i dokonać odczytu odpowiednio spektrofluorymetrycznego lub radioizotopowego;

• ocena aktywności bakteriobojczej → żywotność bakterii oceniamy dodając oranżu akrydyny lub barwnika fluorescencyjnego; żywe bakterie świecą na zielono, martwe na czerwono

• ocena metabolizmu wewnątrzkomórkowego fagocytów → można albo dokonać oceny wybuchu tlenowego (spektrofluorymetrycznie oceniając redukcję cytochromu C przez produkowany podczas przemian bakteriobojczych anion ponadtlenkowy), albo wykonać test pochłaniania i redukcji NBT (błękitu nitrotetrazoliowego, który łatwo dostaje się do komórek podczas fagocytozy i ulega redukcji w fagolizosomach do nierozpuszczalnego farmazanu barwy ciemnogranatowej).

• ocena produkcji cytokin: dokonywana przez ocenę wpływu cytokin na komórki testowe wrażliwe na ich działanie; do kolejnych dołków na płytce hodowlanej dodaje się zawiesinę limfocytów T zależnych od Il-2 oraz badany płyn w kolejnych rozcieńczeniach, do hodowli dodaje się znakowaną trytem tymidynę i określa proliferację komórek testowych na podstawie inkorporacji znakowanej tymidyny;

• oznaczanie aktywności cytotoksycznej komórek: ogólna zasadą tych testów jest inkubacja komórek atakujących (efektorowych) z atakowanymi (docelowymi), a następnie ocena liczby uszkodzonych komórek:

• metodą morfologiczną - dodając błękit trypanu wychwytywany jedynie przez komórki martwe, i dokonując pomiaru spektrofotometrycznego;

• metodą izotopową - przed inkubacją znakuje się komórki docelowe izotopem chromu, a po reakcji ocenia się radioaktywność supernatantu

Szczegółowe warunki przeprowadzania testu zależą od rodzaju badanych komórek efektorowych:

1. komórki K - przeprowadza się test ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity), w którym komórki docelowe (erytrocyty ludzkie/baranie lub komórki nowotworowe) muszą być dodatkowo wstępnie opłaszczone przeciwciałami IgG3;

2. makrofagi, neutrofile - należy najpierw przeprowadzić inkubację komórek efektorowych z zawiesiną zabitych bakterii;

3. komórki NK - jako komórki testowe stosuje się komórki linii ludzkiej białaczki erytroleukemicznej K 562.

Cytofluorymetria przepływowa - słuzy do wieloparametrowej oceny komórek znajdujacych się w zawiesinie, które są kierowane do kanału w strumieniu cieczy formowanym siłami hydrodynamicznymi (warunki przepływu dobrane tak, by komorki przepływały pojedynczo). Wiązka światła (niebieskie lub ultrafioletowe) oswietla komórki i wzbudza fluorescencje, jeśli były one wyznakowane znacznikami fluorescencyjnymi. Detektory odbierają światło ugięte, rozproszone i fluorescencyjne. Każda komórka może mieć zmierzone takie parametry jak ugięcie światla na jej brzegach, rozproszenie swiatła na jej strukturach wewnątrzkomórkowych czy natężenie fluorescencji, którego źródłem moze być:

• autofluorescencja - stosunkowo wysoka w komórkach martwych

• sondy - służące do pomiarów zawartości DNA i RNA w komórce (stosuje się jako barwniki różową fikoerytrynę, fioletową fikocyjaninę i zieloną allofikocyjaninę; do oznaczania DNA stosowany jest jodek propydyny)

PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE

• powstałe w wyniku fuzji limfocytów B (wytwarzających swoiste przeciwciała) i komórek szpiczaka (nadają hybrydom „nieśmiertelność” oraz dostarczają rybosomów do wytwarzania białek); hybrydy „nieprawidłowe” nie przeżyją ponieważ:

• hybrydy z dwóch limfocytów B nie są „nieśmiertelne” → giną spontanicznie (alternatywna metoda „unieśmiertelniania - transformacja wirusem Epsteina-Barra)

• hybrydy z dwóch komórek szpiczaka nie otrzymają od limfocytu niezbędnego im do życia enzymu (do fuzji wykorzystuje się komórki szpiczaka z defektem metabolicznym)

• do produkcji ludzkich limfocytów B o odpowiedniej swoistości wykorzystuje się myszy:

• chimeryczne - cierpiące na ciężki złożony niedobór odporności, których układ immunologiczny zastępuje się limfocytami człowieka (uczulanie takich myszy pozwala na otrzymanie odpowiednich ludzkich limfocytów B)

• transgeniczne - geny immunoglobulinowe poddaje się inaktywacji, i wprowadza się do mysich limfocytów B geny immunoglobulinowe człowieka

• PM chimeryczne → części zmienne pochodzą od myszy, części stałe od człowieka

• PM uczlowieczone → regiony hiperzmienne pochodzą od myszy, pozostałe sekwencje od człowieka

• zastosowanie:

• OKT3 (anty-CD3 na limfocytach T) oraz PM anty-IL-2R indukują immunosupresję; wykorzystanie w przeciwdziałaniu odrzucania przeszczepów allogenicznych

• PM przeciwko cząsteczce CD4 - zastosowanie w chorobach autoimmunizacyjnych

• PM przeciwko miozynie - lokalizowanie zawału serca

• leczenie nowotworów

• immunotoksyny

• przeciwciało sprzężone z toksyną, np. roslinna rycyna czy bakteryjna dyfterotoksyna, które unieczynniają czynnik wydłużający EF-2 poprzez jego ADP-rybozylację (hamowana jest więc synteza białek, a więc komórka jest zabijana niezależnie od tego czy dzieli się czy nie)

• stosowane w leczeniu białaczek, chłoniaków, raku sutka, jajnika, okrężnicy, płuc, pęcherza

• przeciwciała przeciwnowotworowe mogą być również sprzęzone z:

• lekami → mitomycyna C, adriamycyna, metotreksat, duanorubicyna

• enzymami → miejscowa aktywacja proleku podanego systemowo zmniejsza jego toksyczność

• radioizotopami emitującymi czasteczki β (Jod-131, Itr-90, Bizmut-212, Miedź-67)

• przeciwciała sprzężone z radioizotopami emitującymi cząsteczki γ (Jod-123, Ind-111) stosowane są do celów diagnostycznych

• przeciwciała o podwójnej swoistości stosowane są do zbliżania komórek, jednocześnie dostarczając sygnału do stymulacji:

• dla limfocytów T stosuje się PM anty-CD3 i anty-CD28

• dla komórek NK - PM anty-CD2 lub anty-CD16 (FcγRIII)

• dla makrofagów - PM anty-CD64 (FcγRI)

• dla neutrofili - PM anty CD89 (FcαR)

• przeciwciała katalityczne (abzymy) → przyspieszają reakcje przez stabilizację stanu przejściowego; otrzymuje się je przez uczulanie czasteczkami bedącymi analogami stanu przejściowego; w hemofilii A wynikającej z niedoboru czynnika VIII wykryto naturalnie występujące przeciwciała katalityczne zdolne do hydrolizy tego czynnika

---