Wykład IV - 22.11.2011

PARP - poli(ADP-rybozo) polimeraza

• BER - XRCC1, DNA ligaza III, polimeraza ε DNA, polimeraza β DNA

• Mysie mutanty Parp-1 - żyją, ale są bardzo wrażliwe na czynniki alkilujące i promieniowanie jonizujące, a paradoksalnie są odporne na różne patofizjologiczne zjawiska, jak np. sceptyczny szok lipopolisacharydowy

Inhibitory PARP - mechanizm działania

• Brak prawidłowego działania podczas naprawy pojedynczych pęknięć BER prowadzi do ich nagromadzenia się;

• SSB DSB (podczas replikacji zapadnięte widełki replikacyjne generują powstanie podwójnych pęknięć DNA (DSB) z SSB;

• DSB są naprawiane przez rekombinację homologiczną, ale w komórkach niezdolnych do jej przeprowadzenia inhibicja PARP w konsekwencji prowadzi do fragmentacji DNA i śmierci komórki;

• Choroby związane z HR.
  

Choroba	Gen
AT (ataksja teleangiektazja)	ATM
NB1 (zespół łamliwego Nijmegen)	NBS1
ATLD (zespół podobny do AT)	MRE11
Anemia Fanconiego Grupa D1	BRCA2
Grupa O	RAD51C
Nowotwory piersi	Heterozygoty dla BRCA1 Heterozygoty dla BRCA2

Inhibitory PARP w leczeniu raka u pacjentów z mutacjami BRCA

• Mechanizm cytotoksyczności indukowanej inhibitorami PARP - potwierdzenie w badaniach klinicznych;

• Wiele innych białek uczestniczy w naprawie DSB - szersza możliwość zastosowania inhibitorów PARP (nie tylko z mutacjami BRCA);

• Iniparib - pierwszy inhibitor PARP zakwalifikowany do III fazy badań klinicznych u kobiet z potrójnie negatywnym rakiem piersi (w kombinacji z gemcytabiną i karboplatyną).

Fenotyp komórek z niesprawnym systemem HR

• Niestabilny genom;

• Podwyższona wrażliwość na związki sieciujące DNA (mitomycyna C, cisplatyna) i promieniowanie jonizujące;

• Nieprawidłowa kontrola cyklu komórkowego.

Mechanizmy naprawy DSB

• Homologiczna rekombinacja (HR) - S, G₂

• Niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) - G0, G₁, S, G₂

• Pojedyncze wydłużanie końców (SSA) - poboczne.

Główne białka NHEJ

• Ku70/Ku80 (zidentyfikowane w surowicy pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi) jeśli zwiążą się z DNA to są sygnałem dla innych białek do wiązania, po związaniu się przyłącza się podjednostka katalityczna PKcs;

• DNA-PKcs (PI(3)K family)/Artemis (autofosforylacja, fosforylacja Artemis i polimeraz DNA);

• XRCCH/Ligaza 4 (stabilizuje aktywność ligazy IV);

• Cernunnos (XLF), stabilizacja.

Regulacja Białka Artemis (aktywność egzonukleazy) w NHEJ

• Autofosforylacja DNA - PKcs (rekrutuje Artemis do miejsc występowania DSB);

• Zmiany konformacyjne Artemis;

• Fosforylacja Artemis przez DNA - zmiana konformacji Artemis, powstawanie aktywnej formy Artemis, przygotowanie końców DNA do ligacji przez LIGU.

Artemis jako „downstream” - czynnik w ścieżce sygnalizacyjnej ATM

• ATM fosforyluje Ser 645 w Artemis w odpowiedzi na uszkodzenia DNA;

• Ufosforylowany Artemis fizycznie łączy się z kompleksem MRE11/Rod50/Nbs1 i uczestniczy w regulacji progresji cyklu komórkowego.

Rola NHEJ

• Naprawa DSB indukowanych przez IR;

• V(D)J - rekombinacja synteza przeciwciał;

• Utrzymanie telomerów;

• V(D)J powstawanie funkcjonalnych genów kodujących fragmenty zmienne łańcuchów immunoglobulin oraz receptorów komórek T (TCR);

• DSB wprowadzone w segmentach genowych - występuje w wielu kopiach, funkcjonalny gen : po 1 kopii segmentu VDJ:

• zmienne V (variable);

• różnorodne D (diversity);

• łącznikowe J (joining).

SCID (ciężki złożony niedobór odporności)

• defektywna rekombinacja V(D)J - uszkodzenia w powstaniu genów przeciwciał i receptorów komórek T niefunkcjonalne limfocyty T i B, komórki NK;

• defektywna naprawa DSB dodatkowa wrażliwość na promieniowanie jonizujące;

• częstość występowania SCID - 1: 500 000;

• zablokowanie rozwoju komórek T (kliniczny fenotyp);

• brak lub obecność funkcjonalnych komórek B i NK (immunologiczna klasyfikacja) śmierć w ciągu pierwszego roku życia, spowodowana niedoborami immunologicznymi;

• nie zidentyfikowano jeszcze pacjentów z mutacją w genach Ku70/Ku80;

• Artemis, DNA-PKcs - pacjenci zmutowani;

• Pacjenci Artemis - radiowrażliwość, fenotyp SCID (B-, T-);

• Pacjenci LIGV - radiowrażliwość, fenotyp SCID;

• Cernunnos - radiowrażliwość, opóźnienie wzrostu, małogłowie, dysmorfizm twarzy, SCID fenotyp (B -, T);

• DAA-RKW - radiowrażliwość (B-, T-).

NHEJ - utrzymanie telomerów

• Telomery 5-15 kb (TTAGGG)_n , połączonych białkami TBP

• Telomeraza

• Odwrotna transkryptaza (hTERT)

• Nić matrycy do syntezy telomeru (hTERC/hTR)

• Aktywna w komórkach macierzystych i embrionowych

• Brak w komórkach macierzystych (oprócz komórek krypt jelitowych)

• Aktywna u 90% noworodków

• Telomeraza musi dodawać nukleotydy bez obróbki primerów DNA

• Każda telomeraza zwraca nukleotydy RNA komplementarne do sekwencji telomerów

Ku70/80 i DNA-PKcs w telomarach

• Nie wpływają na aktywność telomerazy

• Utrzymywanie telomerów , wzrost fuzji telomerów

Kompleks MRN - poprzez TRF 2

Ligase N, XRCC4 - mutanty śmiertelne, nie da się otrzymać nokautu, resztę da się otrzymać

Mysie modele z uszkodzonym NHEJ

• Karłowatość, przedwczesne starzenie (Ku mutants)

• Zwiększona niestabilność genetyczna

• Fenotyp SCID

• Nadwrażliwość na promieniowanie jonizujące

• Nowotwory: chłoniaki, mięsaki

SSA (single strand annealing) -mechanizm naprawy DSB




BER

Naprawa uszkodzeń DNA przez wycinanie zasad

• Modyfikowane zasady, podobne pod względem kształtu i wielkości do zasad prawidłowych, powstających w procesach

• Oksydacji (8-okso-G)

• Deaminacji (uracyl)

• Alkilacji (3-metyloadenina)

• Depurynacji i depirymidacji (AP miejsca)

• Niektóre białka BER, np. XRCC1 biorą udział w naprawie SSB

Klasyfikacja pod względem mechanizmu reakcji

1. Modyfikacyjne (wycinają zasadę i pozostawiają miejsce AP, np. UNG - glikozylaza uracylu, szybka liczba obrotów, usuwanie 1000 uracyli/min.);

2. Dwufunkcyjne (wycinają zasadę i przecinają nić DNA.

Klasyfikacja pod kątem substratowej specyficzności

1. Glikozylazy alkilowanych zasad (ALKA, ANPC1)

2. Glikozylazy utlenowanych puryn (Fpg, DGG1)

3. Glikozylazy utlenionych pirymidyn (Nth, NEIL)

4. Glikozylazy źle sparowanych zasad (MutYH, TDG)

• Pojedyncza glikozylaza może rozpoznawać więcej niż 1 typ uszkodzenia;

• Specyficzna modyfikacja może być rozpoznawana przez więcej niż 1 glikozylazę;

• Glikozylaza DNA (MPG) wyciąga uszkodzoną zasadę do kieszeni mieszczącej centrum aktywne.

Mechanizm BER

APE1 (S' SSB) - zahamowanie wrażliwość na IR i związki alkilujące
PARP
„krótka ścieżka” - włączenie krótkiego nukleotydu po usunięciu uszkodzonej zasady dodawany jest tylko jeden nukleotyd, ten którego brakuje
„długa ścieżka” - włączenie 2-6 nukleotydów

Białko XRCC1 stabilizuje cały proces, jak również PARP1

Niektóre polimorfizmy genów naprawy DNA systemu BER

Gen	Zmiana genetyczna	Choroba
XRCC1	Arg 289His Arg 299Cys	Rak piersi
MYH	Gly328Asp (obniżają aktywność glikozylazy)	Rak jelita grubego Rak okrężnicy
APE1	Unknown	Rak piersi
OGG1	Arg154His	Rak trzustki

Rola BER na poziomie organizmu

• Prezentacja w rozwoju nowotworów

• Związany z przedwczesnym starzeniem się organizmu

Systemy naprawy DNA

• Przez wycinanie

• Zasad (addukty o niewielkim rozmiarze) BER

• Nukleotydów (duże addukty znacznie zaburzające strukturę DNA) NER

NER

Rozpoznaje uszkodzenia DNA, powodujące zmianę kształtu helisy DNA; indukowane przez różne czynniki

• Promieniowanie słoneczne: CPD (6-4)PP

• Niektóre uszkodzenia oksydacyjne : cyklopuryny

• Czynniki środowiskowe - wielkopierścieniowe węglowodory aromatyczne (dym papierosowy), aminy aromatyczne, aflatoksyny addukty DNA „bulky adducts” - wiązanie kowalencyjne do DNA

• UV

• UVC - 245 - 280 nm (pochłaniane przez warstwę ozonową atmosfery)

• UVB - 280 - 320 nm ( 5% promieniowania: wit D; rumień skóry nowotwory)

• UVA - 320 - 400 nm (95% promieniowania; uszkodzone włókna kolagenowe zaćma, nie powodują rumienia skóry, starzenie skóry, nowotwory)

• Główne typy uszkodzeń UV:

• CPD - szybka naprawa

• 6-4 fotoprodukty - wolna naprawa