13 - Prezentacja antygenów limfocytom T

Limfocyty T nie odpowiadają na antygeny rozpuszczalne, lecz związane z cząsteczkami MHC w błonie komórek prezentujących antygen.

Cząsteczki MHC posiadają rowki, w których znajduje się szereg zagłębień (kieszonek). Aminokwasy, których łańcuchy boczne wchodzą do tych kieszonek nazywamy aminokwasami kotwiczącymi, i są one wspólne dla wszystkich peptydów wiązanych przez daną cząsteczkę MHC. Fragment antygenu, który wiązany jest w rowku cząsteczki MHC zwany jest agretopem (podczas gdy epitop to fragment antygenu rozpoznawany przez limfocyt). Wyróżniamy:

• MHC I → obecne powszechnie w organizmie; prezentowany peptyd zakotwiczony jest w kieszonkach po obu stronach rowka; są to zazwyczaj antygeny endogenne (głównie wirusowe, syntezowane wewnątrz komórki prezentującej), rozpoznawane przez limfocyty T CD8⁺ (głównie Tc). Wyróżniamy następujące etapy:

• monoubikwitynacja (przyłączenie do lizyn pojedynczych ubikwityn) lub poliubikwitynacja (przyłączenie rozgałęzionych wielołańcuchowych ubikwityn) i skierowanie do proteasomu

• skierowanie powstałych oligopeptydów do wnętrza siateczki śródplazmatycznej przy udziale transportera zbudowanego z dwóch białek TAP

• połączenie z cząsteczkami MHC I i transport do błony komórkowej

• eliminacja przez limfocyty Tc, immunoglobuliny i dopełniacz oraz rozpoznanie przez limfocyty Th i wzmożenie odpowiedzi humoralnej.

• MHC II → obecne na komórkach dendrytycznych, limfocytach B i makrofagach; rowek ma charakter otwarty, prezentowany peptyd wystaje po obu jego stronach; są to przede wszystkim antygeny pochłonięte na drodze endocytozy, rozpoznawane przez limfocyty T CD4⁺ (głównie Th). Wyróżniamy następujące etapy:

• endocytoza antygenów → wiedzie przez wczesne endosomy (pH 6-6,5), późne endosomy (pH 5,5) i lizosomy (pH 4,5-5)

• proteoliza → prezentowane peptydy powstają w endosomach, gdyż w lizosomach zachodzi końcowa proteoliza prowadząca do powstania pojedynczych aminokwasów

• związanie przez cząsteczki MHC II → zachodzi w specjalnych endosomach (zwane przedziałem MHC klasy II), po uprzednim odłączeniu peptydu CLIP umiejscowionego w rowku cząsteczki, zabezpieczający przed przyłączeniem peptydów endogennych.

Prezentacja antygenów może również zachodzić poprzez cząsteczki CD1, których rowek jest stosunkowo obszerny i hydrofobowy; prezentują one antygeny o charakterze lipidów i glikolipidów pochodzące od mikroorganizmów. Cząsteczki te występują na monocytach, limfocytach B i niektórych komórkach dendrytycznych (CD1a-c), a także na limfocytach NKT (CD1d).

Do komórek prezentujących antygen zaliczamy:

• Komórki dendrytyczne → charakterystyczne cechy to wypustki, ziarna Birbecka, markery powierzchniowe (CD1a, CD40, CD54, CD58, CD80, CD83, DC-SIGN), brak CD14, obecność w dużym stężeniu cząsteczek MHC klasy I i II. Pochodzą ze szpiku, na ich różnicowanie wpływa stymulująco GM-CSF, Il-4, TGFβ, TNF oraz kontakt z cząsteczką CD40L; hamująco wpływa Il-10. Wyróżniamy:

• komórki mieloidalne - wydzielają duże ilości Il-2, aktywują raczej limfocyty Th1

• komórki limfoidalne - aktywują raczej limfocyty Th2

Nabywają antygeny głównie w drodze endocytozy zależnej od receptorów FcR, receptora dla mannozy, dla składników dopełniacza czy receptorów Toll-podobnych (TLR).

• Limfocyty B → prezentują antygen, by uzyskać pomoc od limfocytów T w wytwarzaniu immunoglobulin (poprzez cytokiny i cząsteczki kostymulujące CD40 oraz CD40L).

• Makrofagi → syntezują cząsteczki MHC II pod wpływem interferonu γ; odgrywają rolę w prezentacji antygenów pochodzących z dużych fagocytowanych cząsteczek lub bakterii.

• Komórki syntezujące cząsteczki MHC klasy II pod wpływem interferonu γ → monocyty, neutrofile, komórki śródbłonka, enterocyty, keratynocyty, chondrocyty, komórki mezangium, astrocyty, oligodendrocyty, komórki nabłonkowe (tarczycy, kanalików nerkowych, pęcherzyków gruczołu sutkowego, dróg żółciowych), pobudzone limfocyty T.

Prezentacja antygenów w grudce limfatycznej:

• limfocyty T

• docierają do obwodowych narządów limfatycznych poprzez żyłki z wysokim śródbłonkiem, znajdujące się w obrębie stref grasiczozależnych

• przemieszczają się wzdłuż wypustek komórek dendrytycznych → po rozpoznaniu swoistego antygenu prezentowanego przez komórkę dendrytyczną limfocyt rozpoczyna intensywną proliferację, a na jego powierzchni pojawia się receptor CXCR5 dla chemokiny BLC wytwarzanej przez komórki dendrytyczne grudek

• w międzyczasie limfocyty B

• ulegają aktywacji w strefie grasiczozależnej, po czym kierują się do grudek

• rozpoczynają niezbyt intensywną proliferację, a na ich powierzchni pojawia się receptor CCR7 dla chemokin SLC i ELC wytwarzanych w strefie grasiczozależnej

• pod wpływem chemokin limfocyty T i B zbliżają się do siebie tuż przy granicy grudki

• w wyniku bezpośredniego kontaktu, w którym uczestniczą cząsteczki kostymulujące należące do nadrodziny TNF (OX40L na limfocytach B i OX40 na limfocytach T), limfocyty T rozpoczynają wytwarzanie Il-4 i innych cytokin

• powstawanie ośrodków rozmnażania w grudkach

• oprócz limfocytów T i B, w procesie tym biorą udział też komórki dendrytyczne grudek, które nie przywędrowują z antygenami, ale otrzymują je z zatoki brzeżnej węzła za pośrednictwem komórek transportujących antygen; posiadają długie wypustki, które po immunizacji grubieją; odpowiedzialne są za zagęszczanie antygenów prezentowanych limfocytom B, stąd nazywane są ciałami pokrytymi kompleksami immunologicznymi, lub iccosomami (immune complex coated bodies)

• ośrodek rozmnażania ma pochodzenie oligoklonalne → powstaje z kilku limfocytów B

• w strefie ciemnej występują centroblasty, w których powstają liczne mutacje somatyczne, w wyniku których na zasadzie przypadku może dojść do zwiększenia lub zmniejszenia powinowactwa limfocytu do antygenu

• w strefie jasnej znajdują się centrocyty, które już nie dzielą się, a wręcz przeciwnie - bardzo łatwo ulegają apoptozie → do przeżycia potrzebują nieustannego pobudzania, które gwarantowane jest, jeśli rozpoznają antygeny prezentowane tu przez komórki dendrytyczne grudek (niektóre limfocyty zamiast ulec apoptozie mogą być poddane redagowaniu receptorów, czyli dochodzi w nich do reekspresji genów RAG1 i RAG2, umożliwiając ponowną rearanżację genów immunoglobulinowych)

• autoreaktywne limfocyty B nie przeżyją powyższej selekcji, chyba że przypadkowo w danym ośrodku rozmnażania prezentowany jest własny antygen; do przeżycia limfocytu B konieczny jest za to kolejny sygnał, pochodzący od limfocytu Th (jeśli antygeny prezentowane przez limfocyty B zostaną swoiście rozpoznane przez limfocyty Th, obie populacje ulegają ponownej aktywacji, co prowadzi do różnicowania się limfocytów B w komórki plazmatyczne, wędrujące do szpiku, lub limfocyty B pamięci, migrujące do drugorzędowych narządów limfatycznych).

Mitogen - indukuje mitozę w większości limfocytów B lub T, gdyż oddziałują na wiele ich klonów.

Do mitogenów wyłącznie limfocytów T należą konkanawalina A, fitohemaglutynina i przeciwciała anty-CD3; limfocytów B - przeciwciała anty-Ig, LPS; limfocytów T i B - mitogen szkarłatki.

Superantygen - zdolny do pobudzenia określonej liczby klonów limfocytów, bo nie reaguje z unikatowym miejscem wiążącym antygen TCR, ale tylko z odcinkiem V łańcucha β, więc niezależnie od łańcucha α. Ma zatem wpływ pośredni między antygenem (oddziałującym z unikatowym TCR) a mitogenem (aktywującym prawie wszystkie limfocyty T).

14 - Aktywacja limfocytów

Transformacja blastyczna - zmiany zachodzące w wyniku aktywacji limfocytu, obejmujące powiększenie objętości komórki i jądra komórkowego, charakterystyczne zmiany chromatyny oraz pojawienie się jąderek.

Warunkiem aktywacji limfocytu dziewiczego jest otrzymanie dwóch sygnałów:

• rozpoznanie przez receptor TCR antygenu prezentowanego na cząsteczkach MHC (dla limfocytów CD4⁺ jest to MHC II, a dla limfocytów CD8⁺ - MHC I) → limfocyt powiększa swoje rozmiary i zaczyna wydzielać niewielkie ilości Il-2

• sygnał z cząsteczek kostymulujących → limfocyt powiększa swoje rozmiary, zwiększa syntezę RNA i białek i przechodzi do fazy G1 cyklu mitotycznego

• stymulacja przez CD28 na powierzchni limfocytu T, dla którego ligandami są B7.1/CD80 oraz B7.2 (CD86) wywołuje zwiększenie wydzielania Il-4, Il-5, Il-8, Il-13, IFN-γ, TNF i GM-SCF (B7.1 ma większe znaczenie przy wykształcaniu się odpowiedzi typu Th1, natomiast B7.2 odgrywa większą rolę przy odpowiedzi typu Th2) → CTLA-4 (CD152) wykazuje 40-100 krotnie większe powinowactwo do ligandów B7.1 i B7.2, ale przekazuje sygnał hamujący aktywację!

• ligandem dla CD2 (LFA-2) jest cząsteczka CD58 (LFA-3) na komórce prezentującej; stymulacja prowadzi do spotęgowania efektu wywołanego przez sygnał z TCR

Rozpoznanie antygenu bez prawidłowej kostymulacji prowadzi do stanu anergii

• zmniejsza się 20-50 krotnie wydzielanie Il-2

• zmniejsza się 10 krotnie wydzielanie Il-3 i GM-SCF

• zmniejsza się 2 krotnie wydzielanie IFN-γ

• wydzielanie Il-4 pozostaje bez zmian!

Limfocyt taki nie ulegnie aktywacji przy następnym zetknięciu się z antygenem, nawet jeśli wtedy otrzyma sygnały kostymulujące. Mechanizm ten jest jednym z podstawowych mechanizmów fizjologicznej tolerancji własnych antygenów na obwodzie.

Do aktywacji limfocytu pamięci wystarczy tylko sygnał pierwszy (z rozpoznania antygenu)!

Miejscem aktywacji limfocytów są zazwyczaj obwodowe narządy limfatyczne, do których wnikają poprzez żyłki z wysokim śródbłonkiem (HEV). Aktywacja zapoczątkowuje proces tworzenia synapsy immunologicznej między limfocytem T a komórką prezentującą antygen. Proces ten jest wieloetapowy i obejmuje:

• polaryzację limfocytu - zagęszczenie receptorów związanych z adhezją (m. in. integryn) na jednym biegunie komórki (lamelipodium) i zubożeniem w te cząsteczki przeciwnego bieguna (uropodium)

• adhezja limfocytu i komórki prezentującej

• fazę dojrzewania synapsy - przegrupowania białek i lipidów w obrębie błony komórkowej, umożliwiające przekazanie sygnału do jądra komórki; zachodzi przez skupianie się mikrodomen (regionów błony komórkowej wzbogaconych w sfingolipidy i cholesterol oraz zawierających białka błonowe uczestniczące w przekazywaniu sygnału do wnętrza komórki → konglomeraty receptorów pozwalają na reakcję nawet przy małym stężeniu antygenu - sąsiadujące białka przekaźnikowe nawzajem się fosforylują potęgując sygnały biegnące z powierzchni komórki). Z mikrodomen usuwane są cząsteczki CD43 (hamujące interakcję białek przekaźnikowych ze sobą) i niektóre fosfatazy (znoszące efekt aktywujący kinaz).

Dojrzała synapsa zawiera wielkocząsteczkowe agregaty molekuł SMACs. Wyróżniamy

• cSMACs - zlokalizowane centralnie, wzbogacone w receptory TCR, kompleksy peptyd-cząsteczka MHC, cząsteczki kostymulujące i ich ligandy oraz białka przekaźnikowe

• pSMACs - zlokalizowane peryferyjnie, utworzone z cząsteczek adhezyjnych i ich ligandów oraz białka taliny (białko wiążące aktynę)

Przekazywanie sygnału do wnętrza komórki:

• połączenie cząsteczki CD4 lub CD8 z cząsteczką MHC odpowiedniej klasy i aktywacja kinazy Lck niekowalencyjnie związanej z CD4 lub CD8

• fosforylacja tyrozyny motywu ITAM znajdującego się w obrębie cząsteczki CD3 kompleksu receptora TCR

• przyłączenie do ufosforylowanych tyrozyn kinazy ZAP-70 i jej aktywacja poprzez ufosforylowanie przez kinazę Lck

• fosforylacja przez ZAP-70 kolejnych tyrozyn, nie tylko w obrębie własnej cząsteczki

• uruchomienie kaskady białek odpowiedzialnych za dalsze przekazanie sygnału do komórki, np. po fosforylacji białka LAT przez kinazę ZAP-70

• szlak związany z metabolizmem fosfatydyloinozytolu

• połączenie fosfolipazy C-γ z aktywną formą białka LAT

• fosforylacja fosfolipazy C-γ z udziałem kinaz tyrozynowych z rodziny Tec

• katabolizm fosfolipidów błony z wytworzeniem przekaźników drugiego rzędu:

• 1,4,5-trifosforan inozytolu (IP3) - uwolnienie jonów wapniowych z wewnątrzkomórkowych magazynów i aktywacja kalcyneuryny z udziałem kalmoduliny; cząsteczkami docelowymi dla kalcyneuryny są czynniki transkrypcyjne z rodziny NF-AT, które ulegają aktywacji przez defosforylację, przemieszczają się do jądra komórkowego, gdzie razem z czynnikiem AP-1 tworzą kompleks odgrywający rolę w transkrypcji genów głównie dla Il-2, Il-3, Il-4, Il-13, IFN-γ, GM-SCF, TNF i receptorów powierzchniowych

• diacyloglicerol (DAG) - bezpośrednio aktywuje kinazę białkową C, która aktywuje czynnik transkrypcyjny AP-1

• kaskady kinaz białkowych aktywowanych przez mitogen (MAP); schemat tej kaskady:

• aktywowana GTPaza, np. białko Ras (aktywacja przez przyłączenie do związanego z białkiem LAT kompleksu białka adaptorowego Grb2 i czynnika wymiany Sos)

• kinaza kinazy fosforylującej MAPK (MAPKKK), dla białka Ras będzie to Raf-1

• kinaza fosforylująca MAPK (MAPKK) - białka Mek-1 i Mek-2

• kinaza MAP (MAPK) - białka Erk-1 i Erk-2

• przejście MAPK do jądra i aktywacja czynników transkrypcyjnych

GTPaza	Ras	Rac-1	Różne białka
Czynnik wymiany	Sos	Vav	-
MAPKKK	Kinaza Raf-1	Białko MKK1	ASK1, TAK1, DLK
MAPKK	Białko Mek-1, Mek-2	MKK4, MKK7	MKK3, MKK4, MKK6
MAPK	Białko Erk-1, Erk-2	SAPK/JNK	Kinaza p38

Funkcję hamującą ma białko Cbl, które w spoczynkowych limfocytach pozostaje związane z Grb2, zapobiegając ewentualnej aktywacji szlaku Ras. Ufosforylowana Cbl oddysocjowuje od Grb2, może ona wówczas:

• związać białko Vav, zahamować jego interakcję z SLP-76 i polimeryzację aktyny

• przyłączyć kinazę Raf-1, uniemożliwiając przepływ sygnału z białka Ras

• przyłączyć aktywną formę ZAP-70 i uwrażliwić ją na degradację przez proteasomy

Innym mechanizmem chroniącym organizm przed nadmierną mobilizacją komórek immunologicznie kompetentnych jest zjawisko zmniejszania się aktywności kinaz tyrozynowych wraz z przedłużającą się stymulacją.

Cząsteczkami powierzchniowymi wpływającymi na proces aktywacji limfocytów B są:

• cząsteczki CD40, dla których ligandem jest cząsteczka CD40L (CD154) obecna na limfocytach T. Aktywacja limfocytów B przez CD40 prowadzi do zwiększonej ekspresji na ich powierzchni cząsteczek Fas. Czyni to limfocyty B podatnymi na apoptozę indukowaną przez FasL obecny na powierzchni aktywnych limfocytów T

• cząsteczki CD19, których ekspresja zanika po przekształceniu się limfocytu B w komórkę plazmatyczną - jednoczesne związanie CD19 i BCR obniża próg aktywacji limfocytu 100-krotnie

19 - Mechanizmy cytotoksyczności limfocytów

Mechanizmy cytotoksyczności komórkowej odgrywają główną rolę w odpowiedzi przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, w mniejszym stopniu również przeciwko komórkom nowotworowym oraz komórkom przeszczepu allogenicznego.

Komórkami zdolnymi do wywierania efektu cytotoksycznego są:

• nieswoiste: makrofagi i granulocyty (wydzielające wolne rodniki, enzymy czy cytokiny np. TNF)

• swoiste: limfocyty (limfocyty T, komórki NK, komórki K) → niszczą komórki indukując w nich szlaki prowadzące do apoptozy.

Dwa podstawowe mechanizmy cytotoksyczności komórkowej to:

• mechanizm związany z uwolnieniem ziaren cytolitycznych

• główny mechanizm niszczenia komórek; posługują się nim limfocyty TCRαβ, -γδ oraz NK i K

• etapami w tym mechanizmie są:

• rozpoznanie i związanie komórki docelowej

• koniugacja poprzez cząsteczki adhezyjne: LFA-1 - ICAM-1, LFA-2 - LFA-3 oraz C28-B7; nie zachodzi przy braku Ca²⁺ i Mg²⁺

• stymulacja przez swoisty sygnał TCR (limfocyty T) lub CD16 (komórki NK)

• aktywacja komórki docelowej i uwolnienie czynnikow cytotoksycznych

• polaryzacja - maksymalne zwiększenie kontaktu z komórką docelową z jednoczesnym przemieszczeniem centrioli, aparatu Golgiego i ziaren cytoplazmatycznych do bieguna

• decydujacą rolę w polaryzacji ziaren cytolitycznych odpowiednio wysokie stężenie jonów wapnia; do degranulacji dochodzi po aktywacji za pośrednictwem TCR

• recyrkulacja limfocytów cytotoksycznych

• zdolność do zabicie nastepnej komórki docelowej wymaga pewnego okresu refrakcji, niezbędnego do syntezy zużytych czynników cytotoksycznych i odtworzenia ziaren

• wykorzystywane czynniki cytotoksyczne:

• perforyna - bardzo przypomina składnik C9 dopełniacza, po wbudowaniu polimeryzuje tworząc pory w błonie komórkowej (posrednio indukuje apoptozę - do komórki wnikają jony wapnia, które aktywują endonukleazy i inne enzymy)

• wbudowanie i proces polimeryzacji jest zależny od Ca²⁺ lub Sr²⁺ → w ziarnach występuje w formie nieaktywnej, globularnej - wapń jest niezbedny do zmiany konformacji (spontanicznemu tworzeniu kanałów w błonach ziaren zapobiega towarzysząca perforynie kalretikulina - białko wiążące wapń)

• ekspresji perforyny indukowana jest przez IL-2, -4, -7, -12 i G-SCF; hamowana natomiast przez TGF-β, która jest cytokiną immunosupresyjną

• granzymy (fragmentyny)

• są to proteazy serynowe prowadzące proteolizę białek cytoplazmatycznych i jądrowych (trawiąc białka chromatyny ulatwiają endonukleazom dostęp do nici DNA)

• u człowieka wyróżniamy granzymy:

• A (1) - tryptaza; wiąże się z białkami macierzy jądrowej, rozkłada histony

• B (2) - Asp-aza; trawi niektóre prokaspazy, aktywując je i indukując apoptozę; ponadto granzym aktywuje białko Bid będące proapoptycznym bialkiem z rodziny Bcl-2: białko Bid inicjuje szlak związany z mitochondriami, który może być hamowany przez białko Bcl-2

• K (3) - tryptaza

• H - chymaza

• M - Met-aza

• białko p40-TIA-1 (T-cell-Intracellular-Antigen-1) - uczcestniczy w degradacji kwasów nukleinowych w komórce docelowej

• granzulina

• należy do sapozyn (białek wiążących lipidy)

• liza błon komórkowych; niszczy błony mitochondrialne i aktywuje kaspazę 9

• mechanzim związany z aktywacją receptorów dla cząsteczek nadrodziny TNF na komórkach docelowych

• po rozpoznaniu komórki docelowej przez limfocyt T dochodzi do interakcji cytotoksycznych ligandów obecnych na błonie limfocytu ze swoistymi receptorami na komórce docelowej:

• CD95L-CD95, czyli: Apo-1L/FasL działające przez Apo-1/Fas (w tym mechanizmie działają głównie limfocyty T_c CD4⁺, znacznie rzadziej limfocyty T_c CD8⁺)

• ekspresja FasL na limfocycie indukowana jest przez TCR oraz IL-2, -12 i IFN-γ

• ekspresja Fas na komórce docelowej wzmagana jest przez TNF i IFN-γ

• TNF działający przez TNFR1

• TRAIL działający przez receptory DR4 i DR5

• w sytuacji gdy cytotoksyczne ligandy mogą być wydzielane do środowiska - wiązanie komórki docelowej ie jest konieczne, wtedy jednak efekt cytotoksyczny nie jest swoisty → wszystkie powyższe mogą występować w formie związanej z błona lub w formie rozpuszczalnej; dodatkowo tylko w formie rozpuszczalnej występuje LT-α (działa na receptor TNFR1)

Apoptoza

• mechanizm ziaren

• granzym B oraz kaspazy inicjatorowe (kaspaza 1, 8, 9, 10) bezpośrednio aktywują kaspazy efektorowe (np. kaspaza 3 i 7)

• granzulina aktywuje kaspazę inicjatorową (kaspazę 9)

• mechanizm receptorow

• dochodzi do aktywacji co najmniej dwóch kaspaz inicjatorowych (2 i 8)

Szlaki obu mechanizmów, zanim się spotkaja na etapie kaspaz efektorowych są zupełnie odmienne i podlegają innej regulacji, np. regulacja apoptozy przez białka Bcl-2 i Bcl-x_L, których ekspresja chroni przed apoptozą przez CD95, nie chroni przed śmiercia indukowaną przez granzymy.

---