Medycyna rozrodu - wykład 17.11.11

Diagnostyka w andrologii

Diagnostyka hormonalna

• Podstawowe poziomy hormonów - odzwierciedlają aktualną ilość badań hormonu

• Hormonalne testy hormonów - określają stan czynnościowy gruczołów wydzielania zewnętrznego

1. In vivo

2. RIAS

L* + A_b = L* A_b H + A_b = HA_b

L* - hormon znakowany radioznacznikiem

H - badany hormon

A_b - przeciwciało

Jest to zależność odwrotnie proporcjonalna (mało hormonu - wyższa wartość promieniowania; dużo hormonu - niższa wartość promieniowania)

• Nasilenie promieniowania zależy od stężenia hormonu w próbce

• Krzywą ustala się ze standardów - krzywa nieliniowa, logarytmowanie zmienia ją w funkcję nieliniową; bardzo mało precyzyjna w skrajnych zakresach

• Hormony białkowe (PRL) - wstrzykiwane małym zwierzętom (królik, świnka) wzbudzały wytworzenia przeciwciał poliklonalnych przeciw różnym epitopom antygenu

• Dobra czułość wymaga ściśle określonego stężenia znakowanego hormonu, przeciwciało musiało być dobrze rozcieńczane i mieć długi czas inkubacji by osiągnąć równowagę w reakcji

• Konieczność oddzielenia kompleksu H/LA_b np. precypitacja po połączeniu z białkiem A Staphylococcus ureus lub osadzenie wolnych H/L na węglu i wirowanie

• LH, FSH, TSH, hCG mają tę samą podjednostkę α, różnią się specyficzną podjednostką β

• Hormony białkowe (GH) występują w różnych formach przestrzennych, mając tę samą immunoreaktywnosć mają różną aktywność biologiczną

• Nieaktywne metabolity hormonów mogą być rozpoznane przez przeciwciała (np. podwyższenie PTH w niewydolności nerek)

3. Metody immunometryczne pozwalają na zbadanie małych ilości hormonów

• Wynalezione - lata 80

• Technika hybrydowa (kk. śledziony + kk. szpiczaka) wytwarzania przeciwciał monoklonalnych

• Znakowane przeciwciało A_b, zamiast hormonu

• Przeciwciało osadzone w fazie stałej

Na tych metodach oparte są testy:

• IRMA - immunoradiometryczne

• ICMA - chemiluminescencja

• IFMA - immunoflumetryczna

• IEMA (ELISA) - immunoenzymatyczna

Cechy:

• Przeciwciała są w nadmiarze i wiążą cały antygen

• Krótki czas inkubacji

• Bardzo szeroki zakres oznaczeń

• Dobra czułość

Pomiary fotometryczne - pomiar ilości światła zaabsorbowanego przez badaną próbkę - pomiar absorbancji. Zgodnie z prawem Beera istnieje liniowa zależność między stężeniem a absorbancją. Pomiary mogą być wykonane po ustaniu reakcji (pomiar punktu końcowego) lub w czasie trwania reakcji (pomiary kinetyczne). Pomiar może być wykonywany przy jednej długości fali (metoda monochromatyczna) lub przy dwóch długościach fal (metoda bichromatyczna)

Metoda potencjometryczna - pomiar siły SEM ogniwa pomiarowego w badanej próbce (elektrod). Odczyt potencjału w miliwoltach

Metoda CMIA - immunochemiczna z użyciem mikrocząsteczek i znacznika chemiluminacyjnego. Oparta na reakcji wiązania badanej substancji przez paramagnetyczne mikrocząsteczki opłaszczone przeciwciałem. Elektromagnes przyciąga cząsteczki paramagnetyczne, aby umożliwić wypłukanie próbki. Podanie koniugatu związanego z akrydyną.

Błędy pomiarowe

Błędy laboratoryjne ok. 0,5%

• Przedanalityczne ok. 61-69%

• Krew z drogi dożylnej

• Zanieczyszczenie

• Nieprawidłowa próbka

• Skrzep lub brak skrzepu

• Braki w nazwisku

• Zamiana badań

• Analityczne 13 - 15%

• Przypadkowe błędy instrumentalne (pipetowanie)

• Nierozpoznane inneczynniki

• Poanalityczne 18 - 23%

• Błędy ludzki

• Błędy w komunikacji

Wpływ błędów analitycznych na leczenie chorego:

• Zmiana leczenia 0,6%

• Przetoczenie krwi 1,3%

• Dalsze badania 5,6%

• Powtórzenie badań 16,9%

Ludzki przeciwciała przeciw-zwierzęce:

• Anty-mysie - HAMA

• Albuminy zwierzęce

• Glikoproteiny owadów

HAMA powstają na skutek wykorzystania w diagnostyce i terapii mysich monoklonalnych przeciwciał

• Zwykle klasy IgG, IgA, IgH

• Przeciwko różnym elementom cząsteczki

• Mogą przetrwać wiele miesięcy

• W limfocytach B pamięć jest przechowywana przez lata

• Częstość występowania 1-80% (trudno ustalić)

Wpływ heteroprzeciwciał na wyniki oznaczeń:

• Stężenie przeciwciała wiążącego w roztworze jest stałe, a heteroprzeciwciał zmienne

• Przeciwciała heterofilne mają różną zdolność wiązania

+ fałszywie + fałszywie -

Czynniki zaburzające precyzję oznaczeń:

• Białka osocza (czynnik reumatoidalny)

• Heterofilne przeciwciała przeciw-zwierzęce

• Leki i metabolity leków

• Hemoliza

• Agar

• Reakcje krzyżowe

• Przeciwciała powstające w infekcjach

Inne:

• Pulsacyjność wydzielania -LH, testosteron - 2 próbki co 20 min. zmieszane do jednego oznaczenia

• Rytm dobowy: ACTH, kortyzol, testosteron

• Wydzielanie zależne od snu: GH

• Związane z białkami nośnikowymi: testosteron, estradiol - SHBG; T₃ i T₄ - TBG; kortyzol - transkortyna (łatwiej ocenić ilość SHBG, TBG lub dokonać precypitacji kompleksu SHBG-T

Wyniki fałszywie dodatnie mogą spowodować nieuzasadnione rozpoznanie choroby;

Wyniki fałszywie ujemne mogą prowadzić do zaniechania leczenia.

---