WYKŁAD BIOL MOL Z DR STRZAŁKĄ 13.05.2013r.

Ksenobiotyki w regulacji aktywności translacyjnej

INHIBITORY TRANSLACJI

• Hamują inicjację (hamują proces przyłączania mRNA i tRNA do małej podjednostki rybosomy) np.: streptomycyna, kanamycyna, neomycyna, gentamycyna

• Wiążą się z podjednostką 30S i hamują wiązanie aminoacylo-tRNA do miejsca A oraz unieczynniają białkowe czynniki uwalniające (zapobieganie terminacji) np. tetracykliny

• Hamują translokację np. erytromycyna - wiąże się z podjednostką 50S i hamuje translokację

• Hamują aktywność transferazy peptydylowej i podjednostki rybosomalnej 50S:

U prokaryota np. chloramfenikol

U eukaryota np. cykloheksimid

• Hamują elongację i powodują przedwczesną germinację syntezy polipeptydy przez działanie jako analog aminoacylo-tRNA np. puromycyna

Antybiotyki aminoglikozydowe:

Do antybiotyków amino glikozydowych należą: streptomycyna, kanamycyna, gentamycyna, tobramycyna, amikacyna, netelmicyna, neomycyna

Działają one bakteriobójczo, przez hamowanie biosyntezy białka bakteryjnego.

Mechanizm działania:

Podstawowy mechanizm działania tych antybiotyków jest wynikiem zakłócenia interakcji kodonu z antykodonem.

Wiążą się one z podjednostką 30S rybosomu. Miejscem ich połączenia są głownie białka S3, S5 oraz 16S rRNA. Działanie to jest nieodwracalne. Zahamowanie syntezy białka wiąże się z zajęciem miejsca A na rybosomie.

Efekt zahamowania syntezy zalezy w dużej mierze od stężenia antybiotyku. W mniejszych stężeniach antybiotyk powoduje głównie błędne rozszyfrowanie kody genetycznego, powodując błędną translację, w wyniku czego może spowodować pominięcie kodonów terminalnych syntezy białka. W większych stężeniach antybiotyki amino glikozydowe wywołują także uszkodzenia błony komórkowej bakterii. Przyczynia się to do wypływu niektórych jonów i związków małocząsteczkowych.

Aminoglikozydy

Efekt bakteriobójczy tej grupy jest bardzo szybki i zalezy od stosowanego stężenia.

Streptomycyna

Swoiście wiąże się do podjednostki 30S rybosomu. Wykazano wiązanie antybiotyku do białka S12, kodowanego przez gen strA. Wiązanie to jest zależne od innych komponentów podjednostki 30S. Związanie streptomycyny przez rybosom (1 rybosom - 1 cząsteczka antybiotyku) powoduje zmiany konformacyjne prowadzące do zaburzenia syntezy białka.

W mniejszych stężeniach streptomycyny odbywa się synteza białka, lecz jest ona obarczona wieloma błędami translacji - powstają białka o zmienionych właściwościach. W większych stężeniach streptomycyny (>20pg/ml) następuje słabe wiązanie antybiotyku do wielu miejsc na rybo somie, zarówno na podjednostce 30S, jak i 50S. Mechanizm tego wiązania nie jest znany, lecz prowadzi ono do całkowitego zaprzestania syntezy białka i szybkiej śmierci komórki bakteryjnej.
Streptomycyna hamuje inicjację i powoduje błędne odczytanie mRNA.

Inne aminoglikozydy - wiążą się one do innych białek rybosomowych

Kanamycyna - każdy rybosom wiąże 2 cząsteczki antybiotyku, po jednej do każdej podjednostki.

Gentamycyna - wiąże się do białka L6 w podjednostce 50S.

Aminocyklitole - Spektynomycyna - działanie bakteriostatyczne. Antybiotyk wiąże się do białka S5 w podjednostce 30S rybosomy. Kompleks taki powoduje zahamowanie translokacji, prawdopodobnie w wyniku utrudnienia ruchu mRNA względem podjednostki 30S.

Antybiotyki tetracyklinowe

Do antybiotyków tetracyklinowych należą: tetracyklina, oksytetracyklina, chlorotetracyklina, deklomycyna, metacyklina, doksycyklina, minocyklina

Mechanizm działania:

Antybiotyki tetracyklinowe wiążą się nieodwracalnie z podjednostką 30S rybosomu. Antybiotyki te konkurują z aminoacylo-tRNA, w trakcie jego wiązania się z miejscem A w rybo somie. Prowadzi to do interakcji kodonu z antykodonem. Przerwanie wiązania animoacylo-tRNA uniemożliwia odczytanie miejsca akceptorowego, wywołującego inicjację oraz elongację. Przy wyższych stężeniach tetracyklin zahamowany zostaje proces wydłużania łańcucha peptydowego i terminacji syntezy. Działanie bakteriobójcze tetracyklin jest także wynikiem ich działania kompleksotwórczego z jonami Mg i Ca.

Makrolidy

Makrolidy - erytromycyna, klarytromycyna, azytromycyna.

Makrolidy wiążą się w sposób odwracalny do jednego miejsca na podjednostce 50S, do którego mają bardzo dużo powinowactwo. W wiązaniu tym uczestniczą białak L15 i L16.

Antybiotyki te wiążą się do miejsca P na podjednostce 50S (miejsce wiązania peptydylo-tRNA). Makrolidy wiążą się z podjednostką 50S i hamują translokację.

Streptograminy

Streptograminy - chinuprystyna i dalfoprystyna.

Związki te hamują syntezę białka w wyniku interakcji z domeną peptydylo-transerazową na podjednostce 50S rybosomu. Streptograminy grupy A inaktywują miejsca donorowe i akceptorowe peptydylotransferazy, tym samym hamując elongację.

Antybiotyki grupy B zaburzają właściwe ustawienie peptydylo-tRNA w miejscu P, hamując tworzenie wiązań peptydowych i powodując przedwczesne odłączanie niekompletnych łańcuchów peptydowych.

Obie grupy antybiotyków działają synergicznie - grupa A powoduje zmiany konformacji centrum aktywnego peptydylotransferazy, które prowadzi do zwiększonego powinowactwa rybosomy dla streptogramin grupy B.

Linkozamidy

Linkozamidy - klimdamycyna, linkomycyna

Antybiotyki te wiążą się do podjednostki 50S rybosomu prawdopodobnie hamują wiązanie substratu - aminoacylo-tRNA do miejsca A na rybosomie.

Chloramfenikol

Chloramfenikol - działa głownie bakteriostatycznie. Detreomycyna i jej pochodne działają na podjednostkę 50S rybosomu. Antybiotyki te są inhibitorami peptydylotransferazy bakteryjnej. Mechanizm działania - antybiotyk wiąże się w pobliżu centrum aktywnego peptydylotransferazy, hamując tym samym wiązanie końca aminoacylo-tRNA niosącego aminokwas do miejsca A oraz wytworzenie wiązania peptydowego.

Dla wiązania niezbędna jest obecność funkcjonalna białka L16. Prawdopodobnie w wiązaniu uczestnicza także inne białka podjednostki 50S (L24 i L27). Aktywność chloramfenikolu jest optymalna po wysyceniu rybosomów antybiotykiem w stosunku 1:1. Detreomycyna z małym powinowactwem wiąże się również do podjednostki 30S, lecz nie wykazano zależności między tym wiązaniem a hamowaniem syntezy białka.

Oksazolidinony

Oksazolidinony - linezolid, eperezolid.

Związki te wiążą się do podjednostki 50S rybosomu w pobliżu miejsc wiązania detreomycyny oraz linkomycyny hamują wiązanie mRNA we wstępnych fazach procesu translacji.

Kwas fusydowy

Kwas fusydowy wiąże się również z rybosomami eukariotycznymi. Hamuje on aktywność białkowego czynnika elongacyjnego EF-G, który w procesie wymagającym GTP uczestniczy w translokacji, tnąc wiązanie estrowe łączące łańcuch peptydowy z tRNA odpowiadającym C-końcowemu aminokwasowi.

Puromycyna

Puromycyna - działa bakteriobójczo.

Jest ona inhibitorem syntezy białka zarówno, na rybosomach prokariotycznych, jak i eukariotycznych.

Wiąże się z podjednostką 50S rybosomu w pobliżu białka L23. Antybiotyk ten jest analogiem strukturalnym końca 3' aminoacylo-tRNA i jego grupa aminowa reaguje z wolnym końcem karboksylowym peptydylo-tRNA.

Różnica w wiązaniu - reszta aminoacylowa jest związana z resztą rybozy wiązaniem estrowym, natomiast z puromycyną - mostkiem amidowym. Wiązanie amidowe nie może być rozerwane przez transferazę peptydylową.

Puromycyna nie jest inhibitorem peptydylotransferazy, uniemożliwia tylko tworzenie kolejnego wiązania peptydowego, w wyniku czego powstaje niestabilny kompleks, który w postaci peptydylopuromycyny „odpada” z rybosomu, przerywając syntezę białka.

SYNTEZA I OBRÓBKA PROTEOMU

Kod genetyczny - to zestaw reguł, które określają sposób, w jaki sekwencja nukleotydów w mRNA zostaje przetłumaczona na sekwencję aminokwasów w białku.

Kod genetyczny jest:

• KODEM TRÓJKOWYM - tzn. trzy nukleotydy kodują jeden aminokwas

• 4³ = 64 (61 trypletów kodujących aminokwas, 3 kodony stop), 20 aminokwasów

• Kodony (trójki nukleotydów) odczytywane są jako kolejne, nie nachodzące na siebie grupy, nie ma między nimi przecinków oddzielających lub wyznaczających je

• Kodony (inicjujące) - rozpoczynające translację to:

AUG, GUG - u prokariota

• Kodony terminujące (kodony „stop”) - sygnały zakończenia translokacji to:

UAG - amber

UAA - ochre

UGA - opal

• JEDNOZNACZNY - jeden trój nukleotyd koduje zawsze tylko jeden określony aminokwas

• ZDEGENEROWANY - jeden aminokwas może być kodowany przez kilka trój nukleotydów. Tylko metionina i tryptofan mają po jednym kodonie.

Kodony synonimowe - kodony, które specyfikują te same aminokwasy

• UNIWERSALNY - kodony dla poszczególnych aminokwasów są prawie identyczne u wszystkich organizmów (wyjątek: mitochondria, niektóre orzęski)

Kolinearny - sekwencja nukleotydowa w DNA odpowiada sekwencji w mRNA i dalej w syntetyzowanym białku (prokarioty)

Nienakładający się - trójki są kolejno odczytywane i nie zachodzą na siebie, wyjątek np. wirusy

Ma kodony przestankowe:

Kodon inicjacyjny AUG - metionina

STOP (nonsensowne) - nie kodują żadnego aminokwasu UAG (amber), UAA (ochre), UGA (opal)

Uniwersalny - te same kodony wyznaczają te same aminokwasy u wszystkich organizmów pro- i eukariotycznych. Wyjątki dotyczą mitochondriów, niektórych prokariontów, niektórych pierwotniaków. Np.

UGA - stop = w mitochondriach tryptofan

AGA - arginina - w mitochondriach stop

GUG - walina - kodon inicjacyjny niektóre prokarionty

Translacja, czyli biosynteza białek jest ostatnim etapem ekspresji informacji genetycznej.

W procesie biosyntezy białka dochodzi do tłumaczenia (translacji) informacji zapisanej w sekwencji nukleotydowej kwasu mRNA na sekwencję aminokwasów w białku.

Po przepisaniu informacji z nukleotydowej sekwencji DNA na RNA (mRNA), translacja pozwala na przetłumaczenie szyfry nukleotydowego na język aminokwasów w białku.

• System translacji działa podobnie zarówno u organizmów prokariotycznych, jak i u eukariotycznych, z tą różnicą, że u Eucariota następuje przestrzenne oddzielenie transkrypcji od translacji (translacja odbywa się na terenie cytoplazmy co wiąże się z koniecznością transportu mRNA z przedziału jądrowego).

• Przetransportowany do cytoplazmy mRNA może ulec translacji, bądź też zostać szybko zdegradowany, jeśli białko, jakie jest przez niego zakodowane występuje w komórce w dostatecznej ilości.

• I tak na przykład mRNA dla histonów jest bardzo stabilne w fazie S cyklu komórkowego, tj. w tym momencie, kiedy obserwuje się najwyższe zapotrzebowanie na histony. Zatem w fazie S następuje translacja mRNA histonowego. W innych fazach cyklu komórkowego stabilność tych tan skryptów jest ok. 5-krotnie niższa, co oznacza, że ulegają one degradacji.

• Wniosek - synteza białka zachodzi w zależności od potrzeb komórki, a zatem regulacja ekspresji informacji genetycznej odbywa się także na etapie poprzedzającym translację.

Struktury niezbędne do przeprowadzenia translacji:

• Rybosomy

• Transferowe RNA (tRNA) (dostarczające aminokwasów)

Obok tych struktur, w procesie biosyntezy białka biorą udział również: matrycowe RNA (mRNA) oraz wysokoenergetyczne związki, których zadaniem jest dostarczenie energii (cząsteczki GTP).

W procesie translacji poszczególne składniki musza znaleźć się w ściśle określonym położeniu w stosunku do siebie. Zatem cząsteczki biorące w nim udział musza zostac uporządkowane przestrzennie. Taką porządkującą funkcję pełnią rybosomy. Łatwość dysocjacji i asocjacji obu podjednostek rybosomalnych umożliwia skutecznie wiązanie się tych organelli z mRNA oraz z aminoactlo-tRNA.

Rybosomy

• Miejscem syntezy białka są organella komórkowe zwane rybosomami. Występują one oprócz cytoplazmy także w mitochondriach i chloroplastach.

• Rybosomy w cytoplazmie mogą występować w formie wolnej lub związanej w retikulum endoplazma tycznym. Pierwsze z nich uczestnik w translacji białek cytozolowych, a drugie białek eksportowanych do wnętrza retikulum oraz na zewnątrz komórki. Obydwa rodzaje rybosomów zbudowane SA z dwóch podjednostek: małej i dużej. Składają się one z rybosomalnego RNA oraz kilkudziesięciu białek, których skład różni się między obydwiema „częściami” rybosomu.

• W obrębie rybosomu wyróżnia się trzy istotne miejsca zwane E (exit - tędy wychodzi „zużyty” tRNA), A (aminokwasowe), P (peptydowe).

• Synteza białka przebiega na rybosomach, które zbudowane są z podjednostki dużej i małej. Każda z podjednostek zbudowana jest w 2/3 z RNA i w 1/3 z białka.

• U E.coli występują rybosomy 70S składające się z podjednostek 30S i 50S

• Podjednostkę 30S tworzy rRNA16S (16SrRNA) i 21 różnych białek: podjednostkę 50S: rRNA 23S i 5S oraz 34 różne białka. Łańcuch peptydowy syntetyzowany jest w kierunku od końca aminowego do karboksylowego, a mRNA ulega translacji w kierunku 5'-3'

Cząsteczka rRNA tworzy wewnętrzny szkielet rybosomu, do którego przyłączają się białka.

Interakcja kodon - antykodon

Rozpoznanie odpowiedniego tripletu nukleotydowego na mRNA odbywa się dzięki uniwersalnej dla oddziaływań między kwasami nukleinowymi regule komplementarności (antykodon z tRNA musi się łączyć z odpowiednim kodonem położonym na mRNA). Po związaniu się mRNA pomiędzy dwie podjednostki, w miejsca A i P rybosomu dołączane są odpowiednie aminoacylo-tRNA. Pierwszym, dołączanym do kodonu inicjatorowego (AUG), jest zwykle aminoacylo-tRNA, związane z N-formylometioniną (tzw. f-Met-tRNA).

Miejsce wiążące rybosom (sekwencja Shine-Dalgarno) w prokariotycznych mRNA jest to zachowawcza sekwencja leżąca 8-13 nukleotydów powyżej kodony inicjatorowego, który ulega translacji.

Dalej proces translacji zachodzi w następujących po sobie cyklach.

Wyróżniamy 3 etapy syntezy białka:

• Inicjacja - organizowanie się kompleksy rybosom-mRNA

• Elongacja - powtarzalne cykle dostarczania aminokwasów, tworzenia wiązań peptydowych i przemieszczania rybosomu wzdłuż mRNA (translokacja)

• Terminacja - uwalnianie łańcucha polipeptydowego

Translokacja mRNA zachodzi w kierunku 5' do 3'.

Pierwszy aminokwas syntetyzowanego polipeptydu zakodowany jest przez kodon leżący bliżej 5' końca transktyptu. Najwcześniej wbudowanymi aminokwasami powstającego białka są te, które stanowią jego N-terminalną część. Wynika to z mechanizmu tworzenia wiązań peptydowych między sąsiadującymi aminokwasami.

1

---