Dominik Jakubiak biotechnologia / 2 rok

Sprawozdanie z laboratorium z biochemii: 11.12.2007

Ćwiczenie 7 (ilościowe): Oznaczanie aktywności peroksydazy w obecności i nieobecności inhibitora - wyznaczanie stałych kinetycznych

Przebieg do doświadczenia:

Z utartego korzenia chrzanu wyciskano sok do zlewki, następnie rozcieńczano 1:1 wodą i pozostawiliśmy na kilka minut do opadnięcia osadu. Powstały ekstrakt wykorzystywano w części dalszej doświadczenia.

Następnie w statywie przygotowano 2 szeregi po 4 niskich probówek. Do wszystkich probówek odmierzono po 0,8 ml roztworu nadtlenku wodoru, a do kolejnych par po 0,8 ml coraz mniej rozcieńczonych roztwórów pirogalolu, zaczynając od najbardziej rozcieńczonego:

1 para: 0,001 M

2 para: 0,005 M

3 para: 0,01 M

4 para: 0,02 M

Do pierwszego rzędu probówek odmierzano po 0,2 ml wody, a do drugiego po 0,2 azytku sodu (inhibitora).

Następnie przygotowano program i natychmiast przed rozpoczęciem dolano do kuwety, zawierającej mieszaninę (zaczynamy od najmniej stężonych bez inhibitora, potem z inhibitorem od najmniej stężonych), 0,2 ml ekstraktu z chrzanu przygotowanego na początku. Następnie rejestrujemy, za pomocą komputera połączonego ze spektrofotometrem (λ = 420 nm), przebieg reakcji co najmniej przez 30 s.

Następnie, korzystając ze stałej Michaelita liczymy szybkość przebiegu reakcji.

Obliczenia:

Uzyskane na wykresach linie powinny być proste, jednak ze względu na niedokładności pomiaru nie są. Dlatego też do wyliczenia stałej Michaelisa i prędkości maksymalnej, posłużę się liniami trendu.

-1/Km = x, gdy y=0

V max = y, gdy x =0

Próbka 1 b:

-1/Km = -39,14 Km = 0,0255

V max = 0,1957

Próbka 1 i:

-1/Km = -9,68 Km = 0,1033

V max = 0,1191

Próbka 2 b:

-1/Km = -55,38 Km = 0,0181

V max = 0,5427

Próbka 2 i:

-1/Km = -5,63 Km = 0,1777

V max = 0,1677

Próbka 3 b:

-1/Km = -4,97 Km = 0,2012

V max = 0,3393

Próbka 3 i:

Za mało danych ze względu na zbyt wysoką absorbancję próbki.

Wnioski:

Z przeprowadzonych obliczeń wynika, że inhibitor znacznie obniżył szybkość maksymalną reakcji. Czym większe stężenie pirogalolu (substratu dla peroksydazy), tym szybszy przebieg reakcji, w związku z tym możemy uznać, ze w tym wypadku mamy do czynienia z inhibitorem kompetycyjnym - azydek sodu współzawodniczy z substratem o enzym, czym więcej substratu w stosunku do inhibitora, tym szybsza reakcja.

---