PRZEDMIOT: MIKROBIOLOGIA I IMMUNOLOGIA

KIERUNEK: KOSMETOLOGIA

ROK AKADEMICKI 2008/2009

ĆWICZENIE I i II

Temat: Morfologia komórek biorących udział w odpowiedzi immunologicznej - omówienie i ćwiczenie praktyczne. Teoretyczne podstawy metod izolacji komórek układu odpornościowego: metody oparte o gradient gęstości i sortowanie magnetyczne

Układ immunologiczny, podobnie jak nerwowy rozprzestrzeniony jest w całym organizmie. Pełni on bardzo ważną funkcję w utrzymaniu homeostazy, zwalczając zakażenia wirusowe, bakteryjne i pasożytnicze oraz chroniąc przed rozwojem chorób nowotworowych.

W poszczególne rodzaje odpowiedzi immunologicznej zaangażowane są różne komórki. Należą do nich komórki jądrzaste (bazocyty, eozynocyty, monocyty, neutrocyty) dla których krew jest głównym ośrodkiem transportu ze szpiku do tkanek, a także komórki wielokrotnie wywędrowujące z naczyń krwionośnych i wracające do krwi (recyrkulujące) do których zaliczamy limfocyty. Odrębną grupę stanowią komórki, dla których podstawowym umiejscowieniem są tkanki, tzn. plazmocyty.

Oceny morfologicznej tych komórek dokonuje się w rozmazach krwi w powiększeniu immersyjnym mikroskopu świetlnego. Rozmaz krwi wykonuje się na szkiełku podstawowym. Powinien on być cienki i węższy od szkiełka podstawowego. W czasie wykonywania rozmazu należy tak postępować, aby nie uszkodzić komórek, dlatego też krew ciągnie się za szkiełkiem wykonującym rozmaz. Nawet nieznaczny uraz mechaniczny komórki powoduje oderwanie cytoplazmy, zwłaszcza w limfocytach, rozpuszczenie się jej w otaczającym osoczu lub powstanie odprysku komórki, który może imitować np. krwinki płytkowe.

W Polsce podstawowym barwieniem rozmazu krwi jest metoda panoptyczna z wykorzystaniem barwnika Maya-Grünwalda-Giemsy, nazywana w skrócie MGG. Utrwalaczem w metodzie MGG jest alkohol metylowy stosowany w postaci czystej lub w nie rozcieńczonym odczynniku Maya i Grünwalda. Barwnikami wchodzącymi w reakcję z komórkami w metodzie MGG są: kwaśny barwnik - eozyna, zasadowy barwnik - błękit metylenowy oraz azur II.

Do badań w zakresie immunologii źródłem komórek immunologicznych może być krew obwodowa lub centralne i obwodowe narządy limfatyczne.

Najprostszą metodą izolacji leukocytów krwi obwodowej jest sedymentacja spontaniczna krwi z antykoagulantem lub indukowana przez dodatek substancji o dużej lepkości, takich jak roztwory dekstranu wielkocząsteczkowego, metylocelulozy. Erytrocyty opłaszczone cząsteczkami tych substancji szybciej sedymentują, a w nadsączu znajdują się lżejsze leukocyty.

Często stosowane są metody fizykochemiczne polegające na wirowaniu krwi heparynowej w gradiencie gęstości Ficoll-Isopaque. W probówce wirówkowej na warstwę gradientu nawarstwia się pełną krew. Probówkę wiruje się w temperaturze pokojowej. Limfocyty i monocyty zatrzymywane są na powierzchni warstwy gradientu, a erytrocyty i granulocyty opadają na dno (Rys 1.).

Rys.1 Wirowanie krwi w gradiencie gęstości

Komórki układu immunologicznego można izolować również z zastosowaniem kulek paramagnetycznych. Zawiesinę komórek inkubuje się z kuleczkami magnetycznymi opłaszczonymi przeciwciałem skierowanym przeciw powierzchniowym antygenom komórek, których chcemy się pozbyć z zawiesiny np. stosując przeciwciała antyneutrofilowe dla populacji zawierającej neutrofile i eozynofile. Następnie mieszaninę nanosi się do kolumienki i działa na nią magnesem. Zatrzymane w ten sposób w kolumnie komórki odzyskuje się działając na kuleczki połączone z komórkami buforem o odpowiednim pH i sile jonowej.

Morfologia komórek w rozmazie krwi barwionym metodą MGG.

Eozynocyty (granulocyty kwasochłonne, eozynofile)

Są komórkami o średnicy ok. 12-16 μm, z jądrem segmentowanym, często dwupłatowym. Cytoplazma ma barwę różową, czasem o odcieniu niebieskawym, na ogół jest niewidoczna spod zakrywających ją ziarnistości. W cytoplazmie występują swoiste ziarnistości kwasochłonne, nazywane również eozynofilnymi (ponieważ barwią się eozyną), okrągłe, duże, o średnicy ok. 0.6-1.2 μm. Czasami pojedyncze ziarna leżą na jądrze. Barwią się w różnych odcieniach czerwieni, od ceglastoczerwonego do brunatnego. Mogą tworzyć litą, brunatną masę, w której nie można odróżnić poszczególnych ziarnistości.

Funkcje eozynocytów:

- udział w procesach immunologicznych i w odczynach uczuleniowych, m. in. przez fagocytowanie kompleksów antygen-przeciwciało i różnych obcych białek,

- hamowanie działania serotoniny,

- unieczynianie histaminy,

- fagocytoza niektórych grzybów oraz niektórych bakterii.

Bazocyty (granulocyty zasadochłonne, bazofile)

Mają średnicę ok. 10-16 μm. Jądro ma na ogół niewyraźną strukturę i różne kształty - wielopłatu, liścia koniczyny. Granice jądra mogą być niewidoczne. Często jądro zakrywają ziarnistości, cytoplazma jest różowo-fioletowa. W cytoplazmie występują swoiste ziarnistości o różnym kształcie i różnej wielkości: ok. 0.8-1.2 μm. Ziarnistości barwią się w różnych odcieniach fioletu z poświatą czerwoną. Ziarnistości na ogół są rozmieszczone równomiernie, ale luźno w całej cytoplazmie.

W szpiku znajdują się również bazocyty tkankowe, nazywane komórkami tucznymi. Czynności bazocytów nie są w pełni poznane. Uczestniczą m.in. w procesach immunologicznych.

Neutrocyty (granulocyty obojętnochłonne, neutrofile)

segmentowane

Średnica neutrocytów wynosi ok. 12-15 μm. Jądro składa się z 2-5 płatów, czyli segmentów. Poszczególne segmenty jądra są połączone mostkami chromatyny różnej grubości, czasami tak cienkimi, że są niewidoczne w mikroskopie świetlnym. Chromatyna jądrowa jest znacznie zagęszczona, cytoplazma szaroróżowa zawiera kilkaset swoistych ziarnistości. Są to ziarna drobne, o niejednakowej wielkości, o zabarwieniu różowawym. Ziarnistości nie zakrywają cytoplazmy, niekiedy są prawie niewidoczne. Równocześnie w komórkach występują ziarnistości azurochłonne, które są nieco większe, różnej wielkości, fioletowe.

Neutrocyty z jądrem pałeczkowatym

Są to komórki, w których jądro nie jest podzielone na płaty i przyjmuje kształt, często zniekształconych liter C, S, L, U. Niekiedy zakończenia jądra łączą się, przyjmując kształt litery O albo nawet zachodzą na siebie.

Funkcje neutrocytów:

- czynność wydzielnicza: uwalnianie β-glukuronidazy, transkobalaminy, hialuronidazy,

- udział w hemostazie,

- udział w obronie przed drobnoustrojami (odporność nieswoista) oraz w niszczeniu obcych białek i komórek.

Limfocyty

Średnica limfocytów jest różna, od 9-12 μm. Jądro jest okrągłe lub owalne, rzadziej z zatokowym wpukleniem. Cytoplazma jest niebieskawa, czasami zbliżona do białej i otacza jądro dość wąskim rąbkiem, szerszym w większych limfocytach. W około 10-20% limfocytach występuje w cytoplazmie ziarnistość - czerwonofioletowa, błyszcząca, dość gruba, o ostrych, nieregularnych granicach i niejednakowej wielkości. Ziarna są często otoczone aureolą, tj. pierścieniem rozjaśnionej cytoplazmy. Niekiedy wśród limfocytów występują takie, które nie posiadają rąbka cytoplazmy, tzw. limfocyty nagojądrzaste. U około 15% zdrowej populacji ludzkiej występują limfocyty większe, o średnicy nawet do 25 μm, z dużym jądrem o kształcie nerki. Duże limfocyty, z jądrem o nierównych granicach, z kilkoma wpukleniami, nazywane limfocytami riederowskimi.

Różnice wielkości i struktury limfocytów są prawdopodobnie związane z ich stanem czynnościowym. Małe limfocyty są przypuszczalnie komórkami spoczynkowymi, a duże - naturalnymi komórkami cytotoksycznymi (NK).

Limfocyty to komórki wytwarzane przez szpik i układ chłonny.

Funkcje limfocytów:

- Limfocyty B (grasiczoniezależne) - odpowiedzialne za reakcje typu humoralnego, uwarunkowana obecnością przeciwciał. Są główną linią obrony przeciw bakteriom rozmnażającym się pozakomórkowo oraz przeciw krążącym antygenom.

- Limfocyty T (grasiczozależne) - uczestniczą głównie w reakcjach immunologicznych typu komórkowego, w reakcjach autoimmunologicznych, w reakcji odrzucenia przeszczepu.

- Komórki „null” (zerowe), nie-B i nie-T, nie mające znaczników dojrzałych limfocytów:

- Komórki NK (natural killer) - ukierunkowane głównie przeciwko wirusom i komórkom nowotworowym; ich cytotoksycznośc ujawnia się już w ciągu pierwszych minut kontaktu z komórkami nowotworowymi; działają bez uprzedniego kontaktu z antygenem, stąd nazwa: naturalny zabójca.

- Komórki NC (naturalne komórki cytotoksyczne) - również ukierunkowane głównie przeciwko wirusom i komórkom nowotworowym.

- Komórki NS (naturalne komórki supresorowe) - obecne w płodowych i noworodkowych narządach limfatycznych, a u dorosłych w szpiku i śledzionie osobników poddanych silnej immunosupresji, np. promieniowaniem jonizującym.

Monocyty

W rozmazach krwi są to największe komórki o średnicy ok. 16-20 μm, często o nieregularnych kształtach, niekiedy okrągłe. Jądro monocytów rzadko jest okrągłe lub owalne, posiada na ogół zatokowe wpuklenie, czasami z dwoma lub więcej zatokami, często przybiera nieregularne kształty, przypominające litery C, E, L, U.

Cytoplazma monocytów jest niebieskawa o odcieniu szarym i zawiera jasnofioletowe ziarnistości azurochłonne. Część ziarnistości odpowiada lizosomom.

W tkankach monocyty przekształcają się przede wszystkim w makrofagi, gdzie występują jako makrofagi stacjonarne lub wolne.

Funkcje monocytów:

- fagocytoza: bakterii, krwinek czerwonych, resztek komórkowych, grzybów, niektórych białek, przeciwciał,

- czynność wydzielnicza: lizozymu, interferonu,

- udział w procesach reparacyjnych uszkodzonych tkanek,

- czynności transportowe, np. transport żelaza.

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

1. Dokonać oceny morfologicznej komórek układu immunologicznego oraz narysować obraz uwzględniając kolorystykę poszczególnych organelli komórkowych.

1

---