Mechanizmy oporności bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. 16.04.2010r.
Aspekt kliniczny i diagnostyczny.

Resistant bacteria:
Exposure to bacteria occurs Infection occurus and the bacteria spread Drug treatment is used
Non-resistant bacteria:
Drug resistant bacteria The bacteria multiply The bacteria die. The person is healthy again.

Drug resistant bacteria The bacteria multiply The bacteria continue to spread. The person remaine sick.

Rodzaje oporności:
1) KLINICZNA
- wysokie prawdopodobieństwo niepowodzenia terapeutycznego nawet w przypadku zastosowania wysokich dawek leku
2) MIKROBIOLOGICZNA
- szczep posiadający nabyte drogą transferu lub mutacji mechanizmy oporności na dany lek;
- jest charakteryzowany poprzez zastosowanie odpowiedniego fenotypowego punktu odcięcia wartości MIC dla danego gatunku
3) WIELOOPORNOŚĆ (Wielolekoooporność, MDR)
- oporność szczepu na przynajmniej 3 grupy antybiotyków
np. enterokoki, Pseudomonas, pałeczki niefermentujące
4) KRZYŻOWA
- niewrażliwość na wszystkie lub niektóre antybiotyki należące do tej samej grupy chemicznej lub na antybiotyki z różnych grup chemicznych, ale o takim samym mechanizmie działania
5) CHROMOSOMALNA
- skutek mutacji (jedno- lub wielostopniowa) lub mutacja nabycia genu oporności
- do selekcji szczepów opornych prowadzi nadmierne stosowanie antybiotyków i chemioterapeutyków
6) PLAZMIDOWA
- geny warunkujące oporność mają być przenoszone między szczepami z gatunków odrębnych taksonomicznie: przenoszenie na drodze koniugacji (fimbrie płciowe), transdukcji (bakteriofagi) lub transformacji (bezpośrednie wnikanie DNA z komórki dawcy do komórki biorcy)
7) NATURALNA
- cecha stała dla gatunku, rodzaju, rodziny
- najczęściej wynik braku receptora dla antybiotyku/chemioterapeutyku np. mikoplazmy nie posiadają ściany komórkowej i tym samym białek PBP
- niskie powinowactwo receptora do antybiotyku (Enterococcus spp i Listeria monocytogenes wobec cefalosporyn)
- antybiotyki wielkocząsteczkowe (glikopeptydy i makrolidy) nie są w stanie penetrować przez błonę zewnętrzną bakterii Gram ujemnych, nie mogą dotrzeć do miejsca docelowego działania
- oporność Enterococcus gallinarum i casseliflavus na wankomycynę (VanC)
- oporność Stenotrophomonas maltophilia na karbapenemy (metalobetalaktamazy)
- oporność bakterii beztlenowych na antybiotyki amino glikozydowe..
8)NABYTA
- trudna do przewidzenia związana ze stosowaniem leków przeciwdrobnoustrojowych

Rozwój oporności na antybiotyki: (tabelka)

Penicilin G
Streptomycilin
Tetracycline
Erythromycin
Vancomycin
Methicillin
Gentamicin
Nalidixic ac
Cefotaxime
Imipenem
Linezolid

Narastanie oporności: nadużywanie antybiotyków- zakażenia o innej etiologii niż bakteryjna

Błędy w antybiotykoterapii:
- zła terapia empiryczna
- zbyt krótki okres przyjmowania antybiotyku, złe dawkowanie (stężenia sub-MIC)
- profilaktyka i „pseudoprofilaktyka” antybiotykowa
- nadużywanie antybiotyków o szerokim spektrum
mikroflora fizjologiczna
- monoterapia
drobnoustroje łatwo wykształcające oporność np. Mycobacterium tuberculosis (prątek gruźlicy)
- presja selekcyjna antybiotyków
- wytwarzanie biofilmu
- stosowanie antybiotyków w hodowli zwierząt

Ekspresja oporności na antybiotyki:
1. Wytwarzanie enyrotów (?) deaktywujących antybiotyk (beta-laktamazy) modyfikujących cząsteczkę antybiotyku (aminoglikozydy, acetylo-,nukleotydylo-,fosfotransferazy,chloramfenikol-acetylotransferaza chloramfenikolu)
2. Zaburzenia barier przepuszczalności dla antybiotyku (zamknięcie kanałów purynowych)
3. Modyfikacja receptora miejsca docelowego
4. Synteza nowego receptora dla antybiotyku (białko PBP 2a w przypadku szczepów MRSA lub MRCNS)
5. Ominięcie ogniwa szlaku metabolicznego zablokowanego przez chemioterapeutyk (sulfonamidu)
6. Aktywne usuwanie antybiotyku z komórki bakteryjnej na zasadzie pompy (active effux), (makrolity, tetracykliny, chinoliny)

Mechanizm	Β-L	AMG	CHL	MAK	LIN	SUL	TET	CHIN
Synteza enzymu	+	+	+	+/-	-	-	+/-	-
Bariery przepuszczalności	+	+	+	-	-	+	+	-
Zmiana miejsca docelowego	+	+	+	+	+	+	+	+
Synteza nośnego receptora	+	-	-	-	-	-	-	-
Ominięcie zablokowanego ogniwa	-	-	-	-	-	+	-	-
Aktywacja?	-	-

Najliczniejsze, najlepiej poznane i najszerzej opisywane mechanizmy oporności na β-laktamazy

	Synteza nowego receptora	Synteza zmienionego receptora	Β- laktamazy- penicylinazy	Inne niż penicylinazy
Gronkowce	+	-	+	-
Paciorkowce	-	+	-	-
Ziarenkowce G-	-	-	+	-
Pałeczki G-	-	-	+	+!

Meticylinooporność:
- oporność na wszystkie antybiotyki β-laktamowe (penicyliny, cefalosporyny, penicyliny i cefalosporyny z inhibitorami, monobaktamy szczepów
S. ureus (MRSA)
gronkowców koagulazo-ujemnych (MRCNS)
- w leczeniu najczęściej stosuje się glikopeptydy i linezolid

MRSA- skróty:
HA-MRSA (ang. Hospital acquired MRSA) szczepy izolowane od pacjentów szpitalnych, zwykle wielooporne, niewrażliwe na tetracykliny, amino glikozydy,makrolity, linkosamidy, a często też inne grupy
CA-MRSA (ang. Community acquired MRSA) szczepy izolowane z zakażeń pozaszpitalnych, są z definicji oporne na wszystkie beta-laktamazy oraz tertrcykliny i makrolidy
FA-MRSA (ang. Farm-associated MRSA) szczepy izolowane ze środowiska chlewni oraz przypadków kolonizacji u howów świń, pracowników chlewni, lekarzy weterynari
Pre- MRSA- szczepy posiadające gen mecA ale fenotypowo wrażliwe na B- laktamy
h- MRSA- populacja heterogenna o zróżnicowanym stopniu oporności na B- laktamy

Oznaczanie wrażliwości szczepów gronkowców na meticylinę:
1. Metoda krążkowo-dyfuzyjna z zastosowaniem krążka z cefoksytyną (wykrywa szczepy pre-MRSA) lub oksacyliną
2. Metoda przeglądowa (skriningowa) dla SAU (gronkowca złocistego) z oksacyliną
- podłoże MHA z oksacyliną w stężeniu 6 mg/l i 4% NaCl
- odczyt w świetle przechodzącym- wzrost więcej niż jednej kolonii oznacza oporność na antybiotyki beta-laktamowe
3. Aglutynacyjne metody lateksowe
- antygen- białko PBP 2a
4. Wykrywanie genu mecA z wykorzystaniem PCR
5. Podłoże chromogenie
6. E-test

Oporność na penicylinę Streptococcus pneumoniae
PRSP/SPPR (penicillin resistant Streptococcus pneumoniae), 1967r. Australia- pierwszy szczep
Szczepy oporne na antybiotyki - Rekrutacja? zazwyczaj z kilku spośród >90 serotypów
- konsekwencja obecności genów:
a) pbp 2b, pbp 2x, pbp 1a odpowiadają za syntezę receptorów w białkach wiążących penicyliny (PBP- penicillin binoling proteins)
b) zmiana białek PBP 1a, 2a, 2b, 2x - wysoka oporność na penicyliny i cefalosporyny
c) białka PBP 2b i 2x - oporność na penicyliny
d) rekrutują się zazwyczaj z kilku spośród >90 serotypów 6B, 5V, 14, 19, 23

Beta-laktamazy o największym znaczeniu klinicznym:
1. Penicylinazy
- enzymy hydrolizujące pierścień beta-laktamozy penicylin naturalnych, amino penicylin i ureidopenicylin
- kodowane:
a) na plazmidach (np. S.aaureus)- łatwość rozpowszechniania się miedzy szczepami
b) wynik neutralnej transformacji i rekombinacji genetycznej z genami PBP innych bakterii opornych np. S.mitis, struktura mozaikowa genów

Beta-laktamazy pałeczek rodziny Enterobacteriaceae
1. Chromosomalne cefalosporynazy (AmpC)
- hydrolizują cefalosporyny (wyjątek IV generacja), aztreanam
- brak podatności na działanie inhibitorów beta-laktamaz
- oporność może być wynikiem:
a) derepresji u szczepów naturalnie wytwarzających AmpC, ENT, CFR, SMA, MMO, PRO, HAV - stosowanie cefalosporyn III generacji- selekcja szczepów opornych, narastanie oporności w trakcie leczenia
- E.coli - szczepy dzikie wytwarzające AmpC na niskim poziomie, na skutek nadekspresji nabywają oporność imitującą derepresję
- wytwarzanie nabytych AmpC przez KPN, ECO, PMI i rzadko pozaszpitalne S. enterica
- induktorami są najczęściej
b) chromosomalnie- Bacteroides, Moraxella
- oporne na hydrolizę są penicyliny izoksalizowe (kloksacylina), naftycylina i skojarzenie penicyliny z inhibitorem β-laktamazy

Wykrywanie AmpC:
- układ krążków induktor-cefalosporyna (odległość między brzegami krążków powinna wynosić 8 mm), obserwujemy spłaszczenie strefy zahamowania wzrostu od strony krążka z induktorem

Beta-laktamazy o rozszerzonym zakresie substratowym (ESBL)
- kodowane przez geny plazmidowe, plazmidy zawierają często geny oporności na inne antybiotyki (amino glikozydy, sulfonamidy, trimetoprim, tetracykliny, chloramfenikol)
- powstają w wyniku kolejnych mutacji klasycznych beta-laktamaz TEM i SHV
- typ oporności dotyczący patogenów szpitalnych i pozaszpitalnych
- obecność tych enzymów warunkuje oporność na penicyliny, cefalosporyny I-IV generacji i monobaktamy
- wobec szczepów ESBL + aktywne pozostają karbapenemy, cefamycyny i penicyliny z inhibitorem beta-laktamaz, ale:
-szczepy ESBL+ mogą wykazywać wrażliwość In vitro na leki należące do substratów ESBL( niektóre cefalosporyny III/IV generacji i/lub aztreonami)
- szczepy ESBL+ mogą In vitro wskazywać oporność na preparaty zawierające inhibitory B-laktamaz

Znaczenie kliniczne ESBL:
- szczepy wytwarzające te enzymy traktować jako oporne na wszystkie penicyliny, cefalosporyny (z wyjątkiem cefamycyn) i monobaktamy!
- w przypadku ciężkich zakażeń i u chorych z czynnikami ryzyka szczepy ESBL + bywają traktowane jako z definicji oporne na skojarzenia penicylin z inhibitorami beta-laktamaz
- należy rutynowo oznaczać wytwarzanie ESBL u wszystkich pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae

Oznaczanie według CLSI:
- dla szczepów E.coli, Klebsiella spp, Proteus mirabilit
- krążki z cefpodoksymem, ceflazydymem, cefataksymem + krążki z tymi antybiotykami w skojarzeniu z kwasem klawulanowym

- w przypadku szczepów ESBL+ średnia strefy zahamowania wzrostu wokół krążka zawierającego cefalosporynę z kwasem klawulanowym jest większa o co najmniej 5mm od strefy przy krążku z samą cefalosporyną
- metoda 2 krążków (PDST)
- wszystkie gatunki Enterobacteriaceae
- krążki z ceftazidimem, cefotaksymem (wariant podstawowy), cefpodoksymem, aztreonamem (zwiększenie czułości testu) ułożone w odległości 2 cm (pomiędzy krążkami) od krążka z amoksycyliną i kwasem klawulanowym
- w celu wykrycia ESBL u szczepów wytwarzających AmpC należy dodać krążek z cefepimem (slaby substrat dla AmpC) lub bakterie na podłożu MHA z kloksacyliną(inhibitor AmpC)
- za wynik dodatni przyjmuje się rozszerzenie lub powstanie strefy zahamowania wzrostu od strony krążka z inhibitorem B- laktamaz

E-testy
- zawierają na jednym pasku ceftazydym i ceftazydym/kwas klawulanowy, cefotaksym i cefotaksym/kwas klawulanowy lub cefepim i cefepim/ kwas klawulanowy

Oporność na karbapenemy:
- oporność związana z wytwarzaniem ESBL, AmpC lub zmniejszeniem przepuszczalności osłon komórkowych- PMI, KPN, ECL
- karbapenemazy (kodowanie na genach plazmidowych)

MBL - metalobeta-laktamazy
klasy A, tzw. KPC (Klebsiella pneumoniae)

Karbapenemazy KPC:
-enzymy (β-laktamazy) hydrolizujące wszystkie karbapenemy (imipenem, mero penem, ertapenem, doripenem) - pierwsza izolacja szczepu KPC+ w 1996r.
- slabo hamowane przez inhibitory β-laktamaz
- szczepy K. pneumoniae KPC+ są zazwyczaj wrażliwe jedynie na kolistynę, tygecyklinę, gentramicynę i niekiedy na anikacynę

Wykrywanie karbapenemaz u pałeczek rodziny Enterobacteriaceae:
- każdy izolowany w szpitalu sczep pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae powinien być poddawany wstępnemu badaniu na możliwość wytwarzania karbapenemazy typu MBL lub KPC
- znaczące obniżenie wrażliwości In vitro na którykolwiek z karbapenemów (najczulszy dla KPC - ertapenem)
- interpretacja wyników testów różna w zależności od rekomendacji

Wykrywanie karbapenemaz u pałeczek rodziny Enterobacteriaceae- testy potwierdzające:
- oznaczanie MBL jak dla pałeczek niefermentujących
- testy fenotypowe na obecność KPC wykorzystują inhibicję tych enzymów przez kwas borowy (I)
- substancje wskaźnikowe (W): imigenem lub mero penem (300,400 lub 600 µg)
W W+I W
- wynik pozytywny: różnica stref zahamowania wzrostu wokół krążka z którymkolwiek karbapenemem i inhibitorem oraz krążka z samym karbapenemem wyniesie co najmniej 5mm(300 mikrogramów)
- zmodyfikowany test Hodge'a (liścia kończyny)
jako jedyny rekomendowany przez CLSI do wykrywania karbapenemaz u Enterobacteriaceae
nie różnicuje KPC od MBL
wrażliwy na karbapenemy szczep wzorcowy E.coli

Metalo-beta laktamazy:
- sposób działania: hydroliza wiązania amidowego w pierścieniu beta-laktamowym antybiotyków z grupy karbapenemów
- centrum aktywne zawiera jony metali dwuwartościowych najczęściej Zn 2+ (w innych β-laktamazach seryna) podatność na działanie inhibicyjne związków chelatujących metale np. EDTA
- brak podatności na działanie znanych inhibitorów β-laktamaz
- wytwarzanie przez pałeczki Stenotrophomonas Matrophilia (oporność naturalna), Pseudomonas spp, Acinobacter spp, nieliczne szczepy pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae

Metody wykrywania:
1.Spektrofotometryczna:
- ocena hydrolizy imipenemu przez sonikaty badanych drobnoustrojów
- oznaczenia prowadzi się równolegle bez i w obecności EDTA
2. Test 2 krążków CAZ i MPA
- porównanie średnic stref zahamowania wzrostu
- krążek z ceftazidimem i jałowy krążek bibuły nasycony 2-3µl kwasu merkaptonowego
3. E-test MBL
- pasek zawiera gradient stężenia imipenemu w zakresie 4-256 µg oraz 1-64 w obecności 320 µg EDTA
- ośmiokrotny spadek wartości MIC imipenemu w obecności EDTA lub strefa fantomowa

Mechanizmy oporności nabytej Ebterokoków:
- HLAR (HCAR?)- wysoki stopień oporności na antybiotyki amino glikozydowe (oporność nabyta przez transfer genów plazmidowych i transpozonowych)
- wytwarzanie enzymów modyfikujących cząsteczki antybiotyków amino glikozydowych acetylo-, nukleotydylo-, fosfotransferaz

Wykrywanie-metoda przeglądowa:
- z podlożem agar BHI z gentamicyną 500 µg/l i streptomycyną 2000 µg/l
-odczyt po 24h i dla szczepów wrażliwych( dla szczepów wrażliwych na streptomycynę po 48) inkubacji w temp. 35 C w atmosferze tlenowej
- wzrost co najmniej jednej kolonii oznacza oporność

VRE- oporność na wankomycynę
- szczepy VRE są zazwyczaj oporne na wszystkie antybiotyki dostępne w leczeniu tych zakażeń
- oporność wiąże się z nabyciem genu vanA-vanE, które SA odpowiedzialne za zmianę składu aminokwasowego łańcuchów peptydoglikanu: dochodzi do zamiany końcowej D-alaniny-D-alaniny na D-alaninę-D-mleczan, co wiąże się z utratą powinowactwa glikopeptydów do łańcuchów białkowych peptydoglikanu
-wzrost co najmniej jednej kolonii może oznaczać oporność , konieczne oznaczenie MIC, testu na ruchliwość wytwarzanie pigmentu

Oznaczanie:
- metodą przeglądową na podłożach BHIA z wankomycyną w stężeniu 6 mg/l
- E-test z wankomycyną i teikoplaniną
- podłoże chromogenne

8

METYCYLINOOOPORNOŚĆ

synteza nowej transpeptydazy- białka PBP 2a (2') uwarunkowana obecnością kompleksu genów Mec (mecA)

często oporność na inne grupy
leków

oporność na wszystkie antybiotyki
β-laktamowe

Osoby hospitalizowane i ludzie zdrowi (nosicielstwo)

KPC
najniebezpieczniejszy opisany dotychczas mechanizm oporności na antybiotyki

brak leków o udowodnionej skuteczności klinicznej

szczepy KPC+ mają podwyższony potencjał epidemiczny

zakażenia KPC+ wysoka śmiertelność (do 50%)

brak leków w II i III fazie badań klinicznych

posiadanie dodatkowych mechanizmów oporności

wytwarzanie innych beta-laktamaz

geny plazmidowe

obecność w mikroflorze

trudność identyfikacji szczepów KPC+ w laboratorium mikrobiologicznym

szczepy otoczkowe- niemowlęta, osoby starsze

---