EKOTOKSYKOLOGIA

SPRAWOZDANIE NR 4

WPŁW METALI CIĘŻKICH NA OPORNOŚĆ OSMOTYCZNĄ ERYTROCYTU

Rzeszów, 2010/2011

Cel ćwiczenia:

- wyznaczenie krzywej oporności osmotycznej erytrocytów, ciśnienia osmotycznego wywołującego 50% hemolizy (π₅₀),

- określenie wpływu metali ciężkich na oporność osmotyczną erytrocytu

Materiał badany i odczynniki:

- probówki Eppendorfa na 1,5 ml , statywy, spektrofotometr Helios, mikrokuwety, pipety (automatyczne), wirówka

- roztwory NaCl o stężeniach 56, 60, 64, 68, 70, 72, 74, 90, 110, 130 i 154 mM, woda dejonizowana

- roztwory metali ciężkich (Pb)

- krew

Wykonanie ćwiczenia:

Do 12 probówek Eppendorfa odpipetowano po 1480 µl roztworów NaCl o stężeniach 0 (woda destylowana), 56, 60, 64, 68, 70, 72, 74, 90, 110, 130 i 154 mM. Następnie do probówek dodano po 20 μl starannie krwi, dobrze wymieszano zawartość i odstawiono na 10 minut, po czym ponownie wymieszano zawartość probówek i odwirowano (3000 x g, 10 min). Potem w płynie nadosadowym określono zawartość hemoglobiny poprzez pomiar absorbancji przy długości fali 540 nm.

Równocześnie przeprowadzono powyższą procedurę z krwią preinkubowaną 15 minut z  roztworami metali ciężkich (Pb).

OBLICZENIA:

Uzyskane wyniki: absorbancji płynu nadosadowego w probówkach oraz turbidancji próbek przy pomiarach w Spektrofotometrze Helios

Stężenie NaCl	Absorbancja	Turbibancja
kontrola	1,309	0,036
56 mM	1,314	0,028
60 mM	1,585	0,061
64 mM	1,634	0,175
68 mM	1,283	0,409
70 mM	1,035	0,716
72 mM	0,817	1,037
74 mM	0,623	1,114
90 mM	0	1,322
110 mM	0	1,431
130 mM	0	1,445
154 mM	0	1,590

Obliczenia procentu krwinek hemolizowanych przy pomiarze absorbancji i turbibancji

ABSORBANCJA TURBIBANCJA

procent krwinek zhemolizowanych procent krwinek zhemolizowanych

H = (A_i/A₀) _* 100%, H = (1 - Ti/T_{154 mM NaCl}) _* 100%,

gdzie: A_i - absorbancja płynu nadosadowego gdzie: T_i- turbidancja i-tej próbki

w i-tej probówce serii b, T_B- turbidancja krwinek zawieszonych w

A₀ - absorbancja płynu nadosadowego w probówkach 154 mM NaCl,

serii a (krwinki plus woda)

Stężenia	Absorbancja procent krwinek hemolizowanych [%]	Turbibancja procent krwinek hemolizowanych [%]
kontrola	100	100
56 mM	100,38	98,24
60 mM	121,08	96,16
64 mM	124,83	88,99
68 mM	98,01	74,28
70 mM	79,07	54,97
72 mM	62,41	34,78
74 mM	47,59	29,94
90 mM	0	16,86
110 mM	0	10
130 mM	0	9,12
154 mM	0	0

Stężenia	Absorbancja ln[(100%-H)/H]	Turbibancja ln[(100%-H)/H]
56 mM	-5,5780	-4,02
60 mM	-1,7487	-3,22
64 mM	-1,6145	-2,09
68 mM	-3,8969	-1,06
70 mM	-1,3291	-0,20
72 mM	-0,5070	0,63
74 mM	0,0965	0,85
90 mM	0	1,60
110 mM	0	2,20
130 mM	0	2,30
154 mM	0	0

Wyznaczono c₅₀

Absorbancja c₅₀= 73 mM Turbibancja c₅₀= 71 mM

Wartość β Absorbancja Wartość β Turbibancja

ln [(100%-H)/H] = β(c-c₅₀) ln [(100%-H)/H] = β(c-c₅₀)

mM NaCl	β
56	0
60	0
64	0
68	0
70	0
72	0
74	0,0965
90	0
110	0
130	0
154	0
mM NaCl	β
56	0
60	0
64	0
68	0
70	0
72	0,63
74	0,2833
90	0,0842
110	0,0564
130	0,0390
154	0

Wyniki krwią preinkubowaną z roztworami metali ciężkich Pb

Stężenia	Pb 0,1 mM absorbancja	Pb 0,1 mM turbibancja	Pb 1 mM absorbancja	Pb 1 mM turbibancja
kontrola	1,440	0,022	2,154	0,034
56 mM	0,874	1,373	0,075	1,624
60 mM	0,724	1,421	0,058	1,661
64 mM	0,486	1,516	0,111	1,663
68 mM	0,330	1,553	0,026	1,674
70 mM	0,179	1,566	0,028	1,684
72 mM	0,096	1,671	0,009	1,693
74 mM	0,069	1,693	0,027	1,741
90 mM	0,003	1,737	0,012	1,803
110 mM	0	1,771	0,007	1,836
130 mM	0	1,827	0,003	1,868
154 mM	0	1,892	0,011	1,903

Obliczenia procentu krwinek hemolizowanych przy pomiarze absorbancji i turbibancji z roztworami metali ciężkich Pb

Stężenia	Pb 0,1 mM Absorbancja procent krwinek hemolizowanych [%]	Pb 0,1 mM Turbibancja procent krwinek hemolizowanych [%]	Pb 1 mM Absorbancja procent krwinek hemolizowanych [%]	Pb 1 mM Turbibancja procent krwinek hemolizowanych [%]
kontrola	100	100	100	100
56 mM	60,69	27,43	3,48	14,66
60 mM	50,28	24,89	2,69	12,72
64 mM	33,75	19,87	5,15	12,61
68 mM	22,92	17,92	1,21	12,03
70 mM	12,43	17,23	1,30	11,51
72 mM	6,67	11,68	0,42	11,04
74 mM	4,79	10,52	1,25	8,51
90 mM	0,21	8,19	0,56	5,25
110 mM	0	6,40	0,32	3,52
130 mM	0	3,44	0,14	1,84
154 mM	0	0	0,51	0

Wyznaczono c₅₀

c50 [mM]	Pb 0,1 mM absorbancja	Pb 0,1 mM turbibancja	Pb 1 mM absorbancja	Pb 1 mM turbibancja
		59	39	30	34

Stężenia [mM]	Wartość β Pb 0,1 mM absorbancja	Wartość β Pb 0,1 mM turbibancja	Wartość β Pb 1 mM absorbancja	Wartość β Pb 1 mM turbibancja
56	0	0,0572	0,1278	0,0801
60	-0,0111	0,0526	0,1196	0,0741
64	0,1349	0,0558	0,0857	0,0645
68	0,1348	0,0525	0,1159	0,0585
70	0,1775	0,0506	0,1082	0,0567
72	0,2030	0,0613	0,1303	0,0549
74	0,1993	0,0612	0,0992	0,0594
90	0,1991	0,0474	0,0864	0,0516
110	0	0,0378	0,0716	0,0436
130	0	0,0367	0,0658	0,0414
154	0	0	0,0425	0

Obliczenie ciśnienia osmotycznego dla krwi z ołowiem

a) dla 154 mM roztworu NaCl

Π = f *i* c* R* T

Π = 1* 2* 154 mM * 8,314 J/K*mol

Π = 2560,712 kPa

b) dla roztworu NaCl odpowiadającego c₅₀ dla krwi z ołowiem 0,1 mM aborbancja

Π = f *i* c* R* T

Π = 1* 2* 59 mM* 8,314 J/K* mol

Π = 981,05 kPa

c) dla roztworu NaCl odpowiadającego c₅₀ dla krwi z ołowiem 1 mM aborbancja

Π = 1* 2* 30 mM* 8,314 J/K* mol

Π = 498,84 kPa

d) dla roztworu NaCl odpowiadającego c₅₀ dla krwi z ołowiem 0,1 mM turbibancja

Π = 1* 2* 39 mM* 8,314 J/K* mol

Π = 648,49 kPa

e) dla roztworu NaCl odpowiadającego c₅₀ dla krwi z ołowiem 1 mM turbibancja

Π = 1* 2* 34 mM* 8,314 J/K* mol

Π = 565,35 kPa

Obliczono ciśnienie osmotyczne 154 mM roztworu NaCl bez dodatku ołowiu.

Π = 480,990 kPa

Obliczenia do ciśnienia osmotycznego dla roztworu NaCl odpowiadającego c₅₀ bez dodatku ołowiu.

Π = 257,003 kPa

WNIOSKI

Przechodzenie hemoglobiny do osocza krwi wywołane zniszczeniem erytrocytów czyli hemoliza może być spowodowana obecnością metali ciężkich takich np. ołów.

Wpływ metali ciężkich powoduje zmniejszenie oporności osmotycznej erytrocytu, ponieważ ich toksyczność zwiększa hemolizę.

Analizując otrzymane wyniki, można stwierdzić, że im wyższe stężenie NaCl tym procent krwinek zhemolizowanych maleje. W badaniu samej krwi wyraźny spadek H następuje dopiero przy stężeniu 72 mM NaCl, natomiast w badaniu z krwią preinkubowaną z roztworem Pb(CH₃COO)₂ zauważono spadek już przy stężeniu 70 mM NaCl.

Ciśnienie osmotyczne przy stężeniu 154 mM było znacznie wyższe niż ciśnienie osmotyczne przy stężeniu 70 mM

7

---