LABORATORIUM Z BIOTECHNOLOGII
UWALNIANIE PRODUKTÓW WEWNĄTRZKOMÓRKOWYCH
24.04.2009r
Biotechnologia grupa 3
Justyna Adamczyk
Katarzyna Kwiatkowska
Magdalena Lewicka
Wstęp teoretyczny
Produkt, który chcemy uzyskać może zostać wydzielony do środowiska bądź też może znajdować się wewnątrz komórki. Lipazy zaliczamy do enzymów wewnątrzkomórkowych. Ze względu na problemy z ich wydzielaniem poza komórkę, są one poznane w dużo mniejszym stopniu. Lipazy są enzymami z klasy hydrolaz, które rozkładają wiązania estrowe w tłuszczach dając wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. Produktami pośrednimi są diglicerydy i monoglicerydy. W organizmie człowieka występują: lipaza żołądkowa i trzustkowa.
Aby wydzielić je poza komórkę stosuje się liczne metody dezintegracji komórek. Należą do nich metody:
Mechaniczne - bezpośrednie rozrywanie komórek, zaliczamy do nich:
- rozcieranie biomasy
- homogenizacja biomasy
Chemiczne - czynnik chemiczny nie może jednak negatywnie działać na produkt, stosuje się tu:
- ekstrakcję detergentami
- rozpuszczalniki organiczne
- antybiotyki - w celu zahamowania syntezy ściany komórkowej
Fizyczne, zaliczamy tu:
- zamrażanie i rozmrażanie
- szok osmotyczny
- gwałtowną dekompresję
- ultradźwięki
Standardowe metody wydzielania lipaz wewnątrzkomórkowych (ultradźwięki, rozcieranie z materiałem twardym, zamrażanie i rozmrażanie) mogą powodować znaczną inaktywacje lipazy. Do bardziej efektywnych metod w przypadku omawianych lipaz zaliczyć należy ekstrakcję detergentami połączoną z mechaniczną dezintegracją oraz wstępne przemycie komórek rozpuszczalnikami organicznymi.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodami uwalniania produktów wewnątrzkomórkowych na przykładzie wydzielania wewnątrzkomórkowej lipazy Mucor circinelloides.
.
Materiał biologiczny
Szczep grzybów nitkowatych Mucor circinelloides z kolekcji Instytutu Biochemii Technicznej hodowano na wstrząsarce w czasie 72 godzin w temp. 30oC na podłożu zawierającym namok kukurydziany i olej oliwkowy. Do kolby o pojemności 1000 cm3 wprowadzono 300 cm3 podłoża hodowlanego i szczepiono kulturą mateczną za pomocą ezy. Nagromadzoną w wyniku hodowli biomasę sączono na przegrodzie celulozowej i przemywano wodą destylowaną.
Wykonanie ćwiczenia
Wydzielanie lipazy Mucor circinelloides z komórki przeprowadzone zostało przy pomocy następujących metod:
Metoda I
Odważyłyśmy 0,5 g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniosłyśmy do naczynia i zalałyśmy 5 cm3 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0. Inkubowałyśmy w temperaturze 37oC w czasie 15 minut. W przesączu oznaczyłyśmy aktywność lipazy.
Metoda II
Odważyłyśmy 0,5 g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniosłyśmy do naczynia i zalałyśmy 4,5 cm3 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0 i 0,5 cm3 roztworu cholanu sodu. Inkubowałyśmy w temperaturze 37oC w czasie 15 minut. Następnie przesączyłyśmy na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyłyśmy aktywność lipazy.
Metoda III
Odważyłyśmy 0,5 g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniosłyśmy do moździerza, dosypałyśmy bezołowiowych kulek szklanych i zalałyśmy 4,5 cm3 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0. Rozcierałyśmy przez 10 minut. Całość przeniosłyśmy do naczynia szklanego, dodałyśmy 0,5 cm3 roztworu cholanu sodu. Inkubowałyśmy w temperaturze 37oC w czasie 15 minut. Następnie przesączyłyśmy na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyłyśmy aktywność lipazy.
Metoda IV
Odważyłyśmy 0,5 g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniosłyśmy do naczynia i zalałyśmy 4,5 cm3 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0. Homogenizowałyśmy przez 2 minuty zanurzając naczynie homogenizera w łaźni lodowej. Całość przeniosłyśmy do naczynia szklanego, dodałyśmy 0,5 cm3 roztworu cholanu sodu. Inkubowałyśmy w temperaturze 37oC w czasie 15 minut. Następnie przesączyłyśmy na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyłyśmy aktywność lipazy.
Metoda V
Odważyłyśmy 0,5 g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniosłyśmy do naczyńka wykonanego z folii aluminiowej, dodałyśmy 4,5 cm3 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0 i dwukrotnie zamroziłyśmy do temperatury -20oC i rozmroziłyśmy. Całość przeniosłyśmy do naczynia szklanego, dodałyśmy 0,5 cm3 roztworu cholanu sodu. Inkubowałyśmy w temperaturze 37oC w czasie 15 minut. Następnie przesączyłyśmy na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyłyśmy aktywność lipazy.
Metoda VI
Odważyłyśmy 0,5 g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniosłyśmy do naczynia szklanego i zalałyśmy 5 cm3 acetonu. Mieszałyśmy w przez 5 minut i odsączyłyśmy dobrze odciskając na przegrodzie ceramicznej. Operację przemywania acetonem powtórzyłyśmy 3 razy. Odwodnioną grzybnię rozłożyłyśmy pod wyciągiem na bibule i suszyłyśmy przez 15 minut. Całość przeniosłyśmy do naczynie szklanego, dodałyśmy 4,5 cm3 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0 i 0,5 cm3 roztworu cholanu sodu. Inkubowałyśmy w temperaturze 37oC w czasie 15 minut. Następnie przesączyłyśmy na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyłyśmy aktywność lipazy.
.
Oznaczenie aktywności esterazowej lipazy
Substratem do oznaczenia aktywności jest octan p-nitrofenolu, który pod działaniem esteraz i lipaz ulega hydrolizie z wydzieleniem p-nitrofenolu. Maksimum pochłaniania światła dla tego związku występuje przy długości fali 399nm. Sam octan p-nitrofenolu nie wykazuje pochłaniania przy tej długości światła. Bezpośrednio przed użyciem substrat o stężeniu 50 μmoli/cm3 w acetonitrylu został rozcieńczony pięciokrotnie wodą destylowaną.
Do probówki wprowadziłyśmy 0,1 cm3 rozcieńczonego roztworu p-nitrofenolu, 0,8 cm3 buforu fosforanowego 0,05 M o pH 7,0 i 0,1 cm3 ekstraktu lipazy. Inkubowałyśmy w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Szybkość uwalniania p-nitrofenolu mierzyłyśmy przy użyciu fotokolorymetru przy długości fali 399 nm. Wyniki pomiarów uzyskane przez wszystkie grupy zostały zestawione w tabeli 1. Aktywność zestawiona została w tabel 2. Za jednostkę aktywności przyjęto taką aktywność, która hydrolizuje octan p-nitrofenolu powodując uwolnienie 1 mola p-nitrofenolu w czasie jednej minuty.
Tabela 1. Wyniki pomiaru absorbancji dla poszczególnych metod przy długości fali 399 nm.
|
I |
II |
III |
IV |
Wynik średni |
|
I |
Bufor |
0,160 |
0,122 |
0,184 |
0,169 |
0,159 |
II |
Cholan sodu |
0,157 |
0,181 |
0,261 |
0,357 |
0,239 |
III |
Rozcieranie |
0,664 |
0,434 |
0,970 |
1,528 |
0,899 |
IV |
Homogenizer |
0,777 |
0,398 |
0,674 |
1,136 |
0,746 |
V |
Wymrażanie |
0,160 |
0,174 |
0,250 |
0,393 |
0,244 |
VI |
Aceton |
0,840 |
0,494 |
0,616 |
0,613 |
0,640 |
Tabela 2. Zestwienie aktywności esterazowej lipazy dla wszystkich omawianych metod.
Metoda dezintegracji |
Aktywność [μmol/g*min] |
Ekstrakcja buforem |
1,39 |
Ekstrakcja detergentem - cholanem sodu i buforem |
2,10 |
Rozcieranie |
7,89 |
Homogenizacja |
6,54 |
Zamrażanie i rozmrażanie |
2,14 |
Działanie rozpuszczalnikiem organicznym -acetonem |
5,61 |
Obliczenia - dla wartości średniej dla I metody
K=0,076 jA*ml/ μmol
A=K*c czyli c= A/K
K- współczynnik przeliczeniowy [jA*ml/ μmol]
c- stężęnie p-nitrofenolu [μmol /ml]
A- absorbancja [jA]
c=0,159 / 0,076
c=2,09 μmol /ml
znając stężenie można obliczyć ilość μmoli p-nitrofenolu n=c*V gdzie V=0,1 ml
n=2,09*0,1
n=0,209 μmol
znając ilość μmoli można wyliczyć aktywność Ak ze wzoru
Wnioski
Najmniej efektywna jest ekstrakcja buforem. Stosując ekstrakcje cholanem sodu i buforem otrzymujemy wyższe wyniki, gdyż cholan niszczy lipidowo-białkowo-cukrowe składniki ściany komórkowej, dzięki czemu enzym może wydostać się poza komórkę. Rozcieranie daje zadawalające wyniki, mogą być one jednak zawyżone przez zmętnienie. Wysoką aktywność uzyskujemy stosując homogenizajcę, jest to dobra metoda dezintegracji komórek. Zamrażanie i rozmrażanie daję dość niską aktywność, może to wynikać z faktu, iż komórki nie zostały zamrożone do końca. Używanie rozpuszczalników organicznych, takich jak aceton okazało się efektywnym sposobem wydobywania enzymu z komórki, metoda ta daje dość wysoka aktywność.
= μmol /ml
jA* μmol
jA*ml
μmol*ml
ml
= μmol
n*R μmol
t*m min*g
Ak=
Ak=
0,209*50 μmol
15*0,5 min*g
Ak= 1,39
μmol
min*g
t- czas reakcji enzymatycznej-15min
R- rozcieńczenie enzymu- 50
m- naważka enzymu- 0,5 g
Wyszukiwarka