Chromatografia (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze) to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania lub badania składu mieszanin związków chemicznych.
W każdej technice chromatograficznej najpierw rozdziela się badaną mieszaninę, a następnie przeprowadza się detekcję poszczególnych składników. Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną. Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące zdolności sorpcyjne lub zdolne do innych oddziaływań na substancje przepływające. Podczas przepływu eluenta (fazy ruchomej) przez fazę rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) substancji. Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny. Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie dłużej, a inne krócej, dzięki czemu może następować ich separacja. Czas przebywania danego składnika w kolumnie określany jest mianem czasu retencji.
W zależności od rodzaju eluentu czyli substancji w której rozpuszcza się badaną mieszaninę rozróżnia się następujące techniki chromatograficzne:
chromatografia cieczowa - w której eluentem jest ciekły rozpuszczalnik
chromatografia gazowa - w której eluentem jest gaz (zwykle wodór lub hel).
chromatografia nadkrytyczna - w której eluentem jest gaz w stanie nadkrytycznym.
W zależności od rodzaju i sposobu przygotowania fazy rozdzielczej:
TLC - thin layer chromatography, chromatografia cienkowarstwowa - w której fazę rozdzielczą stanowi cienka warstwa fazy stałej naniesiona na sztywną płytkę. Na tak spreparowaną płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania sił kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ i rozdział mieszaniny;
chromatografia bibułowa - w której fazę rozdzielczą stanowi pasek lub arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły chromatograficznej;
chromatografia kolumnowa - w której faza rozdzielcza jest umieszczona w specjalnej kolumnie, przez którą przepuszcza się następnie roztwór badanej mieszaniny. Przepływ roztworu przez kolumnę można wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;
chromatografia powinowactwa - w której odpowiednio spreparowana faza rozdzielcza jest zdolna do oddziaływań chemicznych o zmiennym powinowactwie wobec rozdzielanych substancji;
chromatografia jonowymienna - w której substancje oddziaływają ze złożem za pomocą oddziaływań jonowych.
W zależności od parametrów procesu:
HPLC - high performance/pressure liquid chromatography, wysokosprawna/ciśnieniowa chromatografia cieczowa - odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej z użyciem eluentu pod wysokim ciśnieniem;
FPLC - fast protein/performance liquid chromatography - szybka, białkowa/szybkosprawna chromatografia cieczowa - odmiana HPLC działająca na niższych ciśnieniach, stosująca prócz złóż sorpcyjnych, także zwykłe złoża typu sit molekularnych, służąca głównie do rozdziału białek i polipeptydów. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy Pharmacia;
UPLC - ultra performance liquid chromatography, ultrasprawna chromatografia cieczowa - odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej. Działa na wyższych ciśnieniach i mniejszych przepływach, a kolumny mają mniejsze ziarno (1,7 - 1,8 μm). Pozwala uzyskiwać krótsze czasy retencji i wyższe rozdzielczości. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy Waters.
TLC (ang. thin layer chromatography) - cienkowarstwowa chromatografia cieczowa - technika analityczna (rzadziej preparatywna), służąca do identyfikacji oraz oczyszczania mieszanin związków chemicznych.
Faza rozdzielcza, złoże, czyli faza stacjonarna o właściwościach sorpcyjnych (silikażel, tlenek glinu, rzadziej celuloza lub ziemia okrzemkowa) jest umieszczona jako cienka (do 0.01-2 mm) warstwa na płytce szklanej, aluminiowej lub wykonanej z tworzywa sztucznego.
Substancje rozdzielane nanosi się punktowo przy dolnej krawędzi płytki, po czym płytkę umieszcza się w komorze chromatograficznej zanurzonej na kilka milimetrów w eluencie, tak by naniesione substancje nie zostały zanurzone. Eluent stopniowo wspina się po płytce dzięki zjawisku kapilarnemu. Powoduje to przemieszczanie się rozdzielanych substancji ku górze. Prędkość ruchu poszczególnych składników rozdzielanej mieszaniny jest zależna od oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi obecnymi w analizowanej próbce, a fazą rozdzielczą i eluentem. Gdy czoło eluenta dotrze do górnej krawędzi płytki rozdział jest zakończony.
Zależnie od swojej natury fizykochemicznej - składniki rozdzielanej mieszaniny docierają w tym czasie na różną wysokość płytki (współczynnik Rf), a równomierność rozmieszczenia plam substancji można charakteryzować ilościowo tzw. funkcjami CRF (chromatographic response functions). W przypadku, gdy substancje nie są naturalnie barwne, ich obecność można stwierdzić używając, zależnie od ich właściwości, światła UV, roztworów wywołujących (w których płytka jest zanurzana lub nimi spryskiwana - reagują one specyficznie i barwnie z rozdzielanymi substancjami) lub innych metod (np. wywoływanie w parach jodu, piroliza).
W preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej stosuje się zazwyczaj grubsze warstwy fazy stałej (1 - 2 mm), a rozdzielone związki chemiczne zeskrobuje się z płytki razem ze złożem, po czym wymywa się je za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika.
BADANIE WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK
1.Reakcja biuretowa
ZASADA:
reakcja biuretowa Piotrowskiego jest reakcją służącą do wykrycia wiązania peptydowego. Do badanego roztworu dodaje się CuSO4 w środowisku zasadowym. W obecności jonów OH- jony Cu2+ tworzą z wiązaniem peptydowym kompleks o fioletowym zabarwieniu.
OBSERWACJE:
białko jaja kurzego: ciemnofioletowe zabarwienie
serwatka: granatowe zabarwienie
albuminy: fioletowe zabarwienie
WNIOSKI:
we wszystkich probówkach nastąpiła zmiana barwy, co świadczy o obecności wiązań peptydowych w analizowanych roztworach. We wszystkich przypadkach mamy do czynienia z białkami. Natężenie barwy zależy od stężenia białek w próbce.
2.Strącanie białek za pomocą kationów metali ciężkich
ZASADA:
w pH > pI cząsteczki białka stają się anionami i mogą reagować z kationami. Powstające sole dysocjują w różnym stopniu. Kationy metali ciężkich tj.: Fe3+, Cu2+, Hg2+, Pb2+ tworzą trudno rozpuszczalne sole o małej stałej dysocjacji. Białko pod wpływem wymienionych kationów ulega denaturacji, prawdopodobnie na skutek rozerwania mostków disiarczkowych.
OBSERWACJE:
dla: azotanu (V) ołowiu; azotanu (V) srebra
białko jaja kurzego: biały, galaretowaty osad; biały, galaretowaty osad
serwatka: biały, drobnoziarnisty osad; białe zmętnienie
albuminy: białe zmętnienie; białe zmętnienie
WNIOSKI:
we wszystkich probówkach pojawił się biały osad lub zmętnienie, co świadczy o obecności białek w analizowanych roztworach. We wszystkich przypadkach mamy do czynienia z powstawaniem soli metali ciężkich. Zmętnienie wynika z małego stężenia białek w badanej próbce.
3.Strącanie białek za pomocą anionów
ZASADA:
gdy pH < pI cząsteczki białka mają ładunek dodatni oraz zdolność reagowania z anionami. Niektóre kwasy organiczne dają trwałe, nierozpuszczalne połączenia z białkami i są stosowane jako odczynniki odbiałczające ciecze biologiczne. W większych stężeniach powodują denaturację białka.
OBSERWACJE:
dla 10% TCA; 20% kwasu sulfosalicylowego
białko jaja kurzego: biały, galaretowaty osad; biały osad
serwatka: białe zmętnienie; biały, kłaczkowaty osad
albuminy: białe zmętnienie; białe lekkie zmętnienie
WNIOSKI:
we wszystkich probówkach pojawił się biały osad lub zmętnienie, co świadczy o obecności białek w analizowanych roztworach, strącanych w postaci soli z anionami. Powstawanie niewielkiego zmętnienia wynikać może z małego stężenia białek w próbce.
4.Działanie stężonego kwasu azotowego
ZASADA:
duże stężenie jonów H+ powoduje cofnięcie dysocjacji grup - COOH, co prowadzi do rozerwania wiązań jonowych. Działanie stężonego kwasu powoduje również rozbicie niektórych wiązań wodorowych. Stężony HNO3 denaturuje i koaguluje białko. Na granicy faz (kwasu i roztworu białka) pojawia się biały krążek zdenaturowanego i skoagulowanego białka.
OBSERWACJE:
białko jaja kurzego: biały pierścień na granicy faz
serwatka: widać oddzielone dwie fazy klarowne
albuminy: biały pierścień na granicy faz
WNIOSKI:
we wszystkich probówkach pojawił się pierścień zdenaturowanego i skoagulowanego białka, co świadczy o tym, ze we wszystkich probówkach mam białka.
5.Działanie etanolu
ZASADA:
rozpuszczalniki organiczne (np. etanol) osłabiają oddziaływania hydrofobowe i dezorganizując płaszcz wodny cząsteczki białka, powodując wytrącenie białek. Działanie denaturujące etanolu objawia się przy wyższych stężeniach i w wyższej temperaturze.
OBSERWACJE:
zimny etanol; etanol (T pok)
białko jaja kurzego: biały osad; biały, gęsty osad
serwatka: zmętnienie; zmętnienie
albuminy: zmętnienie; zawiesina biała (osad nie rozpuszcza się po dodaniu wody)
WNIOSKI:
we wszystkich probówkach po dodaniu zimnego etanolu pojawił się biały osad lub zmętnienie, co świadczy, ze we wszystkich probówkach mam białka. Rozpuszczają się one po dodaniu wody, co oznacza, że białka zostały jedynie strącone, a nie zdenaturowane. W przypadku dodania ciepłego etanolu również wytrąciły się białe osady (bardziej lub mniej widoczne, zależnie od stężenia białka w próbce), nie rozpuszczalne w wodzie. Pod wpływem wyższej temperatury w obecności etanolu białka uległy denaturacji.1. Reakcje charakterystyczne aminokwasów/peptydów
1. Reakcja ninhydrynowa
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. 1% wodne roztwory: glicyny, L-proliny, peptydu
2. 1% roztwór ninhydryny w etanolu
3. Probówki zwykłe szklane
4. Pipety Pasteura
5. Łaźnia wodna
Wykonanie doświadczenia:
W czterech próbówkach umieścić odpowiednio po 1 mL roztworu: glicyny, L-proliny, peptydu oraz
wodę. Następnie do kaŜdej z czterech próbówek dodać po 1 mL roztworu ninhydryny i ogrzewać
we wrzącej łaźni wodnej przez 1 minutę. Zaobserwować zmiany zabarwienia.
2. Reakcja z kwasem azotowym(III) van Slyke'a
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. 1% wodne roztwory: glicyny, peptydu
2. 10% roztwór NaNO2
3. 2 M roztwór CH3COOH
4. Probówki zwykłe szklane
5. Pipety Pasteura
Wykonanie doświadczenia:
W trzech probówkach umieścić po 2 mL 10% roztworu NaNO2, dodać po 2 mL 2 M roztworu
CH3COOH i wymieszać zawartość probówek. Następnie do probówek dodać odpowiednio po 1 mL
roztworu glicyny, peptydu oraz wody. Zaobserwować zachodzące procesy.
3. Reakcja biuretowa Piotrowskiego
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. 1% wodne roztwory: glicyny, peptydu
2. 6 M roztwór NaOH
3. 0,5% roztwór CuSO4
4. Probówki zwykłe szklane
5. Pipety Pasteura
Wykonanie doświadczenia:
W trzech probówkach umieścić odpowiednio po 1 mL roztworu: glicyny, peptydu oraz wodę. Do
kaŜdej probówki dodać po 2 mL 6 M roztworu NaOH i jednej kropli 0,5% roztworu CuSO4 -
zawartość probówek dobrze wymieszać. Następnie do probówek dodać kroplami 0,5 mL roztworu
CuSO4. Zaobserwować zmiany zabarwienia.
4. Wykrywanie obecności siarki w cysteinie i cystynie (reakcja cystynowa)
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. 1% wodne roztwory: glicyny, L-cysteiny, cystyny, L-metioniny, peptydu
2. 6 M roztwór NaOH
3. 1% roztwór (CH3COO)2Pb
4. Probówki zwykłe szklane
5. Pipety Pasteura
6. Łaźnia wodna
Wykonanie doświadczenia:
W sześciu probówkach umieścić odpowiednio po 1 mL roztworu glicyny, L-cysteiny, cystyny, Lmetioniny,
badanego peptydu oraz wody. Następnie do kaŜdej probówki dodać po 2 mL 6 M
roztworu NaOH i 0,5 mL 1% roztworu (CH3COO)2Pb. Probówki ogrzewać kilkanaście minut we
wrzącej łaźni wodnej i zaobserwować zmiany.
5. Reakcja z nitroprusydkiem sodu na obecność cysteiny
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. 1% wodne roztwory: glicyny, L-cysteiny, cystyny, L-metioniny, peptydu
2. 1% roztwór nitroprusydku sodu
3. (NH4)2SO4
4. StęŜony wodny roztwór amoniaku
5. Probówki zwykłe szklane
6. Pipety Pasteura
7. Łopatka metalowa
Wykonanie doświadczenia:
W sześciu probówkach umieścić odpowiednio po 1 mL roztworu: glicyny, L-cysteiny, cystyny, Lmetioniny,
peptydu oraz wody. Następnie do kaŜdej probówki dodać po 1 mL roztworu
nitroprusydku, nasycić roztwory (NH4)2SO4 i wkroplić stęŜony roztwór amoniaku. Zaobserwować
zmiany zabarwienia.
6. Wykrywanie metioniny metodą McCarthy-Sullivana
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. 1% wodne roztwory: glicyny, L-metioniny, L-cysteiny, peptydu
2. 40% roztwór NaOH
3. 10% roztwór nitroprusydku sodu
4. StęŜony roztwór HCl
5. Probówki zwykłe szklane
6. Pipety Pasteura
7. Zlewka
Wykonanie doświadczenia:
W czterech probówkach umieścić odpowiednio po 2,5 mL roztworu L-metioniny, L-cysteiny,
peptydu oraz wody. Następnie do kaŜdej probówki dodać po 0,5 mL 40% roztworu NaOH
(wymieszać), 0,5 mL 1% roztworu glicyny (wymieszać) i 0,3 mL 10% roztworu nitroprusydku sodu
(wymieszać). Probówki ogrzewać przez 10 minut w temperaturze 40-80oC (zlewka z ciepłą wodą),
nie dopuszczając do wrzenia. Następnie probówki oziębić pod strumieniem zimnej wody z kranu i
do kaŜdej z nich dodać po około 0,5 mL stęŜonego roztworu HCl. Zaobserwować zmiany
zabarwienia.
7. Reakcja ksantoproteinowa
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. 1% wodne roztwory: glicyny, L-tyrozyny, L-tryptofanu, peptydu
2. StęŜony roztwór HNO3
3. 6 M roztwór NaOH
4. Probówki zwykłe szklane
5. Pipety Pasteura
6. Łaźnia wodna
Wykonanie doświadczenia:
W pięciu probówkach umieścić odpowiednio po 1 mL roztworu: glicyny, L-tyrozyny, L-tryptofanu,
peptydu oraz wodę. Do kaŜdej probówki dodać po 1 mL stęŜonego roztworu kwasu azotowego i
probówki ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. Następnie probówki ostudzić pod
strumieniem zimnej wody z kranu i do kaŜdej z nich ostroŜnie* dodać po 3 mL 6 M roztworu
NaOH. Zaobserwować zmiany zabarwienia.
* Uwaga! Reakcja silnie egzotermiczna!
8. Reakcja Pauly'ego na obecność histydyny i tyrozyny
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. 1% wodne roztwory: glicyny, L-histydyny, L-tyrozyny, peptydu
2. 1% roztwór kwasu sulfanilowego w 1 M roztworze HCl
3. 5% roztwór NaNO2
4. 10% roztwór Na2CO3
5. Probówki zwykłe szklane
6. Pipety Pasteura
Wykonanie doświadczenia:
Do probówki z 2 mL 1% roztworu kwasu sulfanilowego dodać 2 mL 5% roztworu NaNO2.
Zawartość probówki wytrząsać przez kilka minut, jednocześnie chłodząc ją pod strumieniem zimnej
wody z kranu. Następnie w sześciu probówkach umieścić po 0,5 mL otrzymanego odczynnika,
dodać po 1 mL 10% roztworu CaCO3 i po 0,5 mL odpowiednio roztworów: glicyny, L-histydyny, Ltyrozyny,
peptydu oraz wodę. Zaobserwować zmiany zabarwienia (mogą wystąpić dopiero po kilku
minutach).
9. Reakcja Voiseneta na obecność tryptofanu
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. 1% wodne roztwory: glicyny, L-tryptofanu, peptydu
2. 2,5% roztwór aldehydu mrówkowego
3. StęŜony roztwór HCl
4. 0,05% roztwór NaNO2
5. Probówki zwykłe szklane
6. Pipety Pasteura
Wykonanie doświadczenia:
W czterech probówkach umieścić odpowiednio po 1 mL roztworu: glicyny, L-tryptofanu, peptydu
oraz wodę. Następnie do kaŜdej probówki dodać kroplę 2,5% roztworu aldehydu mrówkowego oraz
4 mL stęŜonego roztworu HCl i pozostawić na około 5 minut. Po tym czasie do probówek dodać
powoli kroplami 0,05% roztwór NaNO2. Zaobserwować zmiany zabarwienia.
10. Reakcja Sakaguchi'ego na obecność argininy
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. 1% wodne roztwory: glicyny, L-argininy, peptydu
2. 10% roztwór NaOH
3. 1% roztwór α-naftolu w etanolu
4. Roztwór NaOBr
5. Probówki zwykłe szklane
6. Pipety Pasteura
Wykonanie doświadczenia:
W czterech probówkach umieścić odpowiednio po 1 mL roztworu: glicyny, L-argininy, peptydu
oraz wodę. Następnie do probówek dodać kolejno po 0,5 mL 10% roztworu NaOH, 2-3 krople
roztworu naftolu i kroplę roztworu NaOBr. Zaobserwować zmiany zabarwienia.
Sprawozdanie z ćwiczenia powinno zawierać: omówienie wykonywanych reakcji według
następującego schematu: zasada, na której opiera się próba (+ równanie reakcji, tam gdzie jest to
moŜliwe), obserwacje, wnioski (dotyczące związków, dla których była wykonywana próba oraz
aminokwasu, otrzymanego do identyfikacji), propozycję schematu identyfikacji związku w próbie
(peptyd, aminokwasy) w oparciu o wykonywane reakcje barwne.