Koniugacja u bakterii

Sposoby horyzontalnego transferu genów u bakterii:

1. transformacja - przenoszenie informacji genetycznej w postaci wolnego DNA (czyli ze środowiska) z jednej bakterii do drugiej. Np. transformacja DNA z martwych komórek do żywych.

2. transdukcja - przekazywanie DNA za pośrednictwem bakteriofagów.

Fag namnażający się w jednej komórce może w wyniku błędu „porwać” kawałek informacji genetycznej z zainfekowanej komórki. Dalej namnażając się i infekując inne komórki taki fag rozprzestrzenia tą „porwaną” informację genetyczną.

3. koniugacja - proces przekazywania materiału genetycznego wymagający bezpośredniego kontaktu dwóch komórek. Dawca to komórka przekazująca materiał genetyczny, natomiast biorca odbiera go.

Wyróżniamy 2 typy dawców:

1. przekazujący fragment chromosomu - w wyniku koniugacji z tym dawcą powstają rekombinanty

2. przekazujący plazmid - w wyniku koniugacji z tym dawcą powstają transkoniuganty

W wyniku koniugacji z komórki dawcy jest przekazywana jakaś cecha do komórki biorcy

Koniugacja I

HfrC Str^s x F^-108 pro met thy Str^r - przekazywana jest cecha zdolności syntezy jednego z 3 składników pokarmowych

HfrC Str^s - dawca (przekazuje fragment chromosomu - w wyniku koniugacji powstaną rekombinanty), prototrof wrażliwy na streptomycynę

F^-108 pro met thy Str^r - biorca, auksotrof (niezdolny do syntezy proliny, metioniny i tyminy) oporny na streptomycynę

Selekcjonujemy klasy ze względu na czynniki pokarmowe - musimy więc użyć stałego podłoża Davisa z odpowiednim dodatkiem. Podłoże musi być stale ponieważ chcemy potem policzyć kolonie

Selekcjonowana klasa	Podłoże selekcyjne
Pro^+ Str^r	p. Davisa + met, thy, str
Met^+ Str^r	p. Davisa + pro, thy, str

Do podłoża dodajemy streptomycynę aby uniemożliwić wzrost komórkom dawcy, które są wrażliwe na ten antybiotyk.

Do podłoża nie dodajemy tego składnika, którego syntezę chcemy wyselekcjonować

Do koniugacji używamy szczepów z hodowli nocnej, ponieważ bakterie są wtedy w fazie wzrostu logarytmicznego, a więc i w dobrej kondycji fizjologicznej

Na jakim podłożu hodujemy poszczególne szczepy?

• HfrC - na podłożu Davisa (prototrof)

• F^-108 - na podłożu Davisa z pro, met i thy (nie używamy hydrolizatu kazeiny ponieważ nie ma w nim tyminy)

Mieszamy 0,5ml HfrC (dawca) z 4,5ml F^-108 (biorca) - dawcy jest 10-krotnie mniej. Gdyby dawcy było więcej to występowałby efekt letalny biorcy.

Mieszając szczepy dawcy i biorcy uzyskujemy mieszaninę koniugacyjną, którą następnie wstawiamy na godzinę do optymalnych warunków (37°C).

Następnie po zakończeniu koniugacji mieszaninę koniugacyjną rozcieńczamy i wysiewamy na odpowiednie podłoża selekcyjne.

Musimy również odpowiednio rozcieńczyć i wysiać hodowlę szczepu dawcy na AO aby wiedzieć jaka liczba komórek została użyta do koniugacji.

Wyniki

Rekombinanty	Rozcieńczenie	Liczba koloni
Pro^+Str^r	-2	800
		-3	216
	Met^+ Str^r	-1	68
		-2	6

Liczba rekombinantów Pro⁺ Str^r=216*10³*10=2,6*10⁶ cfu/ml

Liczba rekombinantów Met⁺ Str^r=68*10¹*10=6,8*10³ cfu/ml

Średnia liczba koloni dawcy w rozcieńczeniu 10^-6 = 43 kolonie

Liczba komórek dawcy użytych do koniugacji = 43*10⁶*10=4,3*10⁸ cfu/ml

Stosunek komórek dawcy do biorcy podczas koniugacji - 1:10 => dawcę rozcieńczyliśmy dziesięciokrotnie, tzn. w mieszaninie koniugacyjnej znajdowało się 4,3*10⁷ komórek dawcy

Częstość rekombinacji Pro⁺ Str^r (2,16*10⁶*100%)/4,3*10⁷ = 21/4,3% = 4,9%

Częstość rekombinacji Met⁺ Str^r (6,8*10³*100%)/4,3*10⁷ = 1,5*10^-2 = 0,015%

Gradient: jest więcej rekombinantów Pro⁺ niż Met⁺ => Pro⁺ położona bliżej początku przekazywania

Koniugacja II

MC1061 Cm^r x MC1061 Rif^r - przekazywana jest cecha oporności na chloramfenikol

MC1061 Cm^r - dawca, szczep oporny na chloramfenikol

MC1061 Rif^r - biorca, szczep oporny na ryfampicynę

Chcemy wyselekcjonować transkoniuganty Cm^r Rif^r - do selekcji używamy agaru odżywczego ze chloramfenikolem i ryfampicyną

Dodanie ryfampicyny hamuje wzrost dawcy. Natomiast dodanie chloramfenikolu służy wyselekcjonowaniu koniugantów (opornych na chloramfenikol)

Do koniugacji używamy szczepów z hodowli nocnej hodowanej na bulionie odżywczym. Szczep dawcy hodujemy pod presją, tzn. na podłożu zawierającym chloramfenikol - robimy to żeby wyrosły jednie bakterie posiadające oporność na ten antybiotyk). Do koniugacji usuwamy chloramfenikol (ponieważ hamowałby on biorcę) za pomocą wirowania.

Mieszamy po 2 ml hodowli dawcy i biorcy

Mieszaninę koniugacyjną wstawiamy na godzinę do optymalnych warunków (37°C).

Następnie po zakończeniu koniugacji mieszaninę koniugacyjną rozcieńczamy i wysiewamy na podłoże selekcyjne.

Musimy również odpowiednio rozcieńczyć i wysiać hodowlę szczepu dawcy na AO aby wiedzieć jaka liczba komórek została użyta do koniugacji.

Wyniki: transkoniuganty Cm^r Rif^r

rozcieńczenie	Liczba kolonii bakterii w poszczególnych wysiewach				Średnia l. koloni
-2	890	800	800	Niepoliczalne	-
-3	76	49 - odrzucamy	80	82	79

Liczba transkoniugantów w 1 ml = 79*10³*10=7,9*10⁵ cfu/ml

Średnia liczba koloni dawcy w rozcieńczeniu 10^-6 = 82 kolonie

Liczba komórek MC1061 (Cm^r) dawcy użytych do koniugacji = 82*10⁶*10=8,2*10⁸ cfu/ml

Stosunek komórek dawcy do biorcy podczas koniugacji - 1:1 => dawcę rozcieńczyliśmy dwukrotnie, tzn. w mieszaninie koniugacyjnej jest 4,1*10⁸ komórek dawcy

Częstość transkoniugacji (7,9*10⁵*100%)/4,1*10⁸ = 7,9*10⁷/4,1*10⁸% = 0,19%

W mieszaninie koniugacyjnej po koniugacji znajdują się: komórki dawcy, komórki biorcy oraz komórki biorcy które otrzymały informację genetyczną od dawcy.

Jedynie jakiś procent komórek biorcy otrzymuje informację genetyczną od dawcy - istnieje więc określone prawdopodobieństwo że komórka biorcy otrzyma informację od dawcy

Kombinujemy jedynie pojedyncze klasy. Nie kombinujemy podwójnych ponieważ prawdopodobieństwo, że jedna komórka biorcy otrzyma 2 cechy od dawcy jest bardzo małe

Rekombinacja - jest to wbudowywanie otrzymanej informacji genetycznej w chromosom - zachodzi u rekombinantów.

W przypadku plazmidu nie zachodzi rekombinacja, ponieważ plazmid funkcjonuje jako niezależna cząsteczka DNA

Informacja przekazywana na drodze koniugacji (od dawcy do biorcy) może pochodzić z:

1. Plazmidu

Plazmid - autonomiczna cząsteczka DNA (spoza chromosomu), która niesie jakieś cechy (np. oporność na antybiotyk). Plazmidy są replikonami - cząsteczkami posiadającymi własny system replikacyjny.

Nie wszystkie plazmidy mogą być przekazywane na drodze koniugacji. „Potrafią to” jedynie plazmidy koniugacyjne - posiadające czynnik F, który zawiera geny kodujące specjalne struktury na powierzchni komórki (m.in. pilusy), które są niezbędne do zajścia koniugacji.

Plazmid F:

• plazmid zawierający tylko czynnik F (geny umożliwiające zajście koniugacji). Poza tym plazmid ten nie zawiera informacji o żadnych dodatkowych cechach.

• Jest zamkniętą, kolistą cząsteczką dwuniciowego DNA o długości 100 tyś par zasad

Pozostałe plazmidy koniugacyjne poza czynnikiem F posiadają również geny warunkujące jakoś cechę(cechy) fenotypowe. Plazmidy koniugacyjne powstają na skutek integracji (wbudowania) plazmidu F do chromosomu - jest to możliwe dzięki elementom IS występujące zarówno na plazmidach, jak i w chromosomie. Jeśli sekwencje IS z plazmidu F „odnajdą” sekwencje IS na chromosomie to nastąpi wbudowanie tego plazmidu do chromosomu. Czasem taki wbudowany plazmid może odłączyć się od chromosomu „zabierając” ze sobą fragment chromosomu, warunkujący jakoś cechę - w ten sposób powstają plazmidy koniugacyjne.

Wszystkie plazmidy koniugacyjne zawierają:

1. Moduł Tra - składa się on z kilkunastu genów, warunkujących zdolność do koniugacji. Geny Tra kodują białka wymagane do stabilizacji koniugacyjnych partnerów, jak i do samego procesu przekazywania DNA i jego regulacji

2. Miejsce OriT - miejsce stanowiące początek koniugacyjnej replikacji (plazmid w tym miejscu ulega pęknięciu podczas replikacji)

3. Sekwencję IS - sekwencja umożliwiająca wbudowanie plazmidu do chromosomu

4. Rep ??? - sekwencja odpowiadająca za replikację??

5. geny warunkujące cechę (cechy) fenotypowe, np. odporność na antybiotyk

Plazmid F nie zawiera tego fragmentu!!

Mechanizm przekazywania plazmidu na drodze koniugacji:

1. Za pomocą pilusów dawca odszukuje biorcę, po czym łączy się z nią

2. Jednoniciowe pęknięcie DNA w miejscu OriT

3. Rozwinięcie DNA w kierunku od 5' począwszy od miejsca oriT

4. Wolny koniec 5' przechodzi do biorcy przez kanał łączący obie komórki

5. Synteza nici komplementarnych odbywająca się jednocześnie z przekazywaniem

W efekcie zarówno komórka dawcy jak i biorcy posiada cały plazmid - tzn. że komórka biorcy stała się po przekazaniu plazmidu komórką dawcy

Szczep F⁺ - szczep zawierający czynnik F

W czasie koniugacji F⁺ z F^- plazmid przechodzi do F^-, który staje się F⁺

2. Fragmentu chromosomu

W takim przypadku dawca ma na stałe wbudowany plazmid F do chromosomu

Wbudowany chromosom w dalszym ciągu zbudowany jest z takich samych fragmentów, jednakże genu rep są wyłączone, ponieważ wbudowany plazmid jest replikowany z całym chromosomem

Komorka z wbudowanym plazmidem koniugacyjnym jest jednak w dalszym ciągu dawcą ponieważ zawiera geny tra. Jednakże przez to że plazmid jest wbudowany to przekazywanie informacji odbywa się na innej zasadzie:

1. Dawca odnajduje biorcę za pomocą pilusów po czym łączy się z nim

2. Przekazywanie rozpoczyna się od miejsca oriT, które pęka.

3. Następnie pojedyncza nić DNA przechodzi przez kanał łączący obydwie komórki

4. Jednocześnie zachodzi synteza nici komplementarnych

5. Następuje rekombinacja otrzymanego fragmentu chromosomu, tzn wbudowanie go w chromosom biorcy

Dany szczep ma stałe miejsce początku przekazywania - określony punkt z którego w określonym kierunku rozpoczyna się przekazywanie genów.

Podczas takiego przekazywania, najpierw są przekazywane geny leżące najbliżej miejsca oriT i znajdujące się w odpowiednim kierunku od tego miejsca.

Tak więc geny leżące (bliskie początkowi przekazywania) mają największą szansę ze zostanę przekazany

Przekazywanie następuje w sposób ukierunkowany oraz z gradientem czasowym i…

Biorca nie staje się dawcą ponieważ nie otrzymuje całego plazmidu F, a tylko jego fragment oraz niektóre geny z chromosomu dawcy.

Na przekazanie całego chromosomu E. coli potrzeba 100 minut (ale nigdy cały chromosom nie jest przekazywany)

Potrzeba 10 minut na utworzenie par koniugacyjnych

Tak więc przekazanie całego chromosomu zajęłoby 110 minut.

Po jakim czasie eksperymentu zostanie przekazany gen Pro? 12 minucie

Po jakim czasie mapy zostanie przekazany gen Pro? 2 minuty

Po jakim czasie eksperymentu zostanie przekazany gen Met? 42 minucie

Po jakim czasie mapy zostanie przekazany gen Met? 32 minucie

Mapa genetyczna -> mapa przedstawiająca wzajemne ułożenie genów na chromosomie. Im dalej od punktu początkowego znajduje się dany gen, tym później zostaje on przekazany i rzadziej wchodzi do biorcy w procesie nieprzerwanej koniugacji.

Mapa genetyczna została skonstruowana na podstawie metody przerywanej koniugacji, pozwalającej określić czas wejścia poszczególnych genów z komórki dawcy do biorcy.

---