Wykład 5

• Naprawa przez wycinanie nukleotydów(NER)

NER rozpoznaje uszkodzenia DNA powodujące zmianę kształtu helisy DNA indukowane przez różne czynniki:

• Promieniowanie słoneczne: CPD, (6-4)PP

• Niektóre uszkodzenia oksydacyjne: cyklop uryny

• Naprawa wiązań krzyżowych

• Czynniki środowiskowe: wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (dym papierosowy, spaliny), aminy aromatyczne, alfatoksyny -> „bulky adducts”,

• Naprawa wiązań krzyżowych DNA.

Naprawa uszkodzeń DNA - fotoliazy. Fotoliazy rozdzielają dimery pirymirynowe (CPD) lub (6-4)fotoprodukty [(6-4)PP] . Po zaabsorbowaniu światła przenoszą energię powodując rozerwanie wiązań. Struktura DNA jest przerwana.

• (6-4)liazy - u Drosophila, grzybów, roślin

• CPDliazy - tylko u torbaczy(ssaki)

• Efekty uszkodzenia NER u człowieka

Zwiększona wrażliwość na promieniowanie słoneczne mutantów

• Xeroderma pigmentosum(XP)

• Wrażliwość na promieniowanie;

• Poważne przebarwienia skóry później związane z nowotworami;

• Katarakty;

• Skóra sucha, atroficzna, piegowata;

• Do 1000x zwiększona częstość raka skóry;

• W ciężkich przypadkach zaburzenia neurologiczne;

• Dziedziczenie autosomalne recesywne;

• Częstość występowania 1/250 000 lub 1/200 000

• Przyczyna: mutacje w genach kodujących białka zaangażowane w NER, TLS (tranlesion DNA synthesis);

• 20% chorych - progresywne zaburzenia neurologiczne (neurodegeneracja)

• Geny: XPA, XPB, …, XPG (NER) RAD30A(TLS) (DNA polymerase eta)

• Postępowanie z chorymi:

• Rygorystyczna ochrona przed słońcem

• Regularne interwencje dermatlogiczne

• Prewencja: Doutnie podawane retinoidy

• Pierwsi opisani chorzy 1968

Lata 80 - zidentyfikowanie genów ERCC, ERCC1- 1984

Lata 90 - odkrycie, że XP-D/ERCC2 oraz XP-B/ERCC3 związane są z procesem transkrypcji

• UDS-test - test, który sprawdza działanie NER

• Metoda rozpoznania: Niezaplanowana synteza DNA-UDS test (faza S, wbudowanie czegoś tam O_o);

• Grupa komplementacyjna;

• 8 genów jest odpowiedzialnych za rozwój tej choroby.

• NER:

• Rozpoznanie DNA

• Wycinanie ok. 30 nukleotydów, miedzy którymi jest uszkodzenie, nacięcie po obu stronach uszkodzenia (tylko jedna nić),

• reperacyjna synteza DNA polimerazą

• połączenie nici przez ligazę

Bakterie: UVRA i UVRB - odpowiedzialne za rozpoznanie

UVRC - nacina nić(ok. 13 nukleotydów)

Ssaki: TFIIH czynnik transkrypcyjny (ok. 10 białek)

W nim XP-B i XP-D - ATP-zależne helikazy DNA, odpowiedzialne za rozplecenie nici w miejscu uszkodzenia

Nacięcie nici XP-G i XP-F(najpierw po stronie 3' potem po stronie 5')

Przyłączenie PCNA i polimerazy eta i delta(wysokiej wierności)

Szlak wolny(GGR) Szlak szybki(TCR)

Nowotwory, Xeroderma pigmentosum Choroby związane ze starzeniem i choroby degeneracyjne(syndrom Cockeyna)

• GGR(Global Genom Repair)

Rozpoznanie XPC-hHR23B(wiąże się do miejsc, gdy nie ma prawidłowej struktury

Białko wiąże się do nici naprzeciw uszkodzenia

Białka pomocnicze: DDB1 i DDB2(produkt genu XPE)

Potwierdzenie obecności uszkodzenia

Wiązanie czynnika TFIIH(helikazy B i D)

XPC jest białkiem nadrzędnym(mutacja=brak naprawy)

Sygnał mówiący o obecności uszkodzenia - zatrzymanie widełek replikacyjnych

• TCR(Transcription Coupled Repair)

CSA i CSB związane z uszkodzeniem - aktywuje TFIIH

• Oba szlaki:

XPA - potwierdzenie uszkodzenia(RPA wiąże się do ssDNA)

Związane z TDR i GGR

Nacięcie nukleazami

Polimerazy eta i delta

• Grupy komplementacyjne

XPA/RPA - wiąże uszkodzenia DNA z 1000krotną preferencją

XPB - helikaza 3'->5'

XPC - hHR23B

XPD - helikaza 5'-3' dkłądnik TFIIH

XPE - wiąże białka z 500 000krotną preferencją

XPF/ERCC1 - endonukleza dla strony 5' od uszkodzenia

XPG - endonukleaza dla strony 3' od uszkodzenia

XPV - polimeraza eta

• Źródło objawów klinicznych

• 
  
  
  
  
  
  Reparacja uszkodzeń UV Transkrypcja Reparacja uszkodzeń oksydacyjnych nowotwory skóry łamliwe włosy przedwczesne starzenie pigmentacja paznokcie fotofobia anemia klasyczne XP klasyczne TTD

• Trichotiodystrofia (TTD) choroba transkrypcyjna

Mutacja w TTDA(białko p8) XPB i/lub XPD

Fenotyp:

• Krótkie łamliwe włosy i paznokcie(brak białek z cysteiną);

• Brak predyspozycji do nowotworu;

• Łuskowata skóra;

• Wrażliwość na UV(ale nie tak duża jak w Xeroderma pigmentosum);

• Zaburzenia rozwoju (niedorozwój fizyczny i psychiczny).

• Cockayne Syndrome(CS)

Geny: CSA, CSB, XPB, XPD, XPG

5 grup komplementacyjnych

Fenotyp:

• Upośledzenie wzroku (katarakty, progresywna retinopatia);

• Zaburzenia rozwoju;

• Upośledzenie wzrostu;

• Wrażliwość na UV (ale nie tak ektremalna jak przy Xeroderma pigmentosum);

• Brak predyspozycji do nowotworów;

• Średnia długość życia 12,5 roku.

• TCR

Dwa pierwsze białka, gdy zatrzymują się widełki replikacyjne - zaburzenia indukują apoptozę

• Zespół mieszany XP-CS

Geny: XPB, XPD, XPG(XPCS)

XPD, XPG, CSB(COFS)

COFS - zmiany mózgowo-oczno-twarzowo-szkieletowe(inny syndrom), anomalie narządowe (podkowiaste nerki)

• Naprawa wiązań krzyżowych - szlak anemii Fanconiego, jako jeden z głównych mechanizmów naprawy tych uszkodzeń

Brak naprawy wiązań krzyżowych może prowadzić do śmierci komórki

Rodzaje związków alkilujących:

• Monofunkcyjne z jedną grupą reaktywną(indukują uszkodzenia zasad lub jednonicniowe primery)

• Dwufunkcyjne z dwiema grupami reaktywnymi(mogą tworzyć wiązania krzyżowe)

• Mustrzardany azotowe

• Związki platyny

• Azyrydyny

• Nitrozomoczniki

• Siarczyny alkilowe

• Cis-platyna jeden z najlepszych leków na nowotwory wprowadza uszkodzenia DNA-DNA i DNA-białko. Może tworzyć wiązania wewnątrz i międzyniciowe(ICLs)

Może tworzyć monoaddukty lub wiązania krzyżowe DNA-białko.

• Naprawa międzyniciowych wiązań krzyżowych DNA (ICLs):

• Szlak anemii Fanconiego

• Rekombinacja Homologiczna

• NER (naprawa przez wycinanie nukleotydów)

• TLS (synteza DNA z ominięciem uszkodzenia)

• MMR(naprawa nieprawidłowo sparowanych zasad)

• Niedokrwistość Fanconiego

• Recesywna autosomalna

• 1/300 nosiciele

• 1-5/mln urodzeń

• >1300 osób na całym świecie

• Objawy kliniczne:

• Nieprawidłowości rozwojowe - małogłowie, deformacje kości dłoni i przedramienia, przebarwienia skóry „cafe au lait”, niedobory pigmentacji;

• Postępujące uszkodzenia szpiku kostnego - pancytopenia (5-10 rok życia), anemia aplastyczna, mielodysplazja;

• Anomalie płciowe - niedorozwój gonad, zaburzenia spermatogenezy, przedwczesna menopauza;

• Wady nerek, serca, podwojone moczowody;

• Niestabilność genomowa (spontaniczne aberracje chromosomowe);

• Predyspozycje do nowotworów (AML, rak płasko komórkowy, guzy lite);

• Niestabilność chromosomalna:

• Złamania chromatyd;

• Hiperrekombinacja;

• Wieloramienne struktury chromosomów.

• Jedyna metoda leczenia - przeszczep szpiku kostnego! - możliwość późniejszego rozwoju guzów litych.

• Niedokrwistość Fanconiego na poziomie komórkowym:

• Nadwrażliwość na środki sieciujące DNA(MMC, DEB)

• Podwyższony poziom aberracji chromosomowych(test diagnostycznych)

• Zaburzenia punktu kontrolnego fazy S

• Wydłużona faza G₂

• 16 grup komplementacyjnych anemii Fanconiego: A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M, N, O, P+Q;

• Częstość występowania grup komplementacyjnych:

• 65% A;

• 10% C;

• 8% G;

• 24% pozostałe grupy.

• Fuzja komórek (test):

• Nie ma zmiany wrażliwości po fuzji;

• Nie ma komplementacji;

• Mamy pewność, że jest to jedna grupa komplementacyjna;

• Jeśli po fuzji jest komplementacja(zmiana wrażliwości) to różne mutacji.

• Rys historyczny

• 1985r odkrycie dwóch grup komplementacyjnych;

• 1992r FANCC sklonowany gen;

• 2002r FANCD1 = BRCA2;

• Heterozygota FANCD1/RCA2+/- nowotwory sutka i jajnika;

• Homozygota FANCD1-/-anemia Fanconiego

• FANCA, B, C, D, E, F, G, L, M - kompleks jądrowy

Wszystkie z tych części muszą być funkcjonalne by zaszła ubikwitynacja białka

FANCJ, FANCD1(BRCA2), FANCN - poniżej tego szlaku

• Model działania szlaku

1. Utworzenie jądrowego kompleksu (w odpowiedzi na uszkodzenie)

A, B, C, E, F, G, L, M

Rola: FANCL główne

FANCD2 (lizyna 561)i FANCI (lizyna 523) - ubikwitynacja tych białek (bardzo ważne)

2. 
   Interakcja z Rekombinacją Homologiczną

BRCA1 + FANCJ działają poniżej

FANCD1 i FANCD2 + BRCA2 ubikwitynacji

PARP2 oddziałuje z BRCA1(transport RAD51)

RAD51C związane z anemią Fanconiego

SLX4 kompleks białek biorący udział w końcowym etapie

XPF białko mechanizmu naprawy NER, które nacina nić

• Mechanizm naprawy wiązań krzyżowych:

• Zatrzymanie(zapadnięcie) widełek replikacyjnych

• Szlak anemii Fanconiego(kompleks jądrowy)

• NER- odcięcie uszkodzenia, odsuwane na drugą stronę EERCC1

• Synteza DNA w obecności uszkodzenia(TLS)

• Rekombinacja Homologiczna, resynteza nici z udziałem białek HR

• Przyłączanie helikaz, restart widełek replikacyjnych

• Nowotwory FA/HR

• Mutacje w kompleksie jądrowym - anemia Fanconiego;

• Poniżej ubikwitynacji - anemia Fanconiego, nowotwory jajnika, piersi, neuroblastoma, nowotwory lite;

• HR - nowotwory piersi jajnika, anemia Fanconiego.

• Niestabilność genomowa:

• Werner Syndrome - WR (mutacja genu WRM);

• Bloom Syndrome (mutacja genu BLM);

• Choroby związane z mutacjami RecQ DNA(mutacja genu RECOL->RTS).

• Rola helikaz:

• Konieczne w replikacji, transkrypcji, naprawie, rekombinacji(tam gdzie wymagany pojedynczy DNAwspółdziałają z wieloma białkami metabolizmu DNA);

• Współdziałają pomiędzy replikacją i rekombinacją;

• Odgrywają ważną rolę w replikacji (podczas zatrzymania widełek replikacyjnych) oraz segregacji chromosomów;

• Zwiększona mutageneza, rozwój nowotworów.

• Rodzina RecQ helikaz DNA

• Mutacje w rodzinie enzymów helikaz DNA zwanych helikazami RecQ - choroby charakteryzujące się niestabilnością chromosomową;

• Metaboliczna aktywność helikaz RecQ;

• Konserwatywność ewolucyjna;

• Domena helikazowa;

• WRN - dodatkowo egzonukleazowa domena (aktywność nukleolityczna).

---