ĆWICZENIE 5
2.1. Identyfikacja 16s rRNAH. pylori.
2.1.1. Identyfikacja 16s rRNAH. pylori z próbek pobranych z jamy ustnej.
W ramach ćwiczenia 2 przeprowadzono reakcję PCR z zastosowaniem starterów specyficznych do fragmentu sekwencji 16srRNAH. pylori(351 pz)
Powstałe produkty będą analizowane w 1% żelu agarozowym rozdzielanym w 0.5x stężonym buforze TBE.
- Przygotować roztwór 1% agarozy w 0.5xTBE - 100ml/żel.
-Gotować roztwór do momentu całkowitego rozpuszczenia agarozy.
-Ostudzić roztwór w temperaturze pokojowej (aby możliwe było utrzymanie kolby z roztworem w ręce).
- Dodać bromek etydyny - końcowe stężenie 5 µg/ml.
- Wymieszać i wylać żel, włożyć grzebień.
- Po zestaleniu się żelu agarozowego umieścić go w aparacie w buforze 0.5x TBE.
- Dodać 5 µl buforu obciążającego do próbek.
- Nakładać po 15µl próbek do studzienek.
- Nałożyć marker DNA - 10 µl.
- Prowadzić rozdział przez 30 min., 85V.
- Oglądać żel w świetle UV (GelDoc).
Spodziewane wyniki:
W próbach kontroli pozytywnej powinno uzyskać się produkt o o odpowiedniej długości pz. W próbach izolowanych powinno się uzyskać/bądź nie produkt reakcji PCR. W próbie kontrolnej zawierającej wodę zamiast matrycowego DNA nie powinno uzyskać się produktu.
2.2. Analiza poziomu amplifikacji onkogenu Erb - ddPCR.
2.2.1. Zastosowanie reakcji ddPCR do identyfikacji ilości kopii onkogenu ERB.
(PhD thesis-Anna Żaczek 2004; Oncol Rep. 2002 Nov-Dec;9(6):1373-8. Genecopynumbers of erbBoncogenes in humanpheochromocytoma. Sworczak K, Zaczek A, Babinska A, Lisowska U, Bielawski KP, Falkiewicz B.)
Reakcja ddPCR została przeprowadzona dla onkogenu ERB2 z zastosowaniem dwóch genów referencyjnych - SOD oraz HBB z zastosowaniem DNA izolowanego z krwi ludzkiej. Uzyskane produkty należy rozdzielić w żelu agarozowym.
- Przygotować roztwór 2,5% agarozy w 0.5xTBE - 100ml/żel.
-Gotować roztwór do momentu całkowitego rozpuszczenia agarozy.
-Ostudzić roztwór w temperaturze pokojowej (aby możliwe było utrzymanie kolby z roztworem w ręce).
- Dodać bromek etydyny - końcowe stężenie 5 µg/ml.
- Wymieszać i wylać żel, włożyć grzebień.
- Po zestaleniu się żelu agarozowego umieścić go w aparacie w buforze 0.5x TBE.
- Dodać 5 µl buforu obciążającego do próbek.
- Nakładać po 20µl próbek do studzienek.
- Nałożyć marker 10 µl.
- Prowadzić rozdział przez 40 min., 100V.
Przykład amplifikacji genu ERB2zostanie przedstawiony.