Wykład 6

• Udział helikaz RecQ w utrzymaniu stabilności genomu

Rola związana z:

• Replikacją

• Naprawą DNA(BER, podwójne pęknięcia)

• Transkrypcją

• Utrzymaniem telomerów

• Zespół Blooma

• Dziedziczenie autosomalne recesywne

• Gen BLM (32 eksony, ok. 100kb)

• Opisany w 1954 (3 przypadki)

• Lokalizacja 15q26.1

• Objawy kliniczne:

• Karłowaty wzrost;

• Małogłowie;

• Teleangiektazja skóry w miejscach ekspozycji na UV, rozwija się w pierwszych latach życia, może być chroniczny, hiperpgmentacja;

• Niedobór odporności (komórkowej i humoralnej);

• Częste zapalenia płuc, ucha, podwyższone ryzyko zachorowań na cukrzycę;

• Nowotwory (wszystkie typy, szczególnie leukemie, chłoniaki, guzy lite-przyspieszony wzrost) występują bardzo wcześnie 20-30 rok życia;

• Częstość nosicielstwa: 1/60 000, u Żydów Aszkenazyjskich 1/100.

• Poziom komórkowy:

• Niestabilność chromosomów (symetryczne figury czteroramienne - wymiana chromatyd między chromosomami homologicznymi);

• Podwyższona spontaniczna częstość wymian chromatyd siostrzanych ok.50-100 wymian/komórkę (normalnie <10wymian, średnio 1-5);

• Mozaikowatość komórkowa

• Linia ze zwiększoną częstością SCE / linia z prawidłową częstością SCE;

• Złożone heterozygoty - 2 niezależne mutacje w jednym locus.

• Hodowla z analogiem pirymidyny - BrdU, wybarwienie fluorochromem.

• Rozpoznanie na poziomie komórkowym:
  Niestabilność chromosomalna - hiper-rekombinacja

• Wysokie poziom SCE(10-15x) w limfocytach krwi

• Aberracje chromosomalne

• Zwiększona wrażliwość na UV i związki alkilujące DNA

• Zespół Wernera (WS)

• Gen WRN

• #8p 12-11.2 (1432aa.)

• Homolog helikazy RecQ (RecQ C2)

• Bierze udział w naprawie DNA związanej z replikacją

• Mutacje: nonsensowne, zmiany ramki odczytu, splicing

• Objawy:

• Przedwczesne starzenie;

• Katarakta;

• Arterioskleroza;

• Osteoporoza;

• Cukrzyca typu II;

• Hypogosnadyzm;

• Nowotwory (najczęściej mięsaki, nowotwory naczyniowo-sercowe)

• Występowanie 1/mln;

• Chorzy przeżywają do ok. 47 roku życia;

• Charakterystyka komórkowa:

• Zwiększona częstość translokacji, delecji chromosomowych

• Skrócone telomery

• Niestabilność chromosomów

• WRN jest białkiem modularnym i wielofunkcyjnym, ma aktywność egzonukleazy

• Defekty komórkowe:

• Niestabilność genomowa (rearanżacje chromosomów);

• Skrócone telomery;

• Zaburzenia transkrypcji, replikacji (wydłużona faza S, obniżona częstość inicjacji), apoptozy;

• Zaburzenia w systemach naprawy BER, NHEJ, HR;

• Obniżona naprawa w telomerach;

• Nadwrażliwość na kamptotecynę;

• WRN - białko modularne i wielofunkcyjne, na skrzyżowaniu metabolizmu DNA: interakcje z innymi białkami:

• Replikacja(RPA, BLM, Polimeraza DNA)

• Transkrypcja(p58)

• Telomery(p53, BLM)

• HR(BLM, RAD51, RAD52)

• Zespół Rothmunda-Thompsona

• Objawy kliniczne

• Zahamowanie wzrostu;

• Zmiany skórne;

• Częściowe lub całkowite łysienie w bardzo wczesnym wieku;

• Światłowrażliwość;

• Wrodzone wady szkieletowe dotyczące budowy kości długich);

• Przedwczesne starzenie;

• Zwiększone ryzyko nowotworów.

• RecQ w naprawie DSB:

Helikazy są zaangażowane w każdy etap(rozpoznanie, budowanie kompleksów, struktury Hollidaya)

Naprawa błędnie sparowanych zasad

• System naprawy DNA (MMR) - odpowiedzialny za usuwanie źle sparowanych zasad

• Naprawia błędnie sparowane zasady powstające w czasie replikacji DNA;

• Eliminacja pojedynczych zmienionych zasad w nowej nici;

• Eliminacja „insertion-deletion loops”, które powstają w wyniku utraty luz uzyskania krótkich sekwencji najczęściej w sekwencjach repetytywnych - sekwencje mikrosatelitarne;

• W odróżnieniu od BER - tylko błędy w czasie replikacji:

• Rozpoznanie;

• Zaangażowane białka usuwają uszkodzenie i otaczające nukleotydy;

• Synteza polimeraz;

• Ligacja.

• Nić rodzicielska bezbłędna jest metylowana u bakterii(N6 A w sekwencji GATC)- naprawa nici niemetylowanej;

Białko rozpoznaje miejsce metyzacji i uszkodzenie może zostać usunięte

• U ssaków inny mechanizm sprzężony z replikacją, naznaczają nić (nie do końca poznane);

• Zaburzenia MMR u ludzi - wzrost zachorowań na nowotwory - dziedziczne i spontaniczne;

• Nukleotyd wraz z otaczającymi nukleotydami jest usuwany i właściwa polimeraza uzupełnia lukę;

• W odróżnieniu od NER czy BER naprawa błędnie sparowanych zasad dotyczy TYLKO błędów powstałych w replikacji;

• Naprawa błędnie sparowanych zasad MMR u E. coli

• Białka: MutS, MutH, MutL - brak jednego z białek powoduje 100x większe prawdopodobieństwo zajścia mutacji punktowych;

• Nić rodzicielska (bezbłędna) - u bakterii metylowana N6 A w sekwencjach GATC) - naprawa nici niemetylowanej;

• Mechanizm:

• Rozpoznanie błędnie sparowanej zasady

• 3 białka: MutS, MutL, MutH

• MutS wiąże się do tego miejsca, ma aktywność ATPazy

• Wiąże się następnie MutL, a następnie MutH, które specyficznie rozpoznaje metyzację(tzw. wtórne rozpoznanie);

• Brak któregoś z tych białek prowadzi u E. coli do ok. 100-krotnego wzrostu częstości mutacji spontanicznych;

• Wycięciesynteza i ligacja (DNA helik II, białko wiążące się do ssDNA, cztery exonukleazy, np. exonukl I, DNA pol III, ligaza DNA).

MMR u Eucaryota

Białko ludzkie	Heterodimer	Funkcja
MutSα	MSH2 MSH6	Rozpoznanie błędnie sparowanych zasad oraz małych insercyjno-delecyjnych pętli; Wiąże „mismatche”.
MutSβ	MSH2 MSH3	Wiąże „mismatche”; Rozpoznanie małych i dużych inercyjno-delecyjnych pętli.
MutLα	MLH1 PMS2	Formowanie kompleksu z MutSα; Kontrola zakończenia wycinania MMR; Wczesne etapy przed wycięciem.

Udział homologów białek MMR: MSH4 i MSH5 w rekombinacji mejotycznej (hMutLgame) a może być także w mitozie, ale nie biorą udziału w MMR.

• Uszkodzenie MMR

• Fenotyp „mutator” ma zwiększone mutacje spontaniczne (ok.100x) oraz zwiększoną niestabilność mikrosatelitarną;

• Nowotwór-niepolipowaty rak jelita grubego(HNPCC);

• Nowotwory związane z niestabilnością mikrosatelitarną;

• Rak piersi może być związany z mutacjami w genach systemu naprawczego MMR takich jak: MSH2, MSH3, MSH4, MSH6, MLH1, MLH3, PMS1, MUTYH.

• Naprawa MMR u Eucaryota

• Rozpoznanie, inicjacja, naprawa;

• Helikazy DNA;

• PCNA - oddziałuje z MSH2 i MLH1, lokalizuje MutSα i MutSβ do uszkodzenia w nowo powstającej nici DNA, konieczny w nacięciu nici 3';

• EXO1 - egzonukleaza 3' i 5';

• HPNCC - Syndrom Lyncha

• 50% nowotworów jelita grubego

• Objawy:

• Podatność na nowotwory przewodu pokarmowego i macicy

• Dziedziczenie autosomalne dominujące; pacjenci są heterozygotami względem (…)

• 15% sporadycznych przypadków nowotworu raka jelita grubego obserwuje się niestabilność mikrosatelitarną, która jest spowodowana mutacjami w genach MMR lub wyciszeniem genu hMLH1

• TLS - awaryjny system syntezy DNA

• Umożliwia syntezę DNA w obecności uszkodzenia

Nie jest to typowy system naprawy

• Ratunkiem dla widełek replikacyjnych są polimerazy o obniżonej wierności(system SOS u bakterii, wiele polimeraz Eucaryota)

• Polimerazy konkurują między sobą o przechodzenie przez uszkodzenie

• Polimeraza eta mocno zaangażowana (wiele różnych uszkodzeń)

• Teoretycznie nie jest to mechanizm mutagenny

• Nie zawsze wierność jest bardzo duża

• Mechanizm TLS

• Replisom dokonuje wyboru polimeraz w zależności od uszkodzenia, nici DNA, białek regulatorowych

• Czynniki wpływające na wierność replikacji- wybór polimerazy w zależności od dostępności nukleotydów, białek, rodzaju uszkodzenia itd.)

• Mechanizm wymiany polimeraz

• Platforma PCNA odpowiedzialna

• Monoubikwitynacja PCNA - sygnał dla wymiany

• Po syntezie DNA następuje ponowna wymiana

Uszkodzenie	1 polimeraza - insercja	2 polimeraza - wydłużanie	Wierność
γ-OH-propanolol G	Pol ι	Pol κ
Glikol tyminy	Pol δ	Pol ζ
Miejsca AP	Pol δ, Pol η	Pol ζ, Pol ι Rev1
6-4-fotoprodukty
w TT, TC, CC	Pol ι	Pol ζ
TT, CC	Pol η	Pol ζ
TT	Pol η	Pol ζ

• Naprawa bezpośrednia - Direct Reversal

Naprawa DNA przez odwrócenie - bez naruszania integralności helisy DNA

• Fotoliazy(dimery pirymidynowe,(6-4)fotoprodukty))

• Transferaza O⁶-MeG(dealkilacja)

• Oksydacyjna dealkilacja ALkB(3MeC, 1MeA)

• Fotoreaktywacja

• Usuwanie uszkodzenia (adsorpcja światła niebieskiego, którego energia jest wykorzystana do rozerwania wiązań)

• Nie ma tego systemu u ssaków(wyjątek torbacze, jest u grzybów)

• Adsorpcja światła przez chromofor, przeniesienie energii(elektron rozbija wiązanie), transport elektronu z powrotem

• Fotoliazy: flawoproteiny (pteryna, dezaflawina) w chromofory absorbujące światło

• Usuwanie grup alkilowych związanych z metyzacją(pochodzenie endo i egzogenne)

• Czynniki alkilujące: MNU, MMS, SAM, O⁶MeG, 7MeG, 3MeA - najczęściej

• Demetylacja przez alkilotransferazy:

• Ada u E.coli

• AGT/MGMT u ssaków

• Ada - alkilotransferaza

• Posiada dwie aktywności umożliwiające usuwanie grup metylowych

• Podjednostka 20kDa - część N-końcowa, związana z reparacją uszkodzeń reszt fosforanowych (demetylacja metylowych uszkodzeń fosfotriestrów), aktywator transkrypcji wiążący siez promotorem operonu ada-alkaB - geny alkaA, alkaB

• Podjednostka 19kDa - naprawa O⁶MeG

• Centra aktywne - następuje związanie do grup SH w cysteinie reszty metylenowej i jest prawidłowa struktura

• Aktywator transkrypcji - po przyłączeniu reszt metylenowych połączenie z promotorem Ada

• Gen AlkA(3meA glikozylaza, enzym w systemie BER) i AlkB(1MeA/3meC, dioksygenaza) aktywacja tych białek

• Komórka eksponowana na czynniki etylujące

• Działanie enzymu Ada- jako czynnik transkrypcyjny dla kolejnych białek

• AGT/MGMT

• Usuwanie O⁶MeG

• Mechanizm bardzo podobny

• Metyzacja

• W cysteinie przyłączenie grupy metylowej

• Odłączenie i odzyskanie prawidłowej struktury

• Cecha Ada i AGT/MGMT - białka samobójcze, związanie grupy metylenowej - nieodwracalna utrata białka(inaktywacja i degradacja) po przeniesieniu grup metylowej z DNA na grupy -SH cysteiny

• Usuwanie grup alkilowych 1MeA i 3MeC (substraty dla alkB)

• alkB - aktywowane przez Ada (część 20kDa)

• alkB - naprawia te uszkodzenia

• alkB - potrzebuje Fe (II) jako faktora, atak na α-keto

Oksydacyjna naprawa zmetylowanych zasad DNA E. coli - białko AlkB

• w przypadku naprawy następuje przyłączenie OH do reszt metylenowych, przez co powstają struktury, które przywracają prawidłową strukturę

• komórki ludzkie mają 8 homologów alkB(tylko 2 zaangażowane w naprawę =- ABH2 i ABH3)

• ABH2 - specyficzny względem dsDNA, naprawa głównie 1MeA

• ABH3 - specyficzny względem ssDNA i RNA, naprawa głównie 3MeC

• Białka ABH ulegają ekspresji we wszystkich tkankach

• Nokauty myszy ABH2/3 dostępne brak wyraźnego fenotypu akumulacja 1MeA z wiekiem u myszy,

METODY WYKORZYSTYWANE DO OCENY TOKSYCZNOŚCI I MUTEGENNOŚCI CZYNNIKÓW ORAZ W BADANIACH SPRAWNOŚCI / WYDAJNOŚCI SYSTEMU NAPRAWY DNA W ŚWIETLE ZADAŃ TOKSYKOLOGII GENETYCZNEJ

• Organizmy modelowe

• Drożdże 6 000 genów

• Drosophila melanogaster >13tys genów

• Komórki ludzkie >32tys genów

• Mysz >32tys genów

• W 1 komórce ok. 3bln pz, u człowieka zorganizowane w tkanki

• Mutageneza-testowanie toksyczności

• 1960 - zainteresowanie ekspozycją na czynniki mutagenne(uszkodzenia komórek rozrodczych)

• 1970 - korelacja pomiędzy mutacją, a nowotworem

• 1980 - badania, mutacja komórek somatycznych, odkrycie, że w nich też może zachodzić nowotworzeni

• 1985 - klonowanie genów, grupy onkogenów i genów supresorowych

• Etapy prowadzące do mutagenezy:

• Penetracja

• Aktywacja

• Uszkodzenie DNA

• Utrwalenie zmiany

• Ekspresja zmutowanego fenotypu

• Klasyfikacja badań mutagenezy:

• Testy zmiany DNA

• Testy na aberracje chromosomowe

• Testy mutagenezy




• Ocena genotoksyczności

• Wysoka korelacja pomiędzy właściwościami genotoksycznymi i kancerogennymi substancji chemicznych

• Badania wykrywające aktywność mutagenną mogą także identyfikować związki, które potencjalnie prowadzą do kancerogenezy

• Porównanie toksyczności

LD₁₀, LD₃₇, LD₅₀

• Określenie toksyczności związków o podobnej strukturze dla danej linii komórkowej

• Dla jednej linii komórkowej - wrażliwość różnych mutagenów - co sugeruje uszkodzony szlak naprawy DNA

• Sugeruje uszkodzony szlak naprawy - zawsze porównanie typu dzikiego i mutanta.

---