Strategia diagnostyki genetycznej
1. gen nieznany
- analiza sprzężeń
2. gen znany
- poszukiwanie mutacji
Gen nieznany- ANALIZA SPRZĘŻEŃ
- metoda stosowana w sytuacji kiedy nie znamy genu związanego z występowaniem określonej choroby genetycznej
- celem tej metody jest znalezienie sekwencji DNA (markera genetycznego), która jest dziedziczona łącznie z poszukiwanym przez nas genem
- analiza sprzężeń wymaga pobrania materiału od wielu członków rodziny w celu ustalenia segregacji markerów genetycznych z locus poszukiwanego genu
- aby wynik był jednoznaczny, osoba obciążona ryzykiem przeniesienia genu warunkującego chorobę musi być heterozygotą
- stosowana dla chorób jednogenowych o mendlowskim typie dziedziczenia
ANALIZA ASOCJACJI
- polega na badaniu porównawczym rozkładu alleli różnych polimorfizmów pomiędzy grupą chorych niespokrewnionych a grupą kontrolną
- analiza asocjacji wykrywa różnice w rozkładzie alleli- stwierdzenie bezpośredniej asocjacji identyfikuje zarówno gen jak i polimorfizm odpowiedzialny za zwiększone ryzyko wystąpienia choroby
- stosowana w chorobach uwarunkowanych wielogenowo/wieloczynnikowo
Poszukiwanie mutacji
I. mutacje znane
1. mutacje punktowe
- PCR-RFLP
-PCR-ASA
- ASO
2. rearanżacje genowe
- PCR-multipleks
-Q-PCR
- Southern blot
II. mutacje nieznane
1. metody przesiewowe
- PCR-HD
- PCR- SSCP
-PCR-DGGE
Znane mutacje punktowe w miejscu resktrykcyjnym - PCR-RFLP
-fenyloketonuria
- anemia sierpowata
- hemofilia
Enzymy restrykcyjne PCR-RFLP
Dlaczego restryktaza nie przecina własnego DNA bakterii we wszystkich przypadkach gdy odnajdzie tę sekwencję???
- ARBER - bakteria przystępując do produkcji EcoRI jednocześnie zaczyna wytwarzać inny enzym, który chemicznie modyfikuje w jej własnym materiale genetycznym miejsca, które mogłyby stać się potencjalnym celem ataku restryktazy - zmodyfikowane sekwencje GAATTC występujące w DNA bakterii pozostają identyfikuje wszystkie takie sekwencje znajdujące się w DNA wirusa
- modyfikacja chemicznej struktury DNA, poprzez dodanie do zasad w sekwencji rozpoznawalnej przez restryktazę grupy metylowej CH3
Podział enzymów wg rodzaju przeprowadzanej reakcji:
- oksydoreduktazy
- transferazy
- hydrolazy
- liazy
- izomerazy
- ligazy(syntetazy)
Nukleazy- potoczna nazwa różnorodnych enzymów z klasy hydrolaz, katalizujących rozkład kwasów nukleinowych
- egzonukleazy - enzymy z klasy hydrolaz, katalizujące odłączanie nukleotydów od konców łańcuchów nukleinowych, DNA lub RNA, niektóre mogą działać na oba te kwasy
- endonukleazy- katalizują rozkład wiązań estrowych w środku łańcucha kwasu nukleinowego z wytworzeniem oligonukleotydów
Enzymy restrykcyjne
- podst narzędzia inżynierii genetycznej
- rozpoznają ściśle określone sekwencje dwuniciowego DNA i przecinają cząsteczki DNA w obrębie tych sekwencji
- rozpoznawane sekwencje są np. cztero- lub sześcionukleotydowe, mają charakter palindroimowy
- po przecięciu powstają lepkie lub tępe końce
Enzymy restrykcyjne:
- grupa- endonukleazy
- izolowane z bakterii lub sinic
- przecinają obie nici DNA w miejscu występowania krótkich, kilkunukleotydowych sekwencji, specyficznych dla danego enzymu restrykcyjnego
- charakterystyczne dla danych komórek bakteryjnych, gdzie słuzy do fragmentowania obcego DNA np. bakteriofagów
Podział restryktaz wg rodzaju wytwarzanych końców:
- TĘPE KOŃCE- nici rozcięte naprzeciwko siebie- wszystkie nukleotydy są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu
- Końce kohezyjne (LEPKIE) - 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu koncach utworzone przez niesymetryczne cięcie, komplementarne do podobnych tworzonych w innych cząsteczkach DNA przez te same enzymy restrykcyjne niezależnie od źródła DNA, co pozwala na ligowanie DNA nawet bardzo różniących się gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł
Kryteria podzialu enzymow restrykcyjnych
-mechanizm dzialania
-rodzaj substratu
-rodzaj produktu
-kofaktor- substancja niezbedna do aktywacji enzymu
Podzial enzymow restrykcyjnych:
I klasy
II klasy
III klasy
I klasy:
-ich aktywność in vitro zalezy od:
ATP
S-adenozylometioniny
Mg++
- substrat dwuniciowy DNA o zdefiniowanej sekwencji kilkunastu nukleotydow
-naciecie nici DNA w pewnej odległości od rozpoznanej sekwencji
-np. CfrAI
II klasy:
ich aktywność in vitro zalezy od:
-MG++
- substrat- dwuniciowy DNA o zdefiniowanej sekwencji kilkunastu nukleotydow
-naciecie nici DNA w obrebie lub w pobliżu (klasa IIS) rozpoznanej sekwencji
-np. AIuI, HaeIII, EcoRI, HindIII i in.
III klasy:
Ich aktywność in vitro zalezy od:
-ATP
-MG++
-S- adenozylometioniny - nie jest nizbedna
-Naciecia nici DNA w pewnej odległości od rozpoznanej sekwencji ( średnio 25 nukleotydow)
- np. EcoPI, HinfIII i in.
IZOSCHIZOMERY
- enzymy restrykcyjne wyizolowane z roznych szczepow ale rozpoznające te same sekwencje DNA
-np. HpaII, Harpii, NSPI, BsnF, MniII, Mol
-w obrebie grupy nie zawsze ciecie w tym samym miejscu ( konce kohezyjne leb tepe)
Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość która trawi kompletnie 1 μg DNA faga λ (około 50 kb) w czasie 1 godz w temp 37 ˚ C
Podzial restryktaz według sekwencji rozpoznanej:
-czworkowe, rozpoznaja sekwencje DNA złożone z czterech nukleotydow. Statystycznie w dowolnym DNA takich miejsc jest duzo - co 256 bp. Restryktazy takie mogą strawic DNA na bardzo male kawałki.
- szostkowe, rozpoznaja sekwencje DNA zlozona z sześciu nukleotydow. Dowolne miejsce restrykcyjne złożone z sześciu nukleotydow występują statystycznie co około 4096 bp w DNA w którym ilości poszczególnych nukleotydow sa rowne. Proporcje te zmieniaja się w zależności od organizmu dlatego dobor enzymu szostkowego i warunki należy ustalic eksperymentalnie.
- ósemkowe, stosowane niezbyt często. Tna DNA bardzo rzadko.
Wykrycie bakteryjnych enzymów restrykcyjnych miało ogromne znaczenie dla rozwoju technik molekularnych. Są one podstawowym narzędziem wykorzystywanym m.in. do:
* sporządzanie map genomowych
* sekwencjonowania DNA
* izolacji i identyfikacji genów
* klonowania molekularnego i rekombinacji genów czy fragmentów genomu
* diagnostyki chorób genetycznych (wykrywanie mutacji genowych)
* w analizie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA (RFLP)
Klonowanie. Klonowanie DNA w tym przykładzie o fragmentów DNA do sklonowania wstawia się do wektora plazmidowego, który następnie replikuje się wewnątrz komórek bakteryjnych gospodarza. Dna pocięty enzymami restrykcyjnymi można poddawać ligacji z wektorem. W ten sposób tworzone są zrekombinowane plazmidy czyli plazmidy zawierające sklonowane DNA który można później poddawać różnym manipulacjom przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych.
Analiza polimorfizmu. Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych RFLP:
* enzymy restrykcyjne posiadają tzw. specyficzność sekwencyjną - trawienie określonej cząsteczki DNA danym enzymem restrykcyjnym powinno dawać zawsze ten sam zestaw fragmentów.
Mutacje powodujące powstanie lub zanikanie miejsc restrykcyjnych:
* tranzycja lub transwersja
-powstanie miejsca restrykcyjnego w obrębie danego fragmentu (pojawienie się krótszego fragmentu DNA)
-nie rozcięcie „miejsca restrykcyjnego” - wówczas dwa przyległe fragmenty wejdą w skład jednego dłuższego odcinka DNA
* insercja lub delecja.
RFLP (polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych) opisana po raz pierwszy w 1980r.
* sama technika opiera się na trawieniu izolowanego DNA jednym lub kilkoma enzymami restrykcyjnymi. Do najczęściej używanych enzymów należą: EcoRI; EcoRV; DraI; HindIII i XbaI. DNA trawiony jest w ściśle określonych miejscach rozpoznawanych przez określony enzym. Produkt trawienia może być rozdzielony na żelu agarozowym.
* obecność lub brak prążka o określonej wielkości świadczy o polimorfizmie
* polimorfizm może wynikać:
- ze zmiany pojedynczego nukleotydu w obrębie miejsca restrykcyjnego
- ze zmiany większych fragmentów DNA
- z metylacji niektórych zasad azotowych w DNA.
* minusem tej analizy jest relatywnie wysoki koszt otrzymania wyniku oraz duża ilość DNA niezbędnego do trawienia restrykcyjnego
* zaletą markerów RFLP jest ich wysoka wiarygodność oraz kodominacyjny charakter dziedziczenia, co umożliwia rozróżnienie heterozygoty od homozygoty.
Znane mutacje punktowe poza miejscem restrykcyjnym
Strategia wykrywania opiera się na metodzie ASA lub ASO, czyli wykorzystaniu znajomości mutacji do skonstruowania odpowiednich sond lub starterów, które wykryją zarówno allel prawidłowy, jak i zmutowany np. mukowiscydoza
PCR-ASA
ASO
Amplifikacja allelo- specyficzna (PCR-ASA)
Metoda PCR pozwalająca rozróżnić allele badanego fragmentu
Startery rozpoznają allele typu dzikiego lub allel zmutowany
Hybrydyzacja ASO
Polega na hybrydyzacji z sondą specyficzną dla produktu PCR
Sonda rozpoznaje allel dziki (prawidłowy) lub zmutowany
Zastosowanie: wykrywanie mutacji punktowych, które nie zmieniają miejsc restrykcyjnych
Przykład: głuchota wrodzona, mukowiscydoza
Poszukiwanie mutacji |
|
|
Mutacje znane |
Mutacje nieznane |
|
Mutacje punktowe |
genowe |
Metody przesiewowe |
PCR-RFLP PCR-ASA ASO |
Q-PCR Southern blot |
PCR-HD PCR-SSCP PCR-DGGE |
PCR multipleks
Metoda ta pozwala na równoczesną amplifikację kilku regionów genomu w jednej probówce przy zastosowaniu różnych par primerów
Taka równoczesna amplifikacja więcej niż jednego regionu DNA w jednej mieszaninie reakcyjnej obniża koszty eksperymentów, oszczędza pracę i czas, a także zmniejsza ryzyko kontaminacji
Ta odmiana techniki PCR znalazła szerokie zastosowanie np. do wykrywania czynników zakaźnych, diagnostyki chorób genetycznie uwarunkowanych, wykrywania różnego typu mutacji
Badanie ekspresji genów
Zapis informacji genetycznej oraz jej ujawnienie się w postaci cechy (ekspresja genu) związane są z funkcjonowaniem kwasów nukleinowych
Informacyjny RNA (mRNA)powstaje podczas transkrypcji genów ulegających ekspresji w komórce i z tego względu jest to najbardziej zróżnicowana klasa kwasów rybonukleinowych
Ekspresja genów etapy:
Pierwszym etapem procesu ekspresji genu jest transkrypcja, która polega na syntezie mRNA na matrycowej nici DNA
Drugim etapem ekspresji genu jest proces polegający na wycinaniu intronów - nazywany jest składnikiem RNA i stanowi istotną część tzw obróbki potranskrypcyjnej pre-mRNA
Trzeci etap ekspresji genu - translacja
Po zakończeniu obróbki potranskrypcyjnej mRNA przechodzi do cytoplazmy i tam łaczy się z rybosomami
Badanie ekspresji genów
Z kolei proces ekspresji genu jest nierozerwalnie związany z RNBA, występującym w trzech podstawowych wariantach
mRNA (informacyjny RNA) powstający podczas transkrypcji genu
rRNA (rybosomowy RNA) stanowiący część strukturalną rybosomów
tRNA (transportującyh RNA)
ekspresja genu może być badana na etapie transkrypcji (hybrydyzacja In situ na skrawkach tkanek; northern blotting, RT-PCR) i translacji (western blotting)
Badanie ekspresji genu na poziomie transkrypcji z wykorzystaniem modyfikacji PCR
RT-PCR
PCR w czasie rzeczywistym (ang. Real time)
PCR w czasie rzeczywistym (ang. Real time)
Do środowiska reakcji wprowadzamy znakowane (np. barwnikami fluorrescencyjnymi) nukleotydy, bądź sondy łączące się z DNA, które pozwalają na podstawie odczytów w kolejnych cyklach określić ilość matrycy użytej do reakcji, jak również śledzić ilość powstającego produktu
PCR w czasie rzeczywistym = ilościowy PCR
Dostarcza informacji na temat ilości DNA w badanej próbce
Pozwala na monitorowanie przebiegu łańcuchowej reakcji polimerazy „w czasie rzeczywistym” to znaczy w jej trakcie
Ocena ilości DNA w próbie może być przydatna w wielu badaniach ekologicznych - informacja o relacji między ekspresją genu a ujawnieniem określonych cech fenotypowych
PCR w czasie rzeczywistym (ang. Real-time PCR)
Transkrypcja RNA odbywa się jedynie podczas ekspresji genów -> zawartość RNA w próbie może być wskaźnikiem intensywności zachodzenia tego procesu
DNA można syntetyzować na matrycy nioci RNA używająć do tego celu enzymu - odwrotna transkryptaza - polimeraza DNA zależna od RNA (komplementarny DNA - cDNA - jest to jednoniciowy komplementarny DNA powstały w matrycy mRNA w procesie odwrotnej transkrypcji)
cDNA - podstawa do oceniania transkrypcji genów (zawartość CDNA w próbie będzie wprost zależna od stopnia ekspresji badanego genu)
REAL-TIME PCR- Reakcja PCR z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym stosowana jest do pomiaru ilościowego kopii genu, transgenu czy genomów wirusowych i bakteryjnych lub poziomu ekspresji RNA w komórkach i tkankach. -Ilość kopii badanej cząsteczki kwasu nukleinowego jest monitorowana w każdym cyklu reakcji amplifikacji. -Liczba cykli reakcji PCR po których poziom fluorescencji przekroczy zdefiniowany próg(Ct; najczęściej jest to moment wejścia kinetyki reakcji w fazę logarytmicznego przyrostu ilości produktu) jest stosowana do obliczania ilości badanych cząsteczek obecnych w mieszaninie na początku reakcji.
Teoretyczne zasady techniki PCR zakładają, że ilość produktu po zakończeniu reakcji powinna być wykładniczo proporcjonalna do początkowej puli analizowanej sekwencji w badanej próbce przed reakcją (podwujna w każdym cyklu reakcji PCR). W praktyce obserwuje się niewielkie różnice w ilościach powstałych produktów końcowych ze względu na osiągnięcie plateau w kinetyce reakcji.
Niewielkie różnice w ilościach powstałych produktów końcowych spowodowane są: -zużyciem starterów i nukleotydów, -spadkiem aktywności polimerazy, - konkurencyjną pomiędzy starterami a produktem o matrycę
W reakcji PCR w czasie rzeczywistym wyróżnia się 3 różne fazy: pierwsza obejmująca na wykresie slabe fluktuacje odpowiadające sygnałowi tła, druga ekspotencjalna faza z wykresami wzrastającymi równolegle i trzecia faza, gdzie wykresy osiągają „plateau”.
SYBR GREEN -jest fluorochromem emitującym światło tylko w przypadku związania do dwuniciowego DNA.
SONDY :
MOLECULAR BEACONS
-struktura typu szpilki do włosów
-maksymalna długość 40 nukleotydów
- sekwencja komplementarna na obu końcach o długośći 4-7 n-t
- może być wykorzystywana jako sonda do hybrydyzacji Southern
- może być wykorzystywana do RT-PCR
SONDA FRET ( Fluorosence Resonance Energy Transfer)
FRET opiera sie na transferze energii do fluorofora będącego donorem do fluorofora będącego akceptorem.Głowne założenia systemu Fert sa następujące: cząsteczki donora i akceptora musza być bliskiej odległości (najczęściej 10-100 A) spektrum absorpcji akceptora musie się nakładać ze spektrum emisji fluorescencji donora
SONDY TYPU SKORPION - składają się one ze specyficznej sekwencji sondy oraz struktury szpilki. W przeciwieństwie do systemów Molecular beacons, FRET, TaqMan metoda skorpion oprócz starterów nie wymaga osobnej sondy.
SONDA MGB Minor Groove Binder ( przyłączająca sie do mniejszej bruzdy DNA) jest małą cząsteczką w kształcie półksiężyca , który dokładnie pasuje do mniejszej bruzdy dupleksu DNA. W sondach TaqMan grupa MGB jest przyłączona do końca 3' razem z barwnikiem wygaszającym.
SONDA TaqMan to oligonukleootydy projektowane specyficznie do badanej sekwencji. Oligonukleootyd ten jest wyznakowany na dwóch końcach. Koniec 5' zajmuje barwnik reporterowy (zwykle FAM, VIC) .Na końcu 3' znajduje się wyciszacz - barwnik fluoroscencyjny ( sondy TaqMan TAMRA ) lub optycznie obojętny ( sondy TaqMan MGB ) Koniec 3' sondy TaqMan jest dodatkowo fosforowany , tak aby uniemożliwić polimerazie DNA rozpoczęcie elongacji z tego miejsca . Wielkość sondy umożliwia przekazanie z jednego energii i fluorochromu na drugi. Sonda taka jest degradowana przez polimerazę Taq posiadającą aktywność 5' -egzonukleazową na etapie wydłużana , przez co fluorochrom ulega oddzieleniu od wygaszacza.Rozdziała obu cząsteczek umożliwia emisję światła fluorescencyjnego przez fluorochrom wzbudzany światłem o danej długości fali .
WADY Real Time PCR ze znakowanymi sondami:
-wyższa czułość reakcji, detekcja >10 koji
-specyficzność- detekcja tylko specyficznego produktu reakcji
-możliwość przeprowadzenia multipleks PCR- można stosować kilka barwników
-konieczność syntezy sond
-specyficzne programy do projektowania sond
ZALETY Real Time PCR
-brak elektroforezy
-wysoka szybkość 9 od 30 min do 2 godz.)
-Większa dokładność
-szerszy zakres wykrywanych i mierzonych ilości amplikonun
- możliwość potwierdzenia specyficzności produktu reakcji
AMPLIKACJE czyli najczęstsze zastosowania
1)jakościowe oznaczenie DNA( plus/ minus)
-Bakterie/wirusy/geny/ DNA
2)ilosciowe oznaczenie Dan ( gDNA, cDNA)
-Bakterie/ wirusy
-ekspresja genów
-translokacje
-Duplikacje/ delecje
-transgeny- ilość kopi
-detekcjeGMO
BADANIE POZIOMU EKSPRESJI GENÓW
Jedna z powszechniejszych zastosowań metody jest badanie poziomu ekspresji genów. Real Time PCR daje możliwość niezwykle dokładnego oznaczenia ilości mRNA ( przepisanego na cDNA) W badaniach ekspresji genów nie określamy ilości kopi , a ilość mRNA w odniesieni do innej próbki. Np. sprwadzamy ile razy wiecej mRNA danego genu znajdującego się w próbce pochodzącej od chorego w porównaniu z próbką zdrowego. Porównane są wartości Ct obu próbek i na tej podstawie obliczana jest relacja poziomu ekspresji.
- wykryto nadekspresję 19 genów u ostryg Crssostrea virginica i C gigas zarażonych patogenem pierwotniaka w porównaniu z ekspresja tych samych genów u osobników zdrowych
- badanie nad ekspresja kilku genów mających ważne znaczenie w utrzymaniu tolerancji na zasolenia u topoli Poputus euphratica
- ocena liczebności rożnych gatunków w próbach zawierających rózne DNA
Kluczem jest zaprojektowanie odpowiednich priomerów i sondy TaqMan, które obejmują konkretną translokację - będącą powodem nowotworu. Możliwe jest badanie na poziomie DNA, choć powszechniej stosuje się je na poziomie mRNA- pomimo różnego miejsca „pęknięcia chromosomu, produkt splicingu jest taki sam, co więcej jest wystarczająco krótki by zaprojektować krótki amplikon- umożliwiający wydajną reakcję PCR. Dzięki wybraniu kilku miejsc polimorficznych dla dawcy i biorcy (różnica sekwencji, nie długości fragmentu jak w dotychczasowych badaniach mikrosatelit), możliwe jest wykrycie minimalnych ilości DNA dawcy.
BADANIE DAWKI GENU:Badanie polega na sprawdzeniu ilości kopii pewnego genu podejrzanego o mutacje, i porównanie jego wartości Ct z genem referencyjnym, występującej w jednej kopii na chromosomie. Jeżeli wartości Ct obu genów są identyczne, ilość ich kopii w genomie jest jednakowa. Jeżeli różnią się - w zależności od tego ile, można ocenić ilość kopii genu badanego.
ZWIERZĘTA TRANSGENICZNE:Poprzez porównanie ilości kopii transgenu w kolejnych pokoleniach np. myszy a ilością kopii genu referensyjnego, można ocenić czy osobniki są dzikie, homo czy heterozygotyczne pod względem badanego transgenu.
GMO: Real-time PCR jest również wykorzystywany w badaniu żywności. Określenie procentowej zawartości GMO (modyfikowanych genetycznie roślin) w produktach żywnościowych to jeden z wymogów Unii Europejskiej.
MIKROMACIERZE- ANALIZA EKSPRESJI GENÓW: Różne nazwy : DNA microarrays, DNA arrays, DNA chips, gene chips. Mikromacierze są jednym z najnowszych osiągnięć w dziedzinie eksperymentalnej biologii molekularnej;
pozwalają na monitorowanie ekspresji tysięcy genów równolegle i produkują ogromne ilości danych,
aktualnie celem badań genomicznych jest przestawienie się z sekwencjonowania na wykorzystanie sekwencji genomu do zrozumienia sposobu jego funkcjonowania.
Dane zawarte w macierzach ekspresji genów mogą być analizowane na 3 poziomach (analiza jest w tej chwili wąskim gardłem tej technologii):
pojedyńcze geny- próbuje się ustalić czy rozpatrywany gen (w izolacji od pozostałych) zachowuje się odmiennie w warunkach szczególnych i kontrolnych,
wiele genów- grupy genów sa analizowane pod względem wspólnej funkcjonalności, wzajemnego oddziaływania i regulacji,
na trzecim poziomie podejmowane są próby wnioskowania o (nieznanej) sieci powiązań genów i białek, która leży u podstaw obserwowanych wzorców.
Technologia wykorzystuje zdobycze analizy sekwencji stworzone w ramach projektów analizy genomów w celu odpowiedzenia na pytanie: Które geny są aktywne w konkretnym typie komórek organizmu, w danym momencie, w określonych warunkach ?np. porównanie profili ekspresji genów pomiędzy zdrową i chorą komórką. MIKROMACIERZ jest zwykle szklaną płytką na której cząsteczki DNA są przytwierdzane w ustalonych miejscach, -nawet rzędu dziesiątek tysięcy punktów, z których każdy zawiera ogromną liczbę identycznych cząsteczek DNA (łańcuchów o długości od 20 do kilkuset nukleotydów), -w celu wykorzystania do analizy ekspresji genów, każde położenie powinno zawierać jeden gen lub eksongenomu (w praktyce nie zawsze łatwe do osiągnięcia).
SPOSOBY WYKORZYSTYWANIA TECHNOLOGII MIKROMACIERZY DO POMIARÓW EKSPRESJI GENÓW. Jedno z najpopularniejszych zastosowań pozwala na porównanie poziomów ekspresji genów w dwóch różnych próbkach np. tego samego typu komórki w stanie normalnym i patologicznym.
RODZAJE MIKROMACIERZY: Macierze z komplomentarnym DNA (cDNA)
użyte w nich kwasy nukleinowe (łańcuchy nukleotydów) są produktami PCR uzyskiwanymi w procesie replikacji za zbiorów cDNA.
kwas nukleinowy na powierzchni płytki umieszczany jest poprzez maszynowe nakrapianie.
są to macierze różnicowe.
MACIERZE OLIGONUKLEOTYDOWE: -synteza in situ przez fotolitografie, -na macierzach umieszczone są krótsze łańcuchy oligonukleotydów (zwykle około 25 par baz, ale może być nawet 50-70), a każdy gen jest reprezentowany przez wiele oligonukleotydów, -fragmenty DNA są tak dobierane, aby była jak najmniejsza reaktywność krzyżowania z innymi genami a przez to nieswoista hybrydyzacja będzie zminimalizowana (ale i tak występuje=> druga sekwencja ze zmienioną środkową bazą).
MACIERZE RÓŻNICOWE:
Pełne mRNA z komórek w dwóch różnych warunkach (stanach) jest wydobywane i etykietowane (w rzeczywistości syntetyzowane są pojedyncze komplementarne łańcuchy DNA) dwoma różnymi fluorescencyjnymi barwnikami.
Oba ekstrakty są następnie rozprowadzane na powierzchni mikromacierzy; zabarwione produkty genowe łączą się z komplementarnymi sekwencjami w punktach. Barwnik pozwala następnie na zmierzenie ilości dowiązanych próbek w poszczególnych punktach (poziom fluorescencji po wzbudzeniu laserem); przykładowo jeżeli RNA z próbki stanu normalnego jest liczniejsze wówczas punkt będzie zielony, jeżeli jest odwrotnie będzie czerwony; jeżlei RNA z obu próbek jest równoliczne wówczas punkt będzie żółty, a jeżeli żadne nie występuje- czarny.