1.Właściwości enzymów i mechanizm ich działania:

Enzym - chiralny rozpuszczalnik określonego substratu zapewniający środowisko reakcji odpowiednie dla optymalnego efektu katalicznego.-Są to białka o masie z zakresu 9 - 155 kDa jeśli są zbudowane z pojedynczego łańcuca polipeptydowego i do 6x10^6 Da w przypadku enzymów oligomerycznych.-Charakteryzują się strukturalną czułością czyli specyficznością tj. decydują o kierunku przemiany substratów o określonej strukturze. Ich specyficzność jest większa niż innych katalizatorów.-Przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi reakcji o co najmniej 10^6 raza dzięki znacznemu obniżeniu swobodnej energii aktywacji. Jest to efektem niekatalizowanej reakcji.Enzym nie zmienia stałej szybkości reakcji, przyspiesza tylko jej osiągnięcie, obniżenie energii aktywacji zachodzi na skutek zmiany mechanizmów reakcji.

Podany przykład odnosi się do reakcji egzoergicznych. Mogą zachodzić też reakcjie endoergiczne przy udziale enzymów (np. przy ATP, ligazy). Enzymy obniżają energię aktywacji:

2H₂O₂2H₂O + O₂ ; v = k[s]
,,bez katalizatora Ga=75kJ/mol 1,3x10^-11% czast. Reakt.

Katalizator-Pt Ga=50 kJ/mol 3x10^-7% cząst. Reakt.,,2,5x10^4 x przysp. Reak.,,Katalizator katalaza Ga=8,4kJ/mol 4% cząst. Reakt.,,3x10^11 x przysp. Reakcja.

Gdy przyspieszenie reakcji przez enzym jest >10^10-krotne tzn. że enzym doskonale wyewoluował. Jest tak dobrze dopasowany do substratu, że praktycznie już nic nie można zrobić, aby zwiększyć aktywność enzymu.

Wartość współczynnika stałej katalitycznej określa liczbę obrotów danego enzymu. Wynosi od 10 do 10^7 (np. papaina 10, katalaza 10^7, trypsyna 10^3):k(s^-1).Enzymy o małych wartościach „k” katalizują przemiany związków makrocząsteczkowych np. określonych wiązań. ETAPY REAKCJI ENZYMATYCZNEJ:E + S ES ES⁰ EP E + P;1.Rozpoznanie i związanie substratu dzięki oddziaływaniu reszt aminokwasów wiążących zlokalizowanych w kieszeni katalitycznej. Etap fizyczny.2.Etap chemiczny.Konformacyjny stres enzymu indukowany przez zmiany w aktywnym centrum, prowadzący do utworzenia produktu. Enzym wiążący substrat kurczy się - centrum aktywne zamyka się po związaniu substratu. Bardzo wyraźne zmiany konformacyjne.3.Etap fizyczny.Uwolnienie produktu z kompleksu enzym substrat.

2.Ogólny model centrum aktywnego enzymów; rola reszt aminokwasowych.

Centrum aktywne - obszar enzymu o zdefiniowanej objętości i zdefiniowanej strukturze, w którym przyłączany jest substrat i przebiega reakcja przemiany w produkt. W przypadku enzymów globularnych centrum aktywne ma charakter hydrofobowy - aminokwasy polarne znajdują się na zewnątrz, wewnątrz umiejscawiają się aminokwasy z resztami nie polarnymi.

Miejsce wiążące - miejsce w centrum aktywnym, gdzie substrat wiąże się z enzymem. Znajduje się w ok. 20 A od określonych grup atomów lub samych atomów substratu. Oddziaływania pomiędzy substratem a aminokwasami z miejsca wiążącego są szczególnie silne.Aminokwasy kontaktowe wiążące - aminokwasy znajdujące się w obszarze miejsca wiążącego, oddziaływują z atomami lub grupami atomów substratu - niekiedy substrat wiąże się z enzymem kowalencyjnie. Miejsce katalityczne - miejsce w centrum aktywnym gdzie enzym oddziaływuje silnie z substratem. Umiejscowione są w nim aminokwasy kontaktowe katalityczne.Aminokwasy kontaktowe katalityczne (pomocnicze) - niezbędne są do katalizy reakcji choć dla większości nie są poznane funkcje. Można wymienić jedną resztę aminokwasu na inną ale często to upośledza funkcję enzymu. Aminokwasy te wspomagają katalizę choć dokładnie nie wiadomo dlaczego.Aminokwasy stabilizujące - występują poza centrum katalitycznym. Stabilizują one aktywną konformację enzymu. Często w stabilizacji konformacji enzymów biorą udział jony metali.Białka złożone (Haloenzymy) - w centrum katalitycznym znajdują się różne koenzymy, które biorą bezpośrednio udział w reakcji jako ko substraty. RESZTY AMINOKWASÓW WCHODZĄCE NAJCZĘŚCIEJ W SKŁAD CENTRUM AKTYWNEGO.W skład centrum aktywnego wchodzą zazwyczaj aminokwasy polarne ale nie zawsze zjonizowane.His (Histydyna);pK =6-7 pH obojętne jak w komórkach. Może ulegać protonacji i deprotonacji:Dzięki temu, że histydyna może być protonodawcą i protonobiorcą jest składnikiem tzw. Łańcuchów przenoszenia ładunków w komórkach.Ser (Seryna):-w enzymach serynowych - proteinazy lipazy, inne esterazy,-uczestniczy w katalizie z utworzeniem kowalencyjnego intermediatu np. proteinazy serynowe rozcinają wiązania peptydowe i podczas jednego cyklu substrat ulega związaniu wiązaniem kowalencyjnym,-rolę nukleofilu pełni grupa -OH

Asp (Asparaginian),Glu (glutaminian):-np. 2 reszty kwasu asparaginowego wchodzą w skład proteinaz aspartylowych;-Asp, Glu - biorą udział w hydrolizie wielu wiązań glikozydowych.;-W innych hydrolazach często występują reszty Asp, Glu;-Funkcję katalityczną pełni grupa karboksylowa.Cys (Cysteina):-rolę nukleofilu pełni grupa -SH;-Cys działa w parze z His;-Cys występuje w wielu dehydrogenazach sprzeżonych z NAD lub NADP.Arg (arginina):-grupą aktywną jest grupa guanidynowa;-pK = 12,5;-łatwo wiąże grupy ujemne np. reszty ortofosoranowe.Lys (lizyna):-Zawiera dodatkową grupę aminową;-Jest zdolna do tworzenia zasad Shiffa. ;-Może reagować z ketonami np. trans aldolaza.Tyr (tyrozyna):-zawierają aktywną grupę -OH,-są hydroksykwasami ;-w środowisku hydrofobowym działają silniej niż w środowisku hydrofilowym.

5.Kinetyka reakcji enzymatycznych:a) założenia Michaelisa - Menten (M-M): -tworzenie się kompleksu enzym-substrat - E∗S:-reakcja jednosubstratowa - E + S ↔ E∗S ↔ E∗P ↔ E + P analiza przebiegu reakcji w początkowym (v_o), bardzo krótkim przedziale czasu; tylko wówczas znamy stężenie substratu ([S_o]) i można pominąć wpływ bardzo niskiego stężenia produktu a powyższa reakcja upraszcza się do - k₁ k₂ E + S ↔ E∗S → E + P k_-1;-stężenie molowe substratu wielokrotnie wyższe niż stężenie molowe enzymu, utrzymuje się tzw. stan stacjonarny - stałe stężenie kompleksu E∗S przy zmieniających się stężeniach substratu (maleje) i produktu (wzrasta)b)analiza stanu stacjonarnego - stanu zrównoważonych szybkości tworzenia i rozpadu E∗S - prowadzi do zależności początkowej szybkości reakcji enzymatycznej (v_o) od początkowego stężenia substratu ([S_o]): V_max • [S_o];K_m = k_-1 + k₂ / k₊₁ - stała M-M, V_max - szybkość maksymalna ;K_m + [S_o] wykresem tej zależności v_o od [S_o] jest krzywa hiperboliczna ;c) znaczenie poszczególnych parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej: -K_m - określa powinowactwo substratu do enzymu; stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji równa się 0.5•V_max; jednostki stężenia [=] M; najczęstsze wartości w zakresie stężeń μM-mM;-k₂ ≡ k_kat - stała szybkości reakcji powstawania produktu, tzw. liczba obrotów - ilość moli produktu tworzonych w jednostce czasu (s) przez jeden mol enzymu; jednostki odwrotności czasu [=] s^-1, wartości wahają się w granicach od rzędu 10⁶ do mniejszych niż 1 ;-V_max - maksymalna prędkość katalizowanej reakcji przy danym stężeniu enzymu - aktywność enzymu; jednostki stężenia/czas, najczęściej stosowane μM/s lub mM/s;-k_kat /K_m - najlepiej określa skuteczność enzymu, jego sprawność przy stężeniach substratu znacznie poniżej wartości K_m (odpowiada to często warunkom fizjologicznym); dla najskuteczniejszych enzymów k_kat /K_m ≈ k₁ co oznacza, że wydajność katalizowanych przez nie reakcji jest ograniczona jedynie dyfuzją cząsteczek w roztworze i nie może przekroczyć wartości 10⁸-10⁹ M^-1s^-1 ;-wyznaczanie wartości K_m i V_max - stosowanie odwróconej postaci zależności M-M; wyrażenie Lineweavera-Burka - 1/v_o = 1/V_max + K_m/V_max • 1/[S_o] - wykres zależności 1/v_o od 1/[S_o] to linia prosta z charakterystycznymi punktami przecięcia osi 1/[S_o] = -1/ K_m a osi 1/v_o = 1/V_max

7.Enzymy jako bialka globulrne-hierarchiczna struktura bialka globularnego.(wiekszosc enz. Jest bialkami globularnymi) 1.struktura I rzed.- sekwencja AK determnawana genetycznie.2.struktura II rzed-konformacja krotkich fragmentow lancucha(tylko w bialkach fibrylarnych uporzadkowana struktura Iirzed obejmuje >90% lancucha)alfa-helisa i beta faldowa,njczesciej nieco deformowane,stabilizowane przez wiazania wodorowe(w alfa-helisie co 4 reszta AK,w beta-faldowej miedzy rownoleglymi)3.struktura IIIrzed.-ostateczne zwiniecie lancucha w przestrzeni.-strukture naddrugorzedowe-okreslaja charakterystyczna strukture przyleglych do siebei krotkich fragmentow o zdefiniowanej strukturze IIIrzed,moga byc struktury mieszane,-domeny bialkowe-wiekszy fragment czasteczki bialka wyraznei wyodrebniamy samodzielna strukture.-bialko globularne jako calosc czasteczki.4.agregat bialkowy-odpowiednik struktury Ivrzed en.digomeryczne..Wiekszosc en.-delikatne bialka globularne,ktore latwo ulegaja denaturacji.Mozliwa nieskonczona liczba konformacji,ale najczesciej wykorzystuja jedna aktywna konformacje-sfaldowanie korzystnie termodynamicznie zapewniajace czasteczce najwieksza stabilnosc.Reszta aminokwasowa-czasteczka AK,gdzie grupa alfa-aminowa i karboksylowa jest zaangazowana w wiazanie peptydowe,dotyczy AK zlokalizowanych we wnetrzu lancucha,zakonczone z jednej strony AK N-terminalnym,z drugiej C-terminalnym(-NH,-CH,-CO)

Grupa peptydylowa- gr.karboksylowa jednego AK i gr iminowa drugiego(-CH,-CO,-NH).Jednostka sztywna w wiazaniu peptydowym jest polaczenie C=O-NH,najczesciej lezy w 1 plaszczyznie.STRUKTURY IIRZ.Alfa-helisa-rdzen lancucha polipeptydwego oplata hipotetyczny walec 3,6reszt AK/1obrot helisy,trzyma sie dzieki mostkam wodorowym co 4 reszty,miedzy grupa iminowa i korbonylowa.Wiazanie wodorowe neco odchylone od pozycji rownoleglej wzgledem osi drugiej helisy.W bialkach enzymatycznych odcinku helikalne nie sa zbyt dlugie.beta-faldowa-dwa fragmenty lancucha polipeptydowego sa polaczone siecia wiazan wodorowych miedzy grupa iminowa a karboksylowa,ma charakterantyrownolegly:N->c,C<-N.Wiazania prostopadle do osi dlugiej.Stosunkowo krotkie odcinki w bialkach enzymatycznych.2rodzaje:antyrownolegle i rownolegle,znacznei dluzsze petle,wiazania wodorowe lacza te struktowy poprzecznei.STRUKTURA IIIRZ.Dehydrogenaza oldehydu 3-P-glicerynowego sprzezona z NAD(2 domeny:dolna z miejscami wiazania koenzymu([struktury beta i alfa],gorna katalityczna-prewaga beta)Struktora domeny wiazacej koenzym w roznych enzymach jest zblizona-podony uklad odcinkow alfa i beta-swiadczy o wspolnym eolucyjnym pochodzeniu.ODDZIALYWANIA UTRZYMUJACE STRUKTURE WYZSZEGO RZEDU-wodorowe(inne niz te stabilizujace strukt Iirze)1.miedzy grupami-OH Ser,Tyr,Thr.2.miedzy -OH Tyr a -COOH Asp i Glu.3.miedzy zjonizowanymi grupami NH₃ i -COO4.miedzy grupa karboksylowa wiazania peptydowego a grupa -OH.—hydrofobowe(gl. Phe-Leu,Phe-Phe)w bialkach globularnych rozpuszczalnych w wodzie reszty AK hydrofobowych sa we wnetrzu czasteczki.—jonowe-miedzy naladowanymi przeciwnie gr.—mostki disiarczkowe.—oddzialywania Van der Walsa

AGREGATY BIALKOWE-STRUKTURA OLIGOMERYCZNA(IVRZ)wszystkie podjednosti wykazuja te sama f-cje katalityczna np.dehydrogenaza mleczanowa-4 jednostki.czasem aktywnosc podjednostek w oligomerze jest inna niz aktywnoasc rozdzielonych,najczesczescij jednostki po rozdzieleniu nei wykazuja zadnej aktywnosci,ale czasem moja inna np.dehydrogenaza glutaminowa(katalizuje oksydatywna deaminacje Glu)-tetramer rozdzielone podjednostki katalizuja oksydacyjna deaminacje Ala.Moga wystepowac podjednostki regulatorowe-reguluja f-je i aktyw. Podjednostek katalitycznych na zasadzie allosteru:jezeli do podjednostki regulatorowej przylaczy sieaktywator(inhibitor) allosferyczny,wzrasta(spada) aktyw. Jednostki katalitycznej.Najczesciej przy parzystej liczbie podjednostek np.ureaza Jaś-6podj.Jezeli jenostki maja te sama f-je=>sblizona masa,jezeli wystepuja jednostki regulatorowe=>inna asa niz katalit

. 8. Enzymatyczne reakcje karboksylacji:Mechanizm działania:-biotyna występuje w białku BCCP, które jest obecne we wszystkich karboksylazach,-podjednostki karboksylujące biotynę katalizują reakcję,-reakcje karboksylacji to reakcje endoergiczne - energia dostarczana jest przez rozkład ATP,-do centrum aktywnego karboksylazy biotyny przyłącza się jon HCO₃^- i ATP oraz kieruje się tam główka biocetyny. Biocetyna przyłączonym CO₂ kieruje się do centrum aktywnego drugiej podjednostki, gdzie przyłączany jest właściwy substrat.Reakcja zapoczątkowująca syntezę kwasów tłuszczowych:-kompleks karboksylazy277 na podjednostki:dimer BCCP,dimer karboksylazy biotyny;-kompleks ten jest regulowany na drodze allosterycznej;-biosynteza kwasów tłuszczowych jest regulowana na poziomie karboksylazy

9.Synteza kwasów tłuszczowych jako przykład kompleksu wieloenzymowego.

Kompleks karboksylazy acetylo-CoA i syntetazy kw.tluszczowych sa niezbedne,aby ta synteza zaszla.Syntetaza kw.tluszczowych-kompleks inny u Eukaryota i Prokaryota.PROKARYOTA:-6 podjednostek katalitycznych,-paleczkowate bialko ACP.1.transacetylaza acylowa-przylacza reszty acetylowe i acelowe,2.transacelaza malonylowa-przylaczareszty malonylowe(karboksylowane reszty acetylowe),3.syntetaza 3-ketoacylowa(enzym kondensujacy)-kondensacja reszty acelowej z malonylowa,a potem rzeszty acylowej z malonylowa,4.reduktaza 3-hydroksyacyloACP,reduktorem jest NADPH-redukuje reszte ketoacelowa do hydroksylowej,5.dehydrotaza 3-hydroksyaceyloACP-przeksztalcareszte hydroksyacylowa do enoilowej,6.reduktaza enoiloACP,7.bialko ACP z fosfopantoteina.Dzieki centralnej grupie -SH(dlugie ramie molekularne)poszczegolne substratysa pszenoszone przez pantoteine i moga byc wprowadzane do centrow aktywnych kolejnych podjednostek,przeniesione reszty lacza sie wiazaniami tioestrowymi.EUKORIOTA:-2 podjednostki,kazda o charakterze wielodomenowym w ednej podjednosce wystepuja wszystkei domeny o odpowiednich aktywnosciach.2 subdomeny polaczone linkarem:w 1-szej:domena kondensujaca,przenoszaca reszty acylowe,przenoszaca reszty malonylowe,hydotaza;w 2-girj:reduktazy,domena odpowiadajaca bialku ACP,tioesteraza(domena odszczepiajaca kw.tluszczowy).Synteza wyzszych kw.tluszczowych odbywa sie w cytoplazmie i w sensie chemicznym stanowi odwrocenie beta-oksydacji(utlenianie,FAD,NAD)-w syntezie:redukcja,NADPH₂.(kiedys uwazano ze beta-oksydacje i synteza katalizuja te same enzymy.SUBSTRATY DO BIOSYNTEZY KW.TLUSZCZOWYCH:-rezsty acelowe dostarczane przez CoA pochodza z beta-osydacji kw.tluszczowych lub oksydacyjnej dekarboksylacji pirogranianu-oba te procesy zachodza w mitochondrium=>konieczny transport do cytoplazmy.,sa za malo aktywne na potrzeby reakcji biosyntezy.-reszty malonylowe powstale przez karboksylacje reszt acetylowych,dopiero taka reszta jest wystarczajaco aktywna.

10.Szlak syntezy kwasów tłuszczowych:

1.CoA dostarcza reszte acetylowa,ktora laczy sie z tiolem centrum bialka ACP,dolacza sie CoA 2.bialko ACP przezuca reszte do tiolu peryferyjnego 3.do tiolu centralnego przylacza sie reszta malonylowa,odlacza sie CoA 4.rzeszta malonylowa przenoszona na acetylowa,odlacza sie CO₂, kondensacja 2 reszt,powstaje trojweglowa reszta ketoacelowa 5.reduktaza redukuje grupe korbonylowa do hydoksylowej 6.dehydrotacja,powstaje reszta enoilowa 7.redukcja reszty enoilowej(NADPH) 8.4-weglowa reszta acylowa przezucana na acylotransferaze,ktora przenosi ja na tiol pereferyjny enzymukondensujacego=>wolny jest tiol centralny,przelacza sie tam kolejna reszta malonylowa.proces zachodzi az do uzyskania kw.palmitynowego-dalsze wydluzanie w innym kompleksie(desaturazy-wprowadzaja wiazania podwojne odszczepiajac wodor.

11.Klasyfikacja enzymów:a/ oksydoreduktazy - A_oks + B_red ⇔ A_red + B_oks - reakcje utleniania-redukcji *dehydrogenazy - AH₂ + NAD⁺ (FAD) ⇔ A + NADH + H⁺ (FADH₂) koenzymy: NAD⁺, rzadziej NADP⁺ - pochodne niacyny, witaminy PP (B₃),FAD, rzadziej FMN - pochodne ryboflawiny, witaminy B₂ (przykłady - dehydrogenaza mleczanowa i bursztynianowa oraz mechanizmy przenoszenia elektronów z udziałem tych koenzymów) DPT (difosfotiamina) - pochodna tiaminy, witaminy B₁ , która wraz z liponianem są niezbędnym elementem funkcjonalnym dehydrogenaz ketokwasów (pirogronian, -ketoglutaran i inne pochodne aminokwasów) *oksydazy - AH₂ + O₂ ⇔ A + H₂O₂ ; koenzymy: FAD, FMN (przykłady - oksydaza glukozy, oksydazy L- i D-aminokwasów)*oksygenazy:- dioksygenazy - AH₂ + O₂ ⇔ A(OH) ₂ (niezbyt często występujące);- monooksygenazy - AH + O₂ + NADP⁺ ⇔ A(OH) + H₂O + NAPDH,(hydroksylazy); koenzymem obok NADPH + H⁺ jest hem (cytochrom P450, wiele reakcji przemian steroidów; procesy detoksykacji) a także witamina C (np. reakcja hydroksylacji proliny w trakcie syntezy kolagenu - hydroksylaza proliny)*peroksydazy - AH₂ + H₂O₂ ⇔ A + 2H₂O ; koenzym - hem (przykład - peroksydaza glutationowa: 2GSH + H₂O₂ ⇔ GSSG + 2H₂O; enzym z selenocysteiną, uczestniczy w procesach usuwania reaktywnych form tlenu) *katalaza - H₂O₂ + H₂O₂ ⇔ O₂ + 2H₂O; koenzym - hem (ważny enzym uczestniczący w procesach usuwania reaktywnych form tlenu);b/ transferazy - A-B + C ⇔ A + B-C - reakcje przenoszenia fragmentów substratów przykładem transferaz są kinazy, enzymy przenoszące resztę fosforanową (-P), której najczęstszym donorem (kosubstratem) jest ATP- adenozynotrifosoforan: gluko- lub heksokinaza katalizują reakcję: glukoza + ATP ⇔ glukozo-6-P + ADP; koenzymy: DPT (difosfotiamina) - pochodna tiaminy, witaminy B₁ (transketolazy); PLP( fosforan pirydoksalu) - pochodna pirydoksaminy, witaminy B₆ (aminotransferazy); KoA (koenzym A) - pochodna kwasu pantoteinowego, witaminy B₅ (przenoszenie reszt acetylowych - −CO(CH₃) i acylowych - −CO(R)); THF (tetrahydrofolian) - pochodna kwasu foliowego (przenoszenie licznych tzw. fragmentów jednowęglowych); metylokobalamina - pochodna cyjankobalaminy, witaminy B₁₂ (metylotransferaza homocysteinowa);c/ hydrolazy - A-B + H₂O ⇔ A-H + B-OH - reakcje hydrolitycznego rozczepienia substratów: np. proteinazy i peptydazy - hydroliza wiązania peptydowego białek i peptydów (chymotrypsyna, trypsyna, kolagenazy i inne); glikozydazy - hydroliza wiązania glikozydowego oligo- i polisacharydów (przykładem jest lizozym); esterazy jak choćby fosfatazy - glukozo-6-P + H₂O ⇔ glukoza + P_i (fosfataza glukozo-6-P),nukleazy - hydroliza wiązań fosfodiestrowych w DNA i RNA czy lipazy - hydroliza wiązań estrowych estrów kwasów karboksylowych ;d/ liazy - A-B ⇔ A + B - reakcje rozczepienia lub tworzenia wiązań na innej drodze niż hydroliza czy reakcje redoks przykładem liaz są: dehydrataza węglanowa (Zn⁺²) - H₂O + CO₂ ⇔ HCO₃⁻ + H⁺ ,czy dekarboksylaza pirogronianowa, której koenzymem jest DPT (difosfotiamina) a także liczne dekarboksylazy współpracujące z PLP (fosforanem pirydoksalu) jako koenzymem ;e/ izomerazy - A ⇔ izo-A - reakcje przekształcenia substratu w jego izomer przykładem może być izomeraza fosfotrioz katalizująca reakcje:aldehyd-3-fosfoglicerynowy ⇔ fosfodihydroksyaceton a także mutaza metylomalonylo-KoA współpracująca z deoksyadenozylokobalaminą jako koenzymem (pochodna witaminy B₁₂);f/ ligazy - A + B + ATP ⇔ A-B + ADP + P_i - reakcje łączenia substratów (tworzenia wiązań) w sprzężeniu z hydrolizy związku ”wysokoenergetycznego) przykładem ligaz (zwanych czasami syntetazami) są karboksylazy współpracujące często z biotyną jako koenzymem, jak choćby karboksylaza pirogronianowa: pirogronian + CO₂ + ATP ⇔ szczawiooctan + ADP + P_i

12.Metody i warunki oznaczania aktywności enzymów. Jednostki aktywności, aktywność ogólna, aktywność właściwa

1.Spektrofotometryczne.Przykłady:-hydrataza fumaranowa

W przypadku przyrostu stężenia produktu obniża się absorbancja przy E300

-dehydrogenazy sprzężone z NAD+ lub NADP+

Metoda Karmen - stosowana powszechnie do oznaczania enzymu aminotransferazy asparaginowej.

2.Fluorometryczne (podobna zasada jak poprzednia).3.Manonetryczne (rzadko stosowane; enzymy oddechowe)4.Potencjometryczne (miareczkowanie potencjometryczne)5.Z odbiorem prób (np. kolorymetryczne)6.Wiskozymetrycznie (wygodna metoda przy enzymach rozkładających lepkie polisacharydy; wynik informuje o rodzaju enzymu: endo - szybki spadek lepkości, wolny wzrost redukcyjności; egzo- wolny spadek lepkości, szybki wzrost redukcyjności)

....-podczas badań należy wykonać pewne oznaczenia,-należy najpierw zadbać aby reakcja przebiegła wg. Kinetyki „0” rzędu reakcji.,-Należy wyznaczyć prędkość początkową ,-Zbadać jak stężenie substratu i enzymu wpływa na aktywność enzymu .,-Tak dobrać czas reakcji aby szybkość była stała.,-Należy wybarwić białko np. błękit fumaryny.Jednostka aktywności - Jeden U to ilość enzymu katalizująca przemianę 1μmola substratu w czasie 1 minuty. Zwykle przyjmuje się określone warunki: temperaturę 30°C, dane pH i maksymalne wysycenie enzymu substratem.

13.Metody dezintegracji komórek i ściany komórkowej:1.Mechaniczne:-czasem wystarczy rozetrzeć komórki z materiałem ściernym,-mielenie materiału,-homogenizacja przy udziale homogenizera,-często do buforu , w którym wykonuje się dezintegracje dodaje się tzw. Balotin2.Metoda wielokrotnego zamrażania i rozmrażania komórek:-materiał biologiczny umieszcza się w buforze o pH odpowiadającemu pJ i szybko i bardzo silnie się mrozi - zanurzenie w mieszaninie CO₂ i acetonu lub ciekłym azocie,-szybkie gwałtowne zamrażanie powoduje wytworzenie dużych kryształów wody, które rozsadzają komórki.,-Następnie należy bardzo powoli rozmrozić układ - im dłuższe rozmrażanie tym większe zniszczenie komórek ,-Ponowne zamrożenie komórek,-Operacje te wykonuje się nawet 10-krotnie3.Wykorzystanie związków rozkładających substancje zawarte w ścianie komórkowej:-dla bakterii gram + wykorzystywany jest lizozym który rozkłada cukrowe składniki ściany komórkowej,-dla drożdży wykorzystuje się β-1,3-glukanazy rozkładające glukozę zawartą w ścianie komórkowej..Podczas dezintegracji ściany komórkowej sprawdza się mikroskopowy stopień jej degradacji

14. Rodzaje chromatografii kolumnowej, stosowane w preparatyce białek enzymatycznych.

1.sączenie molekularne na sitach molekularnych ( Sephadex, Bio-Gel, Sepharase)2.chromatografia jonowymierna na sitach naturalnych i syntetycznych 3.chromatografia adsorpcyjna4.chromatografia powinowactwa biologicznego (swoista sorpcja)4.chromatografia hydrofobowa5.chromatografia kowalencyjna6.chromatografia na matrycach...Ad. 1.:Sephadex:-sito molekularne sieć krystaliczna z polisacharydu o danej wielkości otworów-liczby oznaczają wielkość oczek w sieci i zdolność chłonięcia wody,-składa się z naturalnego α-glukanu ,-podczas pracy do roztworu dodaje się środki bakteriobójcze, aby kolumna w której prowadzi się oczyszczanie nie porastala drobnoustrojami.Bio-Gel:-składa się z odpowiednio usieciowanego żelu poliakrylamidowego,-bardzo trudno degradowany,-numeracja P - 4 …. 200 (mniejsza zdolność pęcznienia).Sepharose:-pochodna agarozy, wytwarzanej przez glony morskie, odpowiednio usieciowany.-oczyszczone białko przepuszczone jest przez żel.-Zbierają się wówczas frakcje o określonych objętościach i wielkościach ziaren molekularnych,-W każdej frakcji bada się absorbancję przy 280nm,-Dodatkowo w każdej frakcji bada się aktywność,-Na wstępie wprowadza się blue-dekstryn, aby zbadać objętość zerową kolumny.-Objętość zerowa informuje o ilości roztw. Białka, które można nanieść na żel - ok. 10% obj. Zerowej.Ad. 2.:-metoda najbardziej efektywna ,-polega na dołączaniu substancji, z którą wiąże się enzym,-dzięki tej metodzie można wyizolować białka w 1 etapie.Ad. 3.:-dodaje się złoże z którym kowalencyjnie wiąże się enzym.Ad. 4.:-na matrycy znajdują się jony metalu ciężkiego, z którym wiąże się enzym,-jony nie mogą powodować denaturacji białka,-np. His wiąże się z jonami Ni, Zn - wprowadza się często fragment białka do genu tak aby His była na N- lub C- końcu tworzy się domenę histydynową.Ogniskowanie chromatograficzne:-wytwarza się uformowany gradient pH,-na kolumnę nanosi się białko i podłącza napięcie,-wprowadzone Białko przemieszcza się po gradiencie pH aż dochodzi do miejsca pJ.,-Można zebrać poszczególne frakcje przy odpowiednich wartościach pH.

16.kryteria jednorodnosci bialek enzymatycznych.

1.jednorodnosci chemicznej:-PAGE (elktroforez w zelu poliakryloamiowym w warunkach denaturacyjnych i natywnych)-IEF (ogniskowanie izoelektryczne)-analiza immunochemiczna.2.jednorodnosci krytycznej(wykluczenie akywnosci innych niz docelowa w koncowym preparacie oczyszczonego bialka)3.jednorodnosci molekularnej(liczba AK N- i C- koncowych oraz sedymentacji podczas ultrawirowania)

17. Metody oznaczania aminokwasów N i C końcowych w białkach.Oznaczanie aminokwasów N-KOŃCOWYCH:-Z FDNB (metoda Sangera) - najstarsza metoda przy oznaczaniu aminokwasów N-końcowych ,pierwszy raz użyta przy oznaczaniu insuliny.;-Z fenyloizotiocyjanianem (metoda Edmana) - także do oznaczania kilku aminokwasów N- końcowych białka;-Z chlorkiem dansylu (metoda Gray'a);-Z cyjanianem potasy (metoda Starka)

18. Metody wyznaczania mas cząsteczkowych enzymów: 1.chemiczne (oznaczenie masy mineralnej)

m_st - masa atomowa jednego pierwiastka w białku;-wyliczenie na podstawie składy chemicznego sekwencji aminokwasów

2.Fizykochemiczne:-przez pomiar ciśnienia atmosferycznego (znaczenie historyczne);-przez pomiar szybkości reakcji ;

-za pomocą filtracji żelowej;-PAGE (elektroforeza) w warunkach denaturujących i w obecności SDS(Najpierw należy skalibrować kolumnę białkami wzorcowymi;Dokładność +/- do kilkuset Daltonów - za duży błąd - dlatego metoda jest rzadko stosowana)

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) w obecności SDS: marker -błękitbromofenolowy.Gdy otrzymywane są dwa wyniki to jest duże prawdopodobieństwo że białko jest glikoproteiną obecność reszty cukrowej powoduje giętkość białka

19. Ogólna charakterystyka enzymów proteolitycznych; peptydazy i proteinazy

Enzymy proteolityczne - są to grupy enzymów trawiennych posiadające zdolność do rozpraszanie białek. Do grupy enzymów proteolitycznych możemy zaliczyć m.in. proteazę. Dzielą się na endopeptydazy oraz egzopeptydazy. Z kolei enzymy egzopeptydazy można podzielić na karboksypeptydazy działające na koniec białka z grupą -COOH, aminopeptydazy działające na koniec białka z grupą -NH₂.Egzopeptydazy - enzymy hydrolityczne z grupy proteaz, katalizujące odłączenie od łańcuchów peptydowych pojedynczych aminokwasów: C-końcowych -karboksypeptydazy lub N-końcowych - aminopeptydazy.Endopeptydazy - to enzymy hydrolityczne z grupy proteaz, katalizujące odłączenie od łańcuchów peptydowych pojedynczych aminokwasów. Endopeptydazy rozkładają cząsteczkę białka na małe fragmenty peptydowe. Do endopeptydaz należą enzymy trawienne np. pepsyna, trypsyna, chymotrypsyna.Endopeptydaza to inaczej proteinaza.

20. Metody działania proteinaz serynowych na przykładzie chymotrypsynyOgólny przebieg reakcji

E - P₂ - acyloenzym - enzym połączony z częścią białka.Struktura chymotrypsyny:-Masa wynosi ok. 25 kDa,-Składa się z 3 łańcuchów polipeptydowych połączonych mostkami disulfidowymi,-Kształt cząsteczki - elipsoidalny,-Enzym zawiera system przeciwbieżnych struktur β, jedynie przy C-końcu występują 2 krótkie helisy,-Struktury β tworzą 2 cylindryczne domeny przedzielone kieszenią katalityczną.Chymotrypsyna:-hydrolizuje wiązania peptydowe po karboksylowej stronie wewnętrznych reszt: Tyr, Trp, Phe, Met i Leu - jest zatem proteinazą,-hydrolizuje także wiązania estrowe w pochodnych wyżej wymienionych aminokwasów - reakcja ta nie ma większego znaczenia fizjologicznego lecz niekiedy stosuje się ją przy oznaczeniu aktywności enzymu.Hydroliza wiązań estrowych - reakcja 2 etapowa:Etap I :-acylacja enzymu z uwolnieniem P₁,-nukleofilowy atak grupy -OH z Ser na tlen przy wiązaniu estrowym,-uwolnienie produktu P₁,-utworzenie kowalencyjnego kompleksu przejściowego (acetylo-enzym),-wodór z reszty -OH Ser połączony jest z produktem P₁.Etap II:-decylacja enzymu na drodze hydrolizy z uwolnieniem P₂,-atak cząsteczki H₂O na acetylo-enzym,-grupa -OH z wody przyłącza się do enzymu do Ser,-grupa -H (proton) dołączony jest do uwalnianego produktu P₂.Hydroliza wiązania peptydowego - reakcja 2 etapowa:1.acylacja enzymu z uwolnieniem P₁2.deacylacja enzymu na drodze hydrolizy, z uwolnieniem P₂.Mechanizm:1.E+S.Substrat dochodzi do enzymu w pobliże wnęki wiążącej. Wnęka wiążąca ma powinowactwo do R₁ reszty substratu. R₁ to gł. Phe, Tyr, Trp, Met, Leu - te wiązania w pobliżu tych aminokwasów ulegną rozszczepieniu.2.E-S.Reakcja hydrolizy zaczyna się od ataku atomu tlenu grupy -OH Ser 195 na karboksylowy atom węgla hydrolizowanego wiązania peptydowego.Układ przeniesienia ładunku, odcinając proton z grupy -OH Ser 195 nadaje jej charakter silnie nukleofilowy. Skutkuje to zmianą konfiguracyjną w substracie wokół węgla karboksylowego substratu. Następuje przesunięcie tlenu z substratu do przestrzeni - początek tworzenia dziury anionowej.3.E+S* ES₁*Układ się wypiętrza. Przesunięcie tlenu z substratu do przestrzeni stwarza możliwość wytworzenia mostków wodorowych między grupą iminową przy Ser a Gly 193. Substrat zostaje związany kowalencyjnie z enzymem - powstaje kowalencyjny intermediat, dodatkowo widoczne efekty konformacyjne. Zmienia się układ wodorowy w triadzie katalitycznej. His 57 przekazuje proton na atom azotu wiązania peptydowego. Po związaniu substratu powstaje tzw. Dziura anioniwa - widoczny O^-. na tym etapie aminowa część substratu wiąże się wodorowo z His 57 a część kwasowa pozostaje zestryfikowana z Ser 195. w ten sposób kończy się etap acylacji..acyloenzym +P₁

Wiązanie peptydowe w rezultacie przemian ulega pęknięciu - hydroliza. Na tym etapie tlen, którym był oksyanionem wraca do poprzedniej formy i opuszcza dziurę anionową. Następnym etapem reakcji jest deacylacją. Koniec I etapu - powstaje pierwszy produkt oraz acyloenzym.4)enzym - substrat₂* E - S₂*.Do reakcji wchodzi cząsteczka H₂O. Zajmuje ona pozycję w miejscu aktywnym. His 57 ponownie daje proton (odrywając od H₂O tworząc jon imidazolowy prowadząc do związania i powstania drugiego intermediatu. Ponownie powstaje dziura anionowa O^- z tlenu substratu..5) acetyloenzym + woda.Proton przekazany przez His 57 został oderwany od H₂O. powstały -OH atakuje jednocześnie karbonylowy atom węgla grupy acylowej połączonej z Ser 195. powstaje przejściowy tetraedryczny związek pośredni. Tlen O^- powraca do postaci =O.6) E + P₂ His 57 przekazuje proton na atom tlenu Ser 195, powodując uwolnienie kwasowej części substratu. Kwasowy składnik substratu ulega dysocjacji i enzym jest gotowy do następnego cyklu katalizy.7) E - P₃.Rozpoczęcie drugiego cyklu reakcji. Zregenerowany enzym spotka się z nowym polipeptydowym sustratem.Podsumowanie:-2 etapy hydrolizy,-wytworzenie kowalencyjnych intermediatów,-hydroliza kwasowo-zasadowa --> kwas -H z Ser; zasada -OH z cząst. H₂O

21. Mechanizmy działania proteinaz cysteinowych

Proteinazy cysteinowe działają z utworzeniem kowalencyjnego produktu pośredniego o charakterze tetraedrycznym. Występują w lizosomach - i to są tak zwane katepsyny. Najlepiej poznaną jest katepsyną B - właśnie lizosomalny enzym.Mechanizm działania proteinaz cysteinowych jest podobny do mechanizmu działania proteinaz serynowych z tym, że w centrum aktywnym tych enzymów występuje katalityczna diada a nie triada. I ta katalityczna diada obejmuje dwa aminokwasy - dwie reszty - oczywiście resztę cysteiny i resztę histydyny. Nie ma konieczności stabilizacji tych dwóch reszt przez dodatkową resztę. Układ cysteina-histydyna, tzn grupa wodorosiaczkowa cysteiny która tutaj pełni rolę nukleofilu i grupa imidazolowa histydyny w tym układzie są wystarczająco stabilne, albo też w jakiś inny sposób są stabilizowane. Wodór przechodzi na imidazol z grupy wodorosiarczkowej dopiero wówczas, kiedy znajdzie się w centrum aktywnym substrat i kiedy nastąpi atak nukleofilowy. Czyli wyjściowo jest tu grupa -SH a powinien być sam imidazol. Jednakże ten atak nukloefilowy rzeczywiście prowadzi do przejścia atomu wodoru z grupy wodorosiarczkowej na pierścień imidazolowy i dzięki temu zyskuje ładunek dodatni (cały pierścień, a nie tylko atom). Azot jest już 4-rzędowy. Powstaje tetraedryczny produkt pośredni, dzięki utworzeniu wiązania siarka-węgiel. W proteinazach serynowych było to wiązanie tlen-węgiel. Trzeba pamiętać, że kowalencyjne wiązanie, wypiętrzenie się tetraedru i przejście tego tlenu karbonylowego do dziury oksyanionowej, układ ten stabilizowany jest przez wiązania wodorowe. W każdym bądź razie, taki tetraedryczny stan pośredni jest stanem nietrwałym. Wodór z pierścienia imidazolowego przechodzi na grupę aminową. Wodór pochodzi z grupy wodorosiarczkowej. Odłącza się aminowy produkt reakcji - będzie to w odniesieniu do wyjściowego substratu i powstaje właśnie ten acyloenzym. W etapie deacylacji już z udziałem cząsteczki wody. Również powstanie tetraedrycznego produktu pośredniego, przekazanie z cząsteczki wody atomu wodoru na imidazol i w efekcie po powstaniu tego tetraedrycznego, nietrwałego kompleksu pośredniego następuje, pęknięcie w tym wypadku wiązania estrowego. Czyli zupełnie tak samo jak w przypadku proteinaz serynowych.

22. Mechanizm działania proteinaz aspartylowych:Więc jaka jest sytuacja: w tym wypadku dwie reszty kwasu asparaginowego. Jedna występuje w formie niezjonizowanej, czyli grupa gamma-karboksylowa COOH, natomiast druga reszta występuje w formie zjonizowanej COO-. Od razu bierze w reakcji udział woda, której cząsteczka jest kompleksowana wiązaniami (oddziaływaniami) wodorowymi, obydwiema resztami kwasu asparaginowego. Oczywiście do centrum aktywnego dostaje sie peptydowy substrat, którego wiązanie CO-NH ma zostać rozłożone. Od razu bierze udział w reakcji woda. Grupa OH od grupy karboksylowej jednej reszty spartylowej atakuje węgiel karbonylowy i wodór przyłącza się do tlenu karbonylowego, pęka wiązanie podwójne i przyłącza się do tego węgla grupa hydroksylowa z cząsteczki wody. Natomiast wodór z cząsteczki wody przechodzi na drugą resztę aspartylową. Czyli sytuacja sie zmienia, bo ta reszta aspartylowa, która występowała w formie niezdysocjowanej oddając atom wodoru ulega dysocjacji, natomiast druga reszta przechodzi w stan niezdysocjowany przyjmując atom wodoru z cząsteczki wody. Powstaje również taki tetraedryczny produkt pośredni, z tym że w tym wypadku produkt w żadnym momencie reakcji nie jest połączony wiązaniem kowalencyjnym z enzymem. Nie ma etapu acylacji enzymu oraz deacylacji enzymu. Następnie ten wodór z cząsteczki wody atakuje rozkładane wiązanie peptydowe, i od razu następuje odłączenie obydwu produktów reakcji z centrum aktywnego, przy czym te reszty kwasu asparaginowego wracają do pierwotnego stanu. Czyli tego rodzaju kataliza odbywa sie poprzez deformacje cząsteczki substratu i również jest to kataliza kwasowo-zasadowa, przy czym kwas jest to atom wodoru pochodzący od jednej z reszt kwasu asparaginowego, natomiast zasadą jest grupa OH z cząsteczki wody.

23. Mechanizm działania hydroliz glikozydowych na przykładzie β-galaktozydazy i α-amylazy.

Mechanizm na przykładzie α-amylazy trzustki wieprzowej:Aminokwasy biorące udział w katalizie: Asp 197, Asp 300, Glu 233, ważny także aminokwas z łańcucha przenoszenia protonów: Arg 195..1)Z grupą karboksylową Glu 233 łączy się cząsteczka H₂O.2)Atak nukleofilowy tlenu z cząsteczki H₂O na węgiel C1 przy odszczepianym wiązaniu glikozydowym. Asp 197 odbiera proton z łańcucha przenoszenia protonów od Arg 195 i przenosi go na tlen pierścienia glukopiranozowego przy węglu C1 rozszczepionego wiązania. Następuje protonacja hemiacetalowego tlenu, co powoduje rozszczepienie pierścienia glukopiranozowego i przyłączenie protonu do tlenu przy węglu C1 rozszczepionego wiązania. Wszystko to prowadzi do otwarcia pierścienia w jednej z reszt, do której należy C1 biorący udział w rozszczepianiu wiązania.3)Zmiana położenia grupy -OH przy węglu C1. Po zmianie konfiguracji rozszczepienia wiązania glikozydowego.4)Uwalnia się pierwszy produkt reakcji - łączy się on mostkiem wodorowym z Glu 233. Odciągnięcie protonu przez Asp 197 od grupy -OH przy węglu C5.5)Następuje ponowne zamknięcie pierścienia - drugi produkt się odłącza. Stabilizacja enzymu - ponowny cykl reakcji. Powstałe produkty są odłączone już w formie pierścieniowej.Mechanizm działania β-galaktozydazy.I Mechanizm hydrolizy laktozy wg Espinozy i in.:-Kluczową rolę odgrywają 2 aminokwasy Glu 461 i Glu 537,-Glu 461 pełni rolę zarówno kwasu jak i zasady i lokuje sie w odległości 4,2 A od anomerycznego atomu węgla ,-Glu 537 łączy się kowalencyjnie z resztą galaktopiranozy i tworzy intermediat enzym-galaktozyl - Glu 537 pełni rolę nukleofila tej reakcji ,-Bardzo ważną rolę odgrywa Tyr 503, której grupa -OH umożliwia protonację interglikozydowego atomu tlenu.,-Koniecznym etapem jest reakcja transglikozydacji, gdzie laktoza przechodzi w allolaktozę.,-Z allolaktozy dwa etapy hydrolizy:1)Odłączenie cząsteczki glukozy od laktozy. Glukoza ulega protonacji dzięki grupie -OH Tyr 503.2)Do centrum aktywnego dostaje się cząsteczka H₂O. Jest ona donorem grupy -OH dla cząsteczki galaktozy i donorem -H+ dla Tyr503;,-po dołączeniu -OH do galatkozy i -H+ do Tyr503, reakcja sie kończy

II Mechanizm wg Juers i in.:-Bardzo podobny do poprzedniego, ale nie przewiduje powstawania allolaktozy - nie ma przejściowego intermediatu,-Tak jak poprzednio powstaje kompleks enzym-galaktozyl,-Musi odłączyć się cząst. Glukozy - jednak w tym przypadku nie atakuje grupa -OH Tyr tylko Glu461 połączona z jonami Mg2+. Jon Mg2+ prowadzi atak nukleofilowy na tlen glikozudowy powstaje kompleks MgOR, gdzie R - cząsteczka odchodzącej glukozy.,-Odłącza się cząsteczka glukozy.,-Dalej reakcja przebiega analogicznie - wniknięcie H₂O do centrum aktywnego. Grupa -OH do galaktozy -H do Glu461 po odłączeniu jonów Mg2+,-Koniec reakcji.

24. Ekstremozymy:-termofile - adaptowane do życia w wysokich temperaturach,-psychrofile - adaptowane do życia w niskich temperaturach,-barofile - adaptowane do życia w wysokich ciśnieniach,-halofile - adaptowane do życia w wysokich stężeniach soli,-acidofile - żyją w niskich pH,-alkalofile - żyją w wysokich pH,-kserofile - niewielkie ilości wody; silne wysuszenie środowiska,-metalofile - żyją przy bardzo wysokich stężeniach metali cięzkich Pb, Cu, Cd...,-radiofile - przy wysokim poziomie radiacji,-mikroaerofile - żyją w środowiskach o niskich stężeniach tlenu,-eutektofile - żyją w eutektycznej fazie macierzy lodowej, w fazie nitryfikacji, zeszklenia. Woda przeniesienia się w lód ale jej ciekłe cząsteczki z nutrientami.

Ekstremofile - mikroorganizmy żyjące w środowiskach ekstremalnych dla człowieka

Podstawowe przystosowania drobnoustrojów do ekstremalnych środowisk:-specyficzne mechanizmy akumulacji energii.,-Utrzymanie homeostazy środowiska wewnątrzkomórkowego i metabolizmu,-Stabilność komponentów funkcjonalnych ,-Dostosowanie kinetyki reakcji biochemicznych do warunków środowiska ,-Odpowiednie tempo obrotu białek.

25. Enzymy adaptowane do niskich temperatur - właściwości i znaczenie gospodarcze.Rozpowszechnienie drobnoustrojów zimnolubnych.Drobnoustroje zimnolubne stanowią przeważającą część mikloflory ziemskiej.Ich główne siedliska to:-zimne wody morskie i słodkie,-dna oceanów, muły, osady głębokich jezior,-polarne i wysokogórskie gleby,-lód lodowców,-rośliny i zwierzęta z zimnych obszarów,-gleby obszarów o umiarkowanym klimacie,-mrożona i chłodzona żywność.Psychrozymy - enzymy organizmów psychrofilnych:-adaptowane do niskich temp.,-zimne białka.Temperatury optymalne enzymów drobnoustrojów psychrofilnych:-Vibro marinus MP1 dehydrogenaza izocytrynianowa 7st.C,- Morexela lipaza 40st.C,- niesklasyfikowane bakt. Antarktyczne metaloproteaza 28st.C,- Arthrobacter D2 β-galaktozydaza 20-25st.C,- Nototeina permeaza jelitowa -2st.C.Właściwości kinetyczne psychrozymów:-obniżona o conajmniej 15-20st.C Top w porównaniu z mezofilnymi odpowiednikami i stosunkowo wysoka aktywność poniżej 20st.C, a często również w 0st.C,-w zakresie 0-30st.C reaktywność enzymu i jego fizjologiczna skuteczność jest wyższa niż mezofilnych odpowiedników, natomiast energia aktywacji jest niższa.-Ograniczona stabilność termiczna co przejawia się szybką denaturacją w umiarkowanych temperaturach i co jest kinetyczną konsekwencją giętkości strukturalnej psychrozymów.Właściwości strukturalne psychrozymów:-niższa zawartość Pro w pętli, których obecność prowadzi do wzrostu stabilności termicznej i sztywności termicznej cząsteczki białka.,-niższa zawartość Arg w puli aminokwasów zasadowych. Reszty Arg usztywniają strukturę białka i zwiększają jego termostabilność, dzięki zdolności grupy guanidynowej Arg do tworzenia par jonowych wiązań wodorowych.,-Mniej mostków solnych. Są one jednymi z najsilniejszych czynników stabilizujących konformację białka.,-Niższy współczynnik kohezji,-Podstawienia aminokwasów w krytycznych obszarach blisko aktywnego centrum.,-Wyższa zawartość glicyny w pobliżu funkcjonalnych domen.,-Mniej interakcji hydrofobowych,-Mniej wiązań wodorowych,-Zwiększona hydrofilowość powierzchnii,-Luźniejsza konfiguracja Ca2+,-Wysoka giętkość stanu sfałdowania, ale bez istotnych zmian w strukturze II-rzędowej i naddrugorzędowej, większa ilość i dłuższe pętle.Możliwość aplikacji psychrozymów i ich producentów:1.Ochrona środowiska:-biodegradacja polutantów w zimnym i umiarkowanym klimacie,-rekultywacja zanieczyszczeń gleby „in situ”,-produkcja biogazu w zimnym i umiarkowanym klimacie2.Przemysł spożywczy:-serowarstwo,-piwowarstwo,-mleczarstwo,-konserwacja żywności.3.Chemia gospodarcza:-produkcja środków piorących 3.Biotransformacja:-modyfikacja antybiotyków,-otrzymywanie nienasyconych estrów wosków,-synteza nienasyconych triacylogliceroli,-stereospecyficzna synteza estrów, peptydów i in.,-Synteza i modyfikacja lotnych związków 4.Biologia molekularna5.Inne:-odwłaszczanie skór w garbarstwie,-odzysk srebra z błon rentgenowskich,-produkcja lotnych związków i/lub ich modyfikacje,-biogeochemia.

26. Enzym hipertermofili jako przykład termofilnych białek:

Termozymy- enzymy organizmów termofilnych ,pochodzą głównie z hipertermofili.Strukturalne właściwości termozymów:-wzrost hydrofobowości prowadzący najczęściej - wraz z dodatkową lotną siecią wiązań wodorowych w rdzeniu cząsteczki - do spadku zawartości i objętości wewnętrznych jamnistości w molekule, czyli do bardziej efektywnego upakowania łańcucha polipeptydowego.-Wzrost liczby mostków solnych, trwałych nawet bardzo polarnym środowisku. Stabilizują one struktury II-rzędowe.-Stabilizacja α-helis przez zwiększenie zawartości Ala i kompensację ładunków przy N- i C- końcu przeciwnie naładowanym.-Wzrost liczby wiązań wodorowych, głównie typu: reszta naładowana - obojętna.-Stabilizacja pętli łączących odcinki o regularnej strukturze II - rzędowej, poprzez ich skrócenie a nawet eliminację .-Obniżenie naprężeń konformacyjnych w białkach zawierających lewoskrętne odcinki helikalne poprzez zwiększenie zawartości Gly.-Redukcja entropii rozfałdowania łańcucha poprzez wzrost zawartości Pro i Gly.-Zwiększenie liczby mostków disulfidowych.-Odporność na kowalencyjną destrukcję ..Wszystkie powyższe cech termozymów sprawiają że ich cząsteczki są sztywne, a tym samym bardziej odporne na termoinaktywację.Wykorzystanie termozymów:1)Biologia molekularna:-amplifikacja DNA, PCR i LCR - reakcja łańcuchowa ligazy,-sekwencjonowanie genów2)Przemysł chemiczny:-papiernictwo ,-chiralna synteza chemiczna.3)Przemysł spożywczy i paszowy:-przetwórstwo skrobi,-otrzymywanie syropów fruktozylowych,-browarnictwo i piekarnictwo,-przetwórstwo odpadów keratynowych4)Przemysł wydobywczy ropy i gazu5)Chemia gospodarcza:produkcja środków piorących6)Diagnostyka medyczna7)Inne:-biosensory,-biouzdatnianie

27. Immobilizacja enzymów.Termin immobilizacja- pochodzi od łacińskiego słowa immobilia, czyli nieruchomy. Przez ten termin rozumiemy rozmaite metody, które ograniczają (całkowicie lub częściowo) swobodę poruszania się określonych atomów, cząsteczek, substancji lub materiału biologicznego na podłożu stałym, czy też wewnątrz specyficznych struktur.Immobilizuje się nie tylko pojedyncze enzymy, ale również kilka enzymów i jest to tzw. koimmobilizacja. Można też immobilizować całe komórki, przy czym to może być immobilizacja podczas której komórka traci swoje funkcje życiowe (nie produkuje nowych enzymów, nie rozwija się), ale stanowi tak jakby „worek” wypełniony określonymi biokatalizatorami- taka komórka jest unieruchamiana w stałym nośniku. Można też immobilizować:- żywe komórki w taki sposób, że zostaje zachowana ich aktywność metaboliczna (w tym również zdolność do reprodukcji).- struktury subkomórkowe, które są metabolicznie wyspecjalizowane i można je wykorzystać w praktyce.Celem immobilizacji jest:-zwiększenie stabilności biokatalizatora,-obniżenie kosztów biokatalizatora ( dzieje się tak, ponieważ enzymy indywidualnie można używać jednokrotnie w danym procesie, natomiast preparaty immobilizowane mogą być użyte wielokrotnie w kolejnych reakcjach danego procesu ),-immobilizacja całych komórek ułatwia wykorzystanie enzymów wewnątrzkomórkowych i tych, które występują w błonach biologicznych,-dzięki immobilizowanym preparatom udaje się skrócić czas reakcji ,-możliwość prowadzenia procesów ciągłych,-ułatwienie kontroli procesu,-łatwiejsze oddzielenie produktu,-bardzo często zwiększa się specyficzność reakcji (powstaje mniej produktów ubocznych,-zwiększenie odporności biokatalizatora na rozpuszczalniki organiczne,-przy użyciu immobilizowanych biokatalizatorów nie są wymagane bardzo kosztowne fermentory.Z użyciem immobilizowanych biokatalizatorów związane są pewne niedogodności:-zwiększa się koszt otrzymania preparatu ,-podczas immobilizacji może dojść do ograniczenia aktywności, a nawet do zmiany specyficzności enzymu- zwłaszcza gdy immobilizacja następuje przez wiązanie kowalencyjne z nośnikiem. (następuje ograniczenie dostępności do centrum aktywnego dla substratów, ale są sposoby by tego uniknąć, np. prowadzi się immobilizację w obecności czynników, które zwiększają porowatość matrycy).Stosowane metody unieruchamiania:1)fizyczne:-adsorpcja enzymu na nierozpuszczalnej matrycy,-pułapkowanie biokatalizatora wewnątrz struktury naturalnych lub syntetycznych polimerów.Podstawowe znaczenie dla powstania tego typu preparatu mają wiązania jonowe, oddziaływania hydrofobowe, również oddziaływania van der Waalsa, a także oddziaływania wodorowe. Metody fizyczne pozwalają na zachowanie natywnej struktury enzymu. Są to metody stosunkowo tanie, ale dają preparaty o niezbyt dużej trwałości (podczas procesu może dojść do desorpcji biokatalizatora z matrycy a także do jego wymycia). Poprzez zachowanie natywnej struktury unieruchomnianego enzymu nie dochodzi do zmniejszenia jego aktywności.2)chemiczne: -powstają wiązania kowalencyjne dzięki którym biokatalizator związany jest z nierozpuszczalną matrycą. - stosuje się też sieciowanie enzymu za pomocą wielofunkcyjnych odczynników.-wiązaniu biokatalizatora z innymi cząsteczkami (np. innym białkiem lub rozpuszczalnym syntetycznym polimerem, przykładem jest glikol, albo cząsteczkami rozpuszczalnego dekstranu).Ułatwia to oddzielenie unieruchomionego biokatalizatora. W przypadku użycia rozpuszczalnych związków jako matrycy, do oddzielenia biokatalizatora stosowana jest ultrafiltracja. Preparaty otrzymane metodami chemicznymi są trwalsze, bardziej stabilne. Następuje jednak pewna zmiana konformacji biokatalizatora, zwłaszcza przy sieciowaniu za pomocą wielofunkcyjnych odczynników, co prowadzi do pewnej zmiany aktywności. Są to metody bardziej kosztowne, bo oprócz nośników stosuje się także odczynniki wielofunkcyjne (np. aldehyd diglutarowy).Omówienie podstawowych form unieruchamiania:1)wiązanie na powierzchni nośnika:- zachodzi na drodze adsorpcji fizycznej. Prowadzi do uzyskania niezbyt trwałego preparatu, ponieważ zmiana pH lub siły jonowej może spowodować desorpcję.-Wiązanie kowalencyjne- bezpośrednie wiązanie poprzez określone grupy funkcyjne białka enzymatycznego, pośrednie za pomocą czynników sprzęgających, czyli swojego rodzaju ligandów, które łączą białka z matrycą.2)Możliwe jest także wiązanie wewnątrz matrycy nośnika - biokatalizator łączy się z monomerami (albo rozpuszczalnymi polimerami) i przeprowadza się proces polimeryzacji (albo sieciowania). Można w ten sposób uzyskać w postaci kulek lub włókienek.3)Możliwe też jest zamykanie enzymu wewnątrz półprzepuszczalnych membran. Wtedy stosuje się zamykanie w mikrokapsułkach albo pomiędzy półprzepuszczalnymi membranami4)Można uniknąć stosowania nośnika poprzez bezpośrednie sieciowanie biokatalizatora. Immobilizuje się w ten sposób albo całe komórki stosując najczęściej odczynniki dwufunkcyjne, albo stosuje się sieciowanie białek enzymatycznych.Dostępne unieruchomione enzymy :-izomeraza glukozowa- stosowany do otrzymywania syropów glukozowo- fruktozowych i fruktozowych. Skrobię po scukrzeniu izomeryzuje glukozę do fruktozy.-glukoamylaza- scukrza skrobię .-lipazy-stosowane do zwiększenia asortymentu tłuszczów jadalnych..-inwertaza- hydroliza sacharozy do inwertu..-termolizyna- używana do produkcji aspartamu (dipeptyd zbudowany fenyloalaniny i kwasu asparaginowego, służy jako słodzik).-amidaza penicylinowa- otrzymywanie półsyntetycznych penicylin.-beta-tyrozynaza - do produkcji l-dopy- pochodna fenyloalaniny stosowana w terapi choroby Parkinsona.-nitrylaza- stosowana w produkcji akryloamidu

---