Wykład II 9. 10.2000

Ostatnim razem doszliśmy do procesu translacji. Zreplikowaliśmy DnaDNA, poddaliśmy go transkrypcji, poddaliśmy go następnieobróbce prowadzącej do powstania transkryptu i doprowadziliśmy do obróbki potranslacyjnej. posttranslacyjnejWyprowadziliśmy go z jądra i doprowadziliśmy go do cytoplazmy na rybosomy. Rozpoczyna się pierwszy etap biosyntezy białka, dla większości białek, nie ostatni. O modyfikacjach wykreślzajmiemy się następnym razem. Aminokwasy, które wyznaczają pierwszorzędowapierwszorzędową strukturę białka, nie maja żadnym powinowactw nie mają żadnego powinowactwado kwasów nukleinowych, muszamuszą używać pośrednika, którym jest aminoacylo - tRNA. To są cząsteczki niewielkie tRNA z połączonym aminokwasem) liczące około 80 nukleotydów, cechujące się występowaniem zarówno miejsc dwuniciowych oraz czterech sekwencji jednoniciowych. Ważne jest to, że występują tu pewne zmodyfikowane zasady (w pętli D występuje dihydrourydyna, w pętli T psi( C rybotymidyna (tymina nie występuje normalnie w RNA) i modyfikacje te występują na etapie posttranskrypcyjnej modyfikacji tRNA. Najistotniejsza jest pętla antykodonowa, która asocjuje odpowiedni kodon znajdujący się w mRNA. Na 3` końcu cząsteczki tRNA następuje przyłączenie aminokwasu, który jest przyłączony wykreśldo grupy hydroksylowej adeniny przez swoja grupę karboksylową. Ta struktura nosi nazwę aminoacylo - tRNA. W takiej formie aminokwas zdąża na rybosom aby w konsekwencji procesu translacji utworzyć łańcuch polipeptydowy. Ale to nie jedyna funkcja tRNA uczestniczy w :tRNA Oto innewykreśl:

• rybosomalna biosynteza białkarybosomalnej biosyntezie białka

• u roślin i organizmów Prokariotycznych bierze udział w syntezie siany komórkowejprokariotycznych uczestniczy w syntezie ściany komórkowej

• synteza chlorofilusyntezie chlorofilu

• synteza fosfoguanozynysyntezie fosfoguanozyny

• transport aminokwasówtransporcie aminokwasów

• u bakterii gram - ujemnych bierze udział w syntezie lipopolisacharydów (endotoksyny bakterii tychtych bakterii)

• degradacja białekdeegradacji białek

• primer odwrotnej jest primeremtranskryptazy (synteza primerów dla polimerazy DNA RNA zależnej)

Możliwość mutacji w tRNA prowadzi do wytworzenia białka supresorowego (tRNA lekceważy kodony nonsensowne stop).

Dla naszych dlaszychdalszych rozważań ważne są trzy punkty kontaktowe w cząsteczce, która jest rybosomurybosom. Miejsce A, P, E. Do miejsca oznaczonego jako A przyłącza się aminoacylo tRNA z wyjątkiem pierwszego. W miejscu P znajduje się peptydylo tRNA ( tRNA z przyłączonym narastającym polipeptydem). I wreszcie miejscmiejsce E , które zajmuje epptydylo tRNA przed wyjściem z rybosomu. Inicjacja procesu translacji rozpoczyna się od zajęcia przez pierwszy aminoacylo tRNA, który którymu EukariotówEukariota jest metionylo tRNA, a u Prokariota formylometionina. Kodon rozpoznawalny jest ten sam. Ten pierwszy aminoacylo tRNA zajmuje miejsce P, a nie miejsce A. Po zajęciu miejsca P, do miejsca A przyłącza się kolejny aa tRNA (aminoacylo tRNA). Do akcji wkracza enzym transferaza peptydylowa. Jest to enzym syntetyzujący wiązanie peptydowe, które jest tworzone między grupa karboksylową narastającego peptydu a w przypadku pierwszego pomiędzy metionylo tRNA a grupą aminową przyłączonego w pozycji A aatRNA. Narastanie peptydu następuje od końca N do końca C. Zawsze dawca dawcągrupy karboksylowej jest peptydylo tRNA (w przypadku pierwszego metionylo tRNA) a da2wcądawcą grupy aminowej aminokwas przyłączony w miejscu A do tRNA. W naszym konkretnym przypadku po zadziałaniu transferazy peptydylowej powstał nam dipeptyd zbudowany z metioniny i jakiegoś drugiego aminokwasu, który okupujezajmuje miejsce A rybosomu. Do akcji wkracza kolejny enzym translokaza, przesuwa naszenasz dipeptydylo tRNA w miejsce P. Miejsce A ulega zwolnieniu i znowu przyłącza się jakiś aatRNA. Proces ten przebiega do pojawienia się kodonu nonsensownego i wtedy czynniki terminujące translacje doprowadzają do odłączenia powstałego peptydu z rybosomu.

Inhibitory translacji

1. Czynniki hamujące inicjację

• trimetoprim (spotkaliśmy się z nim ostatnio) inhibitor reduktazy kwasu foliowego, uniemożliwia powstanie MA4. Grupa formylowa jest przenoszona przez tetrahydrofolian, czyli nie powstaje formylometionylo tRNA (tylko u bakterii) i nie może rozpocząć się translacja. Poznany już jako inhibitor replikacji, transkrypcji i teraz hamowanie wykreśl wstaw a takżeinicjacji translacji

• Antybiotyki aminoglikozydowe (bardzo szeroko stosowana grupa antybiotyków)

Gentamycyna

Tobramycyna

Anitacyna

Hamują inicjacje translacji, co prawda powstaje formylometioninoformylometionylo tRNA, ale nie może przyłączyć się do rybosomu

1. Czynniki hamujące elongacje

• Antybiotyki aminoglikozydowe; hamują przyłączanie się kolejnych aatRNA do rybosomu lub powodują błędny odczyt

• Tetracykliny (doksycyklina doxycyklineznana także wibramycyna) hamuje przyłączanie aatRNA do rybosomu czyli nie może wydłużać się łańcuch polipeptydowy, natomiast nie zaburza procesu inicjacji.

• Chloramfenikol i cykloheksymid są inhibitorami transferazy peptydylowej, przy czym chloramfenikol działa na rybosom bakteryjny, a cykloheksymid na Eukariota. eucariotaChloramfenikol jest bardzo toksycznym antybiotykiem, rzadko obecnie stosowany, głowniegłównie w salmonellozach, durze brzusznym, orazwykreśl w schigellolozach (czyli czerwonce bakteryjnej) oraz ma silne działanie dla szpiku kostnego. Cykloheksymid nie znalazł zastosowania diagnostycznego, natomiast jest stosowany w badaniach biochemii komórki

• Antybiotyki makrolidowe erytromycyna, czy tewykreśl dawercyna oraz toksyna błonicza są inhibitorami translokazy (enzymu umożliwiającego przemieszczenie peptydylo tRNA z miejsca A do P). Działają na rybosom bakteryjnychbakteryjny, natomiast toksyna błonicza na rybosom Eukariotycznyeucariotyczny. Błonica to choroba bakteryjna, wywoływana przez maczugowca błonicy (obecnie choroba ta już nie występuje z powodu masowych szczepień), wydzielana toksyna przez przez niegoniego uszkadzała miesień sercowy

2. Inhibitory terminacji

• puromycyna analog tyrozynylo tRNA i udaje takie tRNA, do którektórego przyłączana jest tyrozyna, kończy biosyntezę białka

Zsyntetyzowaliśmy łańcuch polipeptydowy, który ulega modyfikacjom wewnątrz i zewnątrzkomórkowychzewnątrzkomórkowym

Metodologia badania genomu człowieka.

Genom człowieka jest trudny do badania ze względu na jego wielkość (escherichia coli ma 4500 genów, natomiast genom ludzki 80000 genów). Cechy genomu człowieka:

• gęstość genów (czyli ilość genów przypadająca na jednostkę długości DNA, a tą jednostka długości jest ilość par zasad. Gęsto upakowane są geny w mitochondrium, natomiast w gnomiegenomie jądrowym geny są rozsiane

• wielkość genu: różna z reguły od 10 do 15 tysięcy par zasad (kb)

• odstępy międzygenowe (speceary) w granicach 25 - 30 kb

• zróżnicowanie w ilości egzonów: są geny proste np. kodujące tRNA zawierające jeden egzon, największy znany gen człowieka zawiera 79 egzonów (największy gen u człowieka kodujący białko dystrofina zwany jako dmd - Dystrofia Mięśniowa Duchennadystrofia mięśniowa Duchenna) wielkość egzonyegzonu wynosi około 70 pz i z reguły zależy od wielkości genu. Największy znany egzon człowieka występuje w genie kodującym białko ApoB - apolipoproteina, białko osocza - wielkość tego egzonyegzonu wynosi 7600 pz.

• Zróżnicowanie w wielkości intronu - jego wielkość zależy dood wielkości genu - największy leży w genie dmd i długość jego wynosi 30 000 pz (natomiast całego genu dmd 2 500 000 pz)

Organizacja genomu człowieka. Genom człowieka dzielimy na jądrowy (99%) i mitochondrialny (0,2%), w którym występuje 37 z 80 000 genów. Znacznie mniejsza cześć stanowią geny, które kodują, około 30% to DNA kodujący, pozostała cześć 70% tworzy pozagenowy DNA. W kodującym DNA geny zajmują 10% natomiast większość to sekwencje niekodujące czyli introny. Pozagenowy DNA tworzy tzw, sekwencje unikatowe (80%) a 20% stanowią sekwencje powtórzone. Sekwencje powtórzone dzielimy na dwie frakcje: sekwencje zgrupowane i rozproszone. Warto pamiętać, że geny człowieka maja charakter nieciągły ( geny ciągłe w mitochondrium i kodujące histony, oraz większość małych genów, geny niektórych receptorów hormonalnych; receptor dopaminergiczny typy 1 i 5 oraz receptor dla bradykininy typu 2, gen kodujący interferon alfa.

Sekwencje powtórzone dzielimy na sekwencje zgrupowane zwane jako satelity DNA. Jednostka ulęgającaulegająca powtórzeniu liczy 200 do 5000 pz, nie mająma znaczenia w diagnostyce molekularnej (śluzasłuży do identyfikacji chromosomów) i rozproszone ważne w biochemii znanezwane jako mini i mikrosatelity Jednostka powtarzalna to 7 - 100 par zasad. Najbardziej ciekawą struktura strukturąsą mikrosatelity obejmujące jednostki powtarzające się od 1 do 6 par zasad, najważniejszenajważniejsza jest sekwencja 3 - 4 par zasad powtórzeń, funkcja nie znana, występują poza genami, nie kodują białka, ale mogą ulec transkrypcji z genem, możliwość funkcji; stabilizacja transkryptu, przez działaniem enzym nukleolitycznych. Metodologią do badania mikrosatelitów jest technologia STR (Short Tandem Repet short tandem repeat, krótkie powtórzenia tandemowe). Służą do diagnozowania mutacji genowych (w wyniku ich sprzężeń z genem wyłącznie na podstawie sekwencji mikrosatelity). U niektórych osób mikrosatelity mogą zanikać, jednostką chorobową w której bada się polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych jest rak jelita grubego (jelito usiane polipami - stan przedrakowy polipy ulęgają transformacji nowotworowej). Ryzyko wystąpienia tego zaburzenia można określić badając krótkie sekwencje tandemowe.

Badania DNA kodującego

Problem w badaniach wynika z małej ilości DNA w komórce. Najstarszymi (nadal używanymi) jest badanie DNA niezamplifikowanego. Mało materiału więc musi istnieć wzmacniacz, który wykrywa tę cząsteczkę DNA. Musimy uciec się do hybrydyzacji związanej ze strukturą sondy molekularnej. Sonda molekularna jest znakowana, jeśli napotka komplementarny fragment łańcucha polinukleotydowego następuje przyłączenie się do łańcucha . Dawniej używane były izotopy promieniotwórcze jako znaczniki, wykrywane następnie metoda autoradiografii i sprawdzano na kliszy fotograficznej, czy dany fragment genu został wykryty czy tez nie. Obecnie używane znaczniki to znaczniki fluororescencyjne, co nie wymaga używania promieniowania jonizujacego. Postęp rozwoju diagnostyki molekularnej był możliwy dzięki rozwojowi techniki zwanej amplifikacja DNA, co pozwala na uzyskanie DNA w ogromnej ilości kopii. Może ona być stosowana in vivo (klonowanie), do tego celu naszymi niewolnikami są bakterie, które tresujemy w taki sposób, aby z własnym chromosomem bakteryjnym replikowały w kolejnych cyklach wprowadzony przez nas DNA w formie wektora plazmidowego (bakteria odtwarza nasze DNA).

Metoda PCR (amplifikacja genu in vitro - Reakcja reakcjałańcuchowej polimerazy Polimeraze Change Reacion). Polimerase Chain ReactionPierwszy etap to hybrydyzacja sondasondą molekularną. Dawnej stosowane były metody hybrydyzacji w roztworach. Obecnie stosuje się metody stałe. Pieśń ostatnich lat to technika FISH (Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ), co oznacza, że celem przeprowadzenia reakcji nie musimy izolować DNA z komórki, tylko operować preparatem cytologicznym działamy sondą molekularną, która na poziomie chromosomu wykrywa allel lub sekwencję poszukiwaną i informuje nas o tym świecąc.

Hybrydyzacja informizowanego DNA (technika zwana blokingiem). blottingBlokingBlotting to transfer DNA na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy i związane są z tym trzy pojęcia (2 związane z transferem kwasów nukleinowych a jedno z transferem białek)

1. Northern bloking Northern blotting(materiałem przez nas poszukiwanym jest RNA, przenoszony jestwykreśl na odpowiedni filtr i następuje hybrydyzacja sonda molekularną, którą jest znakowany DNA. Skoro mamy mRNA to wiemy że mamy transkrypt, ale chcemy się dowiedzieć, czego to jest transkrypt (szukamy odpowiedzi na pytanie jakiego genu nastąpiła ekspresja)

2. Southern blokinblottingg to technika w której izolujemy na filtrze DNA i hybrydyzujemy go również sondą DNA (badanie prowadzimy na genie) jest to technika szeroko stosowana m. In. W celach identyfikacji osób. Proces i obróbka prowadzi do powstanie prążków, które są rozpoznawane metoda metodąautoradiograficzną. Technika używana w analizie osobniczej jako Finger Priting (badanie typu odcisk palca), każdy ma charakterystyczny układ prążków.

3. Western bloking Western blottingto technika polegająca na przeniesieniu na podłoże stałe rozdzielonych elektroforetycznie białek, ale na podstawie masy cząsteczkowej nie można odpowiedzieć co to jest za białko, faktycznym badaniem jest zadziałanie przeciwciałem monoklonalnychmonoklonalnym wykrywającym daną sekwencję aminokwasową (brak hybrydyzacji) - to nie technika badania kwasów nukleinowych

Metody amplifikacja DNA

1. Metoda klonowania (nie zajmujemy się tym na biochemii - celem jest uzyskanie całego fragmentu genu, lub całego genu)

2. Technika PCR ograniczenie techniki PCR polega na ograniczeniu fragmentu amplifikowanego DNA do 5 kb (5000 par zasad), DNA wkładamy w plazmid, plazmid w bakterie która w czasie kolejnych podziałów odtwarza nasz fragment DNA, wyciągamy go następnie z bakterie, oczyszczamy z białka i uzyskujemy pochodne (insulinę, czy inne hormony). W laboratorium wykorzystujemy urządzenie zwane termoblokiem (do obejrzenia na ćwiczeniach). Technika nagrodzona nagrodą Nobla w 1993 pan Mullis

Etapy PCR

1. Wyizolowanie DNA (wystarczy DNA z jednej komórki) w przeciwieństwie do technik hybrydyzacyjnych wystarczy 50 do 100 razy mniej DNA

2. Denaturacja w komórce odbywa się podobny proces podobnie jak proceskatalizowany przez enzymy, my wykorzystujemy temperaturę. Konieczna jest znajomość sekwencji nukleotydów w amplifikowanym fragmencie genu

3. \Wprowadzenie primera (fragmenty składające się do 30 nukleotydów), by przyłączyły się do DNA musimy znać sekwencję flankującą. Konieczne są dwa startery, enzym: polimerazępolimeraza DNA i cegiełki czyli trójfosforany dezoksyrybonukleotydów, odpowiedni bufor

4. Zwielokrotnienie analizowanego DNA (amplifikacja), który można wykryć techniką elektroforetyczną albo urządzenie gene qant wykreśl - wstaw spektrofotometr”czinguanta”, które pokazuje nam ile powstało zamplifikowanego DNA

Denaturacja występuje w 95 stopniachnastępuje podczas ogrzewania w 950C, wtedy nici DNA oddzielają się do siebie, aniling czyli dołączanie starterów, i w procesie anilingu następuje dołączanie starterówkażdy KażdyDNA ma określoną temperaturę topnienia i temperatura anilingu jest eksperymentalnie dobierana iwykreśl wynosi 5 stopni mniej od temperatury topnienia. Temperatura denaturacji zależy od długości łańcucha, im łańcuch ddłuższydłuższy tym więcej energii potrzeba, od składu zasad czylui procentiowego czyli procentowegoudziału par GC (para GC jest związana trzema wiązaniami wodorowym więc należy więcej przyłozyć dostarczyćenergii, im więcej par GC, tym temperatura topnienia wyższa), od śropdowiskaśrodowiska chemicznego. Głównym czynnikiem stabilizującym sa sąjony sodu, natyomiastnatomiast czynnikiem desbuilizujacymdestabilizującym jest głównie mocznik.

Głównym produktem reakcji PCR jest nasz zamplifikowany materiał z niewielką domieszką niewłasiwieniewłaściwie wydłużanych sekwencji DNA. Jakie jest ograbniczenie tej metiodyograniczenie tej metody: musimy znać sekwencje genów flankujące (co nie jest potzrbnepotrzebne w klonowaniu), wielkość amplifikowanego fragmentu DNA (nie może przekraczać 5000 par zasad), polimeraza popełnia błędy ( po dwudziestu obrotach reakcji PCR w 40% zamplifikowanych tam odcinków DNA sa błedysą błędy. Dlaczego tak się dzieje: polimerazy DNA ( poza dwoma) nie posiadaja posiadająaktywności 3` - 5` nukleazy, która sprawdza, czy nukleotyd został wprowadzony poprawnie, ale ponieważ w kolejnych czasteczkach cząsteczkachDNA, zbudowanie nieprawidłowego nukleotydu nastepujenastępuje w sposób losowy, a nie w miejscu nieprawidłowego, dlatego w dalszej analizie sekwencyjnej nie ma to większego znaczenia, ale czestośćczęstość pomyłek jest w POCR barsdzo PCR bardzoduża. Najbardziej hitorycznahistoryczna polimerazą w PCR jest fragment Klenowa polimerazy I, ale ten enzym ma to ograniczenie, że jest enzymem ternmolabilnym, a poniewą zreakcje termolabilnym, a ponieważ reakcjęprzeprowadzamy w zmiennej temperaturze, dochodzącej do 95 stopnir95 stopni, to czasem dochodziło do denaturacji enzymu, który tyrzebatrzeba było uzupełniać (duże koszty). Wykorzystano polimerazy pochodzące z ogranizamóworganizmów żyjących w goracych gorących wodach “Termus aquititusThermus aquiticus”, stata najczęściej używana polimerazą jest polimeraza TAQ. Inne używane sa rzadziej; polimeraza VENT i TRU niestety bardzo kosztowne posiadające aktywność 3` - 5`, czyli sprawdzają, czy prawidłowo włączyły nukleotyd do syntetyzowanej nici, natomiast korzyściakorzyścią zastosowania polmerazy polimerazyBSD jest możliwość synetyzowaniasyntetyzowania bardzo długchdługich łańcuchów dochodzacychdochodzących do 7000 par zasad.

Co robimy jeśli nie mamy pieniędzy na polimerazę BSD a sekwencja nukleotydów jest bardzo duża, to wtedy amplifikujemy poszczególne fragmenty genu, dzieląc je tak, by zachodziły one na siebie, w ten sposób można zamplifikować bardzo długi fragment ( do badań)

ZasosowanieZastosowanie techniki PCR:

• wykrywanie mutacji

• diagnostyka molekularna

Metody uzyweaneużywane w wykrywaniu muracjimutacji dzielimy na dwie kategorie: pierwszej uzywamy używamyjeśli szukamy nieznanej mutacji, metody screningowe, które maja odpowiedzieć na pytanie czy w analizowanym genie wystapiła mutacja, jeśli mutacja zaszła, musimy odpowiedzieć na drugi drugie pytanieepytanie, na czym dana mutacja polega, czyli ją identyfikujemy, i jeśli ona często występuje to wyszukujemy nowej, taniej metody do wyszukiwania tej mutacji w całej populacji (wtedy w badaniu pomijamy screnning)

Metody używane w diagnostyce mutacji (najwazniejszenajważniejsze)

1. PCR HD

2. PCR SSCP

3. PCR DGGE

Dwie następne rzadko wykonywane PCR CCB, PCR PTT oraz sekwnecjonowanie sekwencjonowanie( do obejrzenia na filmie)

PCR HD (PCR hetero duplexheteroduplex) po reakcji PCR doprowadzamy do denaturacji produktu PCR, a następnie doprowadzamy do renaturacji, nici łącza się ze sobą w sposób losowy. JerślJeślii osoba jest heterozygotą (czyli w jednym genie wystąpiła mutacja) wówczas może mieć takei następujące możliwości; albo połącza połącząsię dwie nici prawidłowe, albo połącza połącząsię dwie nici zmutowane, trzecie możliwość to mozliwoścmożliwość połączenia się jednej nici prawidłowej i jednej zmutowanej: ta możliwość to heteroduplex. Mieszanine mieszaninępoddajemy elektroforezie, obserwujemy tu, że heteroduplexy najwolneij najwolniejmigruja w polu elektrycznym. Ograniczenie metody: jesl;jeślii fragmenty maja powyżej 200 pz, to skuteczność metody ulega obniżeniu, przy 200 pz dokładność wynosi 95%, wykrywa mutacje punktowe ale nie wykrywa miejsca mutacji, jeśli mamy do czynienia z homozygota zmutowaną, to by tę mutację wykryć do układu musimy wprowadzić zmodyfikowany allel dziki, w ten sposób powstaje możliwość wystąpienia heteroduplexu (bo w warunkach homozygoty elektroforeza odbywa się z jedna z jednakową szybkością).

PCR SSCP (PCR single strant conformation polimophizmsingle strand conphormation polymorphism) czyli polimorfizm fragmentów jednoniciowych. Mamy zamplifikowany produkt, który poddajemy denaturacji uzyskując fragmenty jednoniciowe, które sasą rozdzielane elktroforetycznieelektroforetycznie w warunkach żelu niedenaturującego. Nasze fragmenty w tych warunkach mogą wykazywacwykazywać pewne wewnetrzne wewnętrznesparowania, jeśli nastapi nastąpitu mutacja, to konformer przyjmie innainną konformacją, w związku z zcymz czym w warunkach żelu niedenaturującego jedojego ruchliwość elktroforetycznaelektroforetyczna, będzie zalezała zależałaod dwóch czynników; masy czasteczkowej i klonformacji cząsteczkowej i konformacjiprzestrzennej (zastosowanie żelu denaturującego z dodatkiem mocznika to następuje zerwanie wiązańbwiązań wewnętyrznychwewnętrznych a ruchliwośc ruchliwośćwewnętrzna zależy wtedy tylko od masy cvząsteczkowej, cząsteczkowejtak w przypadku mutacji punktowej ulega tylko niewielkiej zmianie). Jeśli ulega wypadnięciu duża częśc częśćnaszego genu to wpływa znacznie na masę cząsteczkową, to do takiej metody nie musimy się uciekać, tylko dokonyujemydokonujemy zwykłej elektroforezy. Właściwości podobne do heteroduplex, wielkość do 200 par zasad, wykrywa mutacje punktowe i nie wykrywa miejsca mutacji

PCR DGGE (denaturating gradient gel eletrochoreziselectrophorezis) elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego. Fragmenty dwuniciowe rozdzielamy elektroforetycznie, a żelu wytwarzamy gradient, chemiczny lub temperaturowy. Nasz fragmetfragment dwuniciowy wędruje tak długo, aż natrafi na takie stęzeniestężenie czynnika denaturującego, który sporawiasprawia, że nici denaturujące się oddzielają i wtedy fragment dalej nie wędruje. Jeśli nastąpi mutacja, to wtedy nasz fragment zatrzumuje zatrzymujesię w innym punkcie niż się to dzieje bez mutacji. Jest trudniejsze do wykonania niż inne badania

Kolejna metoda jest kosztowna, nie uzuwana powszechnie a jej zalety: można analizować znacznie większe fragmenty do 1000 par zasad i dalej można się zorientować w którym miejscu nastapiła mutacja. W skrócie jest to CCM czyli chemical climage of mismatches czyli chemiczne trawienie miejsc zmutowanych. Jeśli nastapiła nastąpiła w jamikś w danympunkcie mutacja toi wykreślmożna to miejsce chemicznie zmodyfikować i to miejsce wykreślchemicznie strawić iwykreśl lokalizując w elektroforezie wiedząc jakojaka jest ruchliwość elktroforetyczna elektroforetycznafragmentu miożna możnapowiedzieć w którym miejscu wystąpiła mutacja. Metoda rzadko stosowana

Ostatnia metodą (niestosowana: cena i eksperymenty) jest metoda PTT (proteine translation test) wykrywająca białka niekompletnie syntetyzowane wskutek wystapieniawystąpienia w DNA mutacji nonsensownej. Nasz wyizolowany DNA przepuszcza się w układzie in vitro przez syntetyczny układ transkryptyczno - translycyjnytranslacyjny. W wyniku tego z naszego DNA otrzymujemy w układzie in vitro białko i analizujacanalizując go pod względem determinantówdeterminant antygenowych i masy cząsteczkowej możemy strwierdzić, stwierdzićczy białko powstało w wyniku mutacji, czy tez nie.

Sekwencjonowanie (skoro wiemy, że wystąpiła mutacja określamy kolejność zasad). Dwie metody

1. chemiczna - Maxama Gilberta (nie stosowana)

2. dideoksy czyli metoda Sangera. Do naszego układu wprowadzamy oszukańcze nukleotydy, z których usuwamy grupę hydroksylową w pozycji trzeciej, a wiemy, że polimaraza musi mieć wolną grupę 3` OH by móc prowadzić replikację, po wprowadzeniu fałszywego nukleotydu następuje terminacja replikacji. Proces prowadzimy w sekwenatorach ( na czterech ściezkach mamy cztery oddzielne elektroforezy, a przed tym mamy cztery niezależne robione PCR w kazdym z tych czterech PCR inny nukleotyd jest zmodyfikowany. W reakcji A wprowadzona jest andenina dideoksy, ścieżce C cytozyna i odpowiednio guanina i tymina. W momencie kiedy polimeraza chce wbudować taki nukleotyd nie wbuwowywuje go i rekacja staje (jak po Viagrze) i w wyniku rodziału elktroforetycznego fragmentu te zmo0dyfikowne nukleotydy mogą być znakowane znacznikiem fluororescencyjnym i tak zazwyczaj jest. Porównujemy go teraz z tzw biblioteką genów. wykreśl tekst i zamień:

3. a/ przygotowuje się mieszaninę inkubacyjną-która zawiera;matrycę w postaci jednoniciowego DNA, starter, polimerazę DNA I oraz wszystkie cztery trifosforany deoksyrybonukleotydów, z których jeden jest znakowany radioaktywnie.

4. B/ mieszaninę dzieli się na cztery porcje i do każdej z nich dodaje jeden z 4 dideoksyrybonukleozydów

5. C/ podczas inkubacji polimeraza DNA rozpoczyna kopiowanie cząsteczek matrycy wydłużając związany z nią starter.

6. D/ po inkubacji uzyskuje się 4 zestawy łańcuchów kończących się odpowiednim analogiem dideoksy w miejscach wyznaczonych przez dystrybucję C, T, A lub G w matrycy

7. E/ produkty każdej z mieszanin inkubacyjnych poddaje się elekroforezie w czterech równoległych ścieżkach żelu poliakrylamidowego a następnie autoradiografii

8. F/ sekwencję DNA określa się przez proste odczytanie obrazu pasm na autoradiogramie, poczynając od końca żelu do jego początku( tzn odczytując sekwencję DNA w tym kierunku, w jakim ona powstaje poczynając od startera)

9. G/ sekwencja odczytana bezpośrednio z żelu jest sekwencją łańcuchów nowo syntetyzowanych. Sekwencja ta jest komplementarna do sekwencji wyjściowej matrycy DNA

Wiemy już na czym polega mutacja. Mamy 1000 osób do przebadania na obecność mutacji. Bnie uzywamy Nie używamywtedy powyższych technik (bo byśmy zastosowanie techniki kosztownezbankrutowali). Mamy tu kilka metod:

1. PCR RFLP

2. PCR ASO

3. PCR ARMS

4. OLA

---