Ćwiczenie 8

Główny układ zgodności tkankowej

Rolą antygenów zgodności tkankowej jest prezentacja obcych antygenów własnym limfocytom T.

Cząsteczki MHC są glikoproteinami. Wyróżniamy:

• MHC klasy I

• występują na powierzchni wszystkich komórek jądrzastych i w niewielkich ilościach również na erytrocytach;

• mają skłonność do łączenia się w tetramery

• zbudowane z łańcucha ciężkiego (α) i lekkiego (β₂-mikroglobulina); łańcuch lekki jest identyczny we wszystkich cząsteczkach MHC I człowieka; łańcuch ciężki składa się z:

• N-końcowego fragmentu zewnątrzkomórkowego:

• składa się z trzech domen tworzących pętle (α₁, α₂, α₃), przy czym zewnętrzne α₁ i α₂ zawierają łańcuchy cukrowe i odznaczają się polimorfizmem, będący podstawą różnic między cząsteczkami MHC I różnych osobników, a α₃ nie wykazuje polimorfizmu

• domeny α₁ i α₂ utworzone są z jednej helisy α, i 4 pasem β - wspólnie tworzą między sobą rowek, którego brzegi utworzone są przez helisy, a dno przez równolegle biegnące pasma

• w rowku między pasmami β znajduje się 6 kieszonek (A-F), w które wchodzą łańcuchy boczne aminokwasów kotwiczących (cząsteczki MHC wymagają związania 2-3 aminokwasów danego antygenu by go efektywnie prezentować)

• determinanty rozpoznawane przez limfocyty T znajdują się na helisach α

• obie domeny osadzone są na domenie α₃ i β₂-mikroglobulinie, stykające się z kolei z błoną komórkową.

• krótkiego fragmentu hydrofobowego przechodzącego przez błonę komórkową

• krótkiego wewnątrzkomórkowego fragmentu hydrofilowego

• prezentują krótkie peptydy, pochodzenia wewnątrzkomórkowego

• MHC klasy II

• występują głównie na limfocytach B, makrofagach i komórkach dendrytycznych (czyli komórkach prezentujących antygen APC), natomiast pod wpływem cytokin (np. IFN-γ) pojawiają się na limfocytach T, komórkach śródbłonka, tymocytach, enterocytach, keratynocytach czy fibroblastach;

• mają skłonność do łączenia się w dimery

• zbudowane są z łańcucha α i β o podobnych budowach, których części zewnątrzkomórkowe zbudowane są z 2 domen → domeny zewnętrzne (α₁ i β₁) tworzą rowek podobny do tego, który tworzą domeny α₁ i α₂ łańcucha ciężkiego cząsteczek MHC I - polimorfizm cząsteczek MHC II dotyczy więc głównie tych domen

• prezentują antygeny które mogą wystawać po obu stronach rowka i są pochodzenia zewnątrzkomórkowego

Zespół nagich limfocytów - niedobór odporności wywołany dziedzicznym defektem ekspresji cząsteczek MHC; wyróżniamy:

• typ I - brak ekspresji cząsteczek MHC klasy I

• typ II - brak ekspresji cząsteczek MHC klasy II

• typ III - brak ekspresji cząsteczek MHC obydwu klas

Ekspresję cząsteczek MHC obydwu klas wzmaga IFN-γ i TNFα.

Ekspresję cząsteczek MHC klasy II na limfocytach B wzmaga Il-4 i Il-13.

Ekspresję cząsteczek MHC klasy II hamują TGFβ, IFN- β, Il-10, PGE₂ i glikokortykosteroidy.

Synteza cząsteczek MHC:

• MHC klasy I

• niezależna synteza i transport do wnętrza siateczki śródplazmatycznej łańcucha ciężkiego i lekkiego (łańcuch ciężki wewnątrz siateczki połączony jest z białkami opiekuńczymi - kalneksyną i kalretikuliną, zapobiegając przedwczesnemu połączeniu z łańcuchem lekkim)

• formowanie cząsteczki MHC wewnątrz siateczki - połączenie łańcucha lekkiego i ciężkiego jest stabilizowane przez związanie prezentowanego peptydu (antygenu wirusowego lub własnego, transportowanego do siateczki przez białka TAP)

• wędrówka cząsteczek MHC do błony komórkowej poprzez aparat Golgiego

• dotarcie do powierzchni błony komórkowej w ok. 30 min

• MHC klasy II

• podczas łączenia się wewnątrz siateczki śródplazmatycznej łańcucha α i β, przyłącza się do rowka łańcuch niezmienny In (zachodzi to z udziałem kalneksyny)

• powstały kompleks przechodzi poprzez aparat Golgiego do tzw. wczesnych endosomów → w czasie wędrówki łańcuch In jest przycinany, i pozostaje z niego tylko peptyd CLIP

• we wczesnych i późnych endosomach peptyd CLIP oddysocjowuje, a przyłączany jest egzogenny antygen (skrzyżowanie drogi egzo- i endocytozy)

• dotarcie do powierzchni błony komórkowej w ciągu 2-4 godzin

Szczep wsobny - osobniki o identycznym genotypie, otrzymane w wyniku kojarzenia przez 20 pokoleń brata z siostrą lub potomstwa z rodzicem.

Haplotyp - kombinacja alleli różnych genów znajdujacych się w jednym chromosomie i dziedziczone en bloc - innymi słowy odcinek chromosomu dziedziczony w całości.

Kompleks genów układu zgodności tkankowej umiejscowiony jest w chromosomie 6 (przy czym gen kodujacy łańcuch lekki cząsteczki MHC klasy I umiejscowiony jest w chromosomie 15!). Produkty genów układu HLA mozemy podzielic na:

• cząsteczki klasy I

• klasyczne (Ia) → HLA -A, HLA-B, HLA-C

• nieklasyczne (Ib) → HLA-E (wraz z HLA-G w życiu zarodkowym ograniczona jest do tkanek pozazarodkowych → np. chronią komórki trofoblastu przed komorkami NK matki), HLA-F, HLA-G

• cząsteczki klasy II

• klasyczne → HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR

• nieklasyczne → HLA-DM, HLA-DO

• cząsteczki klasy III → różne białka, np. składniki dopełniacza C2, C4 i czynnik B

Niezrównoważenie sprzężeń - różnice między oczekiwaną (zakładajacą przypadkowość) a prawdziwą częstośc kombinacji określonych alleli. Może ono być dodatnie (częsta koegzystencja) lub ujemne. Przykładem jest najczęściej wystepujacy haplotyp u przedstawicieli raasy kaukaskiej zawierający allele dla cząsteczek HLA-A1, HLA-B8 i HLA-DR3.

Występowanie określonych cząsteczek HLA może się wiązać ze zwiekszonym lub zmniejzonym ryzykiem rozwoju pewnych chorób. Np. wystepowanie cząsteczek HLA-B8 i HLA-DR3 jest połączone ze zmniejszonym ryzykiem rozwoju raka jądra lub miesaka Kaposiego, a HLA-B53 efektywnie prezentuje antygeny sporozoitów zarodźca malarii, zmniejszając ryzyko jej rozwoju.

Przykłady istotnych statystycznie korelacji między układem HLA a chorobami:

• HLA-DR2 → zespół Goodpasteure'a, stwardnienie rozsiane

• HLA-DR3 → celiakia, zapalenie opryszczkowe, choroba Addisona, toczeń rumieniowaty układowy, cukrzyca typu I, choroba Gravesa-Basedowa

• HLA-B8 → przewlekłe aktywne zapalenie wątroby, miastenia

• HLA-B27 → zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, zespoł Reitera

Metody identyfikacji HLA:

• typowanie serologiczne - wykorzystuje reakcje wiązania swoistych przeciwciał z antygenami na powierzchni komórek; głównym źródlem przeciwciał są surowice uczulonych ludzi (wieloródki, biorcy rpzeszczepów) lub przeciwciała monoklonalne

• typowanie komórkowe - wykorzystuje zdolność cząsteczek MHC klasy II do stymulacji proliferacji limfocytów nie majacych danych antygenów

• typowanie genetyczne - wykorzystuje analize polimorfizmu na poziomie DNA

• metoda hybrydyzacyjna - namnozenie metodą PCR i naniesienie otrzymanego produktu na błonę nylonową; inkubacja w roztworze sondy molekularnej (znakowane fragmenty jednoniciowego DNA, komplementarne do regionów charakterystycznych dla allelu)

• analiza polimorfizmu miejsc restrykcyjnych produktu reakcji polimerazy PCR - czyli trawienie namnozonego metodą PCR fragmentu DNA enzymami restrykcyjnymi

• swoista w stosunku do sekwencji reakcja PCR - przeprowadzenie reakcji PCR z różnymi zestawami starterów (starter dobrany tak, by reakcja zaszła tylko wprzypadku obecności okreslonego allela)

• sekwencjonowanie DNA

Słabe antygeny zgodności tkankowej - zdolne do indukowania limfocytów T_c i odrzucenia przeszczepu nawet w przypadku całkowitej zgodności w ukladzie MHC; najczęściej nie indukują one powstawanie przeciwcial, i rozpoznawane są przez limfocyty T w połączeniu z cząsteczkami MHC klasy I i II (a więc analogicznie do antygenów wirusowych);wydaje się że produkt bialkwoey praktycznie każdego genu polimorficznego może połączony z cząśteczkami MHC indukować odpowiedź transplantacyjną i spelniać rolę tzw. słabego antygenu zgodności tkankowej.

Immunologia transplantacyjna

Wyróżniamy następujące rodzaje przeszczepów:

• autologiczny (autogeniczny) - dawcą i biorcą jest ten sam osobnik

• izogeniczny (syngeniczny) - między identycznymi osobnikami danego gatunku (bliźnięta monozygotyczne, szczepy wsobne u zwierząt)

• allogeniczny - między różnymi genetycznie osobnikami tego samego gatunku

• ksenogeniczny - między osobnikami odmiennych gatunków

• przeszczep zgodny (concordant) - między zbliżonymi gatunkami (małpy naczelne)

• przeszczep niezgodny (discordant) - między odległymi gatunkami (świnia i pawian)

W przebiegu odpowiedzi na antygeny przeszczepu możemy wyróżnić:

• fazę indukcji odpowiedzi (aferentną) - prezentacja i rozpoznanie obcych antygenów

• fazę efektorową (eferentną) - pobudzenie limfocytów T_h, i uruchomienie mechanizmów

• swoistych - stymulacja limfocytów B do wytwarzania przeciwciał

• nieswoistych - zwiększenie aktywności limfocytów T_c, makrofagów i komórek NK

Stymulacja bezpośrednia - indukcja odpowiedzi immunologicznej biorcy przez komórki prezentujące antygen dawcy (usunięcie komórek APC z narządu przed przeszczepem hamuje wystąpienie odrzucania); dochodzi do niej w regionalnych węzłach chłonnych lub w śledzionie biorcy, do których docierają APC przeszczepionego narządu. Najważniejszymi APC są komórki dendrytyczne prezentujące antygeny w połączeniu zarówno z cząsteczkami MHC I (aktywując Tc) jak i MHC II (aktywując Th). Role APC mogą spełniać aktywowane (np. przez IFN-γ) komórki śródbłonka. Same komórki miąższowe (posiadające cząsteczki MHC I aktywujące limfocyty T CD8+) nie są odpowiedzialne za proces odrzucania przeszczepu, gdyż nie wykazują obecności cząsteczek rodziny B7 (CD80/86), więc nie dostarczają drugiego sygnału aktywacji, i raczej dochodzi do powstania tolerancji w wyniku indukcji anergii.

Odpowiedź immunologiczną na obce cząsteczki MHC wyróżnia znacznie większe nasilenie w porównaniu do reakcji na inne antygeny, co związane jest z tym, że jedna cząsteczka MHC tworzy kilka odmiennych kombinacji MHC-peptyd, aktywujących wiele klonów limfocytów T („puste” cząsteczki MHC prawdopodobnie nie są rozpoznawane przez limfocyty T).

Stymulacja pośrednia - antygen dawcy prezentowany jest przez APC biorcy; stymulacja ta leży u podłoża przewlekłego odrzucania przeszczepu.

Odpowiedź transplantacyjna

Proces odrzucania przeszczepu jest odczynem zapalnym wywołanym przez swoistą reakcję immunologiczną. Na podstawie czasu, w jakim doszło do niewydolności przeszczepu i mechanizmu, wyróżniamy odrzucanie:

• nadostre

• rozwija się w ciągu kilku minut po przeszczepieniu, prowadząc do jego niewydolności

• przyczyną jest obecność przeciwciał przeciwko cząsteczkom MHC, antygenom grupowym AB0, czy też niezbyt dokładnie poznanym antygenom swoistym dla śródbłonka; powstanie kompleksu antygen-przeciwciało aktywuje układ dopełniacza i układ krzepnięcia oraz wyzwala czynniki chemotaktyczne

• dochodzi do wykrzepiania krwi wewnątrz naczynia i obfitych nacieków (głównie neutrofile); po pewnym czasie powstaje rozległa martwica krwotoczna tkanek (toksyczne działanie wobec śródbłonka wywiera układ dopełniacza, PAF, enzymy lizosomowe uwolnione z płytek i granulocytów oraz białko kationowe granulocytów)

• proces dotyczy naczyń włosowatych i małych tętniczek

• ostre przyspieszone (lub: ostre odrzucanie naczyniowe)

• rozwija się 24h po przeszczepieniu, prowadząc do niewydolności po ~ 6 miesiącach

• przyczyną jest obecność przeciwciał przeciwko dawcy, ale w małym stężeniu, niewykrywalnym w rutynowym teście cytotoksycznym

• zmiany morfologiczne przypominają odrzucanie nadostre, ale dotyczą tętnic; stwierdza się martwicę włóknikową błony środkowej i złogi włóknika i płytek w świetle naczynia

• ostre (lub: śródmiąższowe/komórkowe)

• następuje kilka dni do kilku miesięcy po przeszczepieniu

• decydującą rolę w patogenezie pełnią limfocyty T CD4+ (szczególnie T_h1; z kolei limfocyty T_h2 z jednej strony indukuja tolernację, z drugiej strony uwalniając Il-5 powodują migrację eozynofilów do narządu), które:

• aktywują limfocyty CD8+ przez uwalniane cytokiny; limfocyty T_c powodują śmierć komórek przez perforynę i granzymy oraz interakcję Fas-FasL

• indukują odpowiedź o typie nadwrażliwości późnej z udziałem makrofagów

• wywierają bezpośredni efekt cytotoksyczny poprzez cząsteczkę Fas (CD95)

• powstają nacieki w tkankach (głównie limfocyty T CD8+ i makrofagi, a także limfocyty B i komórki NK → te ostatnie mają na swojej powierzchni receptory KIR rozpoznające własne antygeny MHC, i hamujące ich aktywność), po wcześniejszym gromadzeniu się komórek w świetle małych naczyń; zaawansowanie procesu nie wpływa na skład nacieków, lecz o jego nasileniu świadczy ilość perforyn i granzymów w tkankach; obserwujemy duże stężenie komórek wytwarzających Il-2 i IFN-γ

• przeciwciała wytwarzane przez limfocyty B obecne w naciekach odpowiedzialne są za zmiany naczyniowe (odwarstwianie śródbłonka tętnic i tętniczek) poprzez aktywację dopełniacza, uwalnianie C3a i C5a, wywołanie reakcji ADCC i aktywację układu krzepnięcia, stąd odrzucanie z wyraźnie zaznaczonymi zmianami w tętnicach nosi nazwę humoralnego

• duze znaczenie mają cytokiny, które:

• aktywują limfocyty T_c → Il-2, -4, -7, -12, -15, -18, -21, IFN-γ

• bezposrednio uszkadzają komórki przeszczepu → limfotoksyna, Il-1, TNF

• stymulują wytwarzanie przeciwciał biorących udział w ADCC → Il-2, -6, IFN-γ

• ułatwiają powstawanie odczynu zapalnego → Il-1, -2, -4, -5, -6, IFN-γ, TNF

• działają chemotaktycznie → RANTES, MIP-1α, MCP-1

• inicjuja nadwrażliwosc typu późnego → IFN-γ, GM-CSF, TNF

• poddaje się leczeniu glikokortykosteroidami lub przeciwciałami antylimfocytarnymi

• przewlekłe

• następuje nie wcześniej niż rok po zabiegu

• czynnikiem inicjującym jest uszkodzenie śródbłonka naczyń przez limfocyty T_c i swoiste przeciwciała, o zbyt małym natężeniu by wywołać reakcję ostrą; dochodzi do:

• aktywacji komórek śródbłonka → wydzielanie PDGF, PAF, TNF i tromboksanów

• zwiększonej ekspresji cząsteczek adhezyjnych i czynnika tkankowego (TF) aktywującego układ krzepnięcia

• zwiększa się migracja komórek z krążenia do ściany naczynia (makrofagi, limfocyty T, granulocyty) → wydzielane cytokiny i czynniki wzrostowe (PDGF, TGFβ, FGF, IGF) oddziałują na miocyty, które z fenotypu kurczliwego zmieniają się na endokrynne (płodowe), a także wywierają działanie mitogenne na fibroblasty

• na podbudzonych komórkach śródbłonka wzrasta aktywnośc enzymu konwertujacego (ACE) wytwarzającego angiotensynę II, bedącym silnym mitogenem miocytów, fobroblastów i komórek mezangium kłębuszka nerkowego

• w efekcie obserwujemy powolną przebudowę naczyń tętniczych średniego kalibru → proliferacja i migracja miocytow oraz fibroblastow z błony srodkowej powoduje znaczne zwężenie światła naczynia skutkując niedokrwieniem narządu, i zastępowaniem miąższu narządu tkanką włóknistą

Typowanie tkankowe - proces doboru odpowiedniego biorcy i dawcy. W przypadku przeszczepu nerek dawca i biorca powinni wykazywać jak najwięcej wspólnych antygenów HLA oraz biorca nie powinien być wcześniej uczulony antygenami dawcy; wymagana jest też zgodność w układzie grupowym krwi AB0 - cząsteczki A i B występują również na śródbłonku naczyń, podczas gdy cząsteczki układu Rh występują tylko na erytrocytach!).

Jako zasadę preferuje się pary o jak najmniejszej liczbie niezgodnych antygenów (mismatch), niż zestawienie biorcy i dawcy o jak największej liczbie zgodnych antygenów - najlepsze wyniki daje zgodność w w zakresie HLA-DR (efekt niezgodności widoczny po 6 miesiącach) i HLA-B oraz w pewnym stopniu HLA-A (efekt niezgodnosci wykrywalny dopiero po 2 latach).

Antygeny „split” → należące do jednej rodziny, ale wyklazujące niewielki odrębności.

Pewne antygeny HLA-A i HLA-B, nawet pochodzące z różnych „rodzin” mogą wykazywać zbliżoną zdolność do indukcji swoistej odpowiedzi immunologicznej. Grupy takich antygenów nazywamy CREG (cross-reacting groups), i posiadanie ich przez dawcę i biorcę zmniejsza ryzyko odrzucenia przeszczepu.

Niektóre niezgodności są słabo immunogenne - dopuszczalna niezgodność, inne są silnie immunogenne - efekt tabu).

Powyższe dotyczy nerek; przeszczepianie innych narządów (wątroby, serca, trzustki) wymaga tylko zgodności w zakresie układu AB0. Jedyny wyjatek stanowi przeszczepianie serca niemowlętom.

Wcześniejsze przetoczenia krwi poprawiały wyniki leczenia przeszczepianiem narządów!

Przeszczepianie tkanek krwiotwórczych

• przeszczep szpiku

• autologiczny

• stosowany jako leczenie wspomagające chemioterapie lub radiochemioterapie nowotworow (nie tylko białaczki, ale również nowotwory lite)

• komórki nowotworowe usuwane są za pomocą fizycznych metod separacji komórek, cytostaykow lub przy użyciu odpowiednich przeciwciał monoklonalnych

• allogeniczny

• stosowany w celu rekonstytucji układu odpornościowego w białaczkach, szpiczaku mnoginm, SVID, niedokrwistoścvi aplastycznej, osteoporozie, nieodwracalnym uszkodzeniu szpiku w trakcie chemioterapii guzów litych

• alloreaktywne limfocyty T pochodzące z przeszczepionego szpiku mogą naciekać taknki gospodarza i wywierać na nich bezpośredni efekt cytotoksyczny → choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVH). W patogenezie tej choroby biora udział zarowno limfocyty T CD8+ jak i T CD4+. Obsereuje się „burzę cytokinową” → wzrost stężenia IFN-γ, GM-CSF, TNF, Il-1, -2, -4 i -6 (wydzielane przez limfocyty dawcy, a także u biorcy w wyniku mechanicznego uszkodzenia tkanek podczas transplantacji); wyróżniamy postać:

• ostrą → pwstaje w ciau 100 dni; objawy związane są z zajęciem skóry, błon śluzowych przewodu pokarmowego oraz wątroby; czynnikami ryzyka są: uprzednie ciąże u dawcy, przeszczep od kobiety do mężczyzny, podeszły wiek, nie stosowanie immunosupresji, wcześniejsze zakażenie wirusem opryszczki

• przewlekłą → czynnikami ryzyka są jw. podeszły wiek i przeszczep od kobiety do meżczyzny, ponadto: przetoczenia leukocytów, przebyta ostra postać GVH oraz stosowanie dużych dawek promieniowania

---