dr hab. Tadeusz Dobosz
PRAKTIKUM Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ
Materiały pomocnicze do zajęć z biologii molekularnej, diagnostyki molekularnej i medycyny molekularnej dla studentów Akademii Medycznej we Wrocławiu.
Wydanie internetowe.
Data ostatniej aktualizacji - 15 lutego 2005
Katedra Medycyny Sądowej Akademii Medycznej we Wrocławiu
Zakład Technik Molekularnych
Spis treści:
1. Wykaz skrótów i objaśnienie terminów użytych w tekście.
A - adenina
Agaroza - polimer węglowodanowy, uzyskiwany z wodorostów, służy do łatwego
(poprzez rozgotowywanie) sporządzania żeli do elektroforezy
Autoklaw - ciśnieniowy sterylizator parowy
Blot - folia nylonowa, na którą przeniesiono analizowane fragmenty DNA
Blotting - przenoszenie fragmentów DNA z żelu na folię nylonową
C - cytozyna
cDNA - ang. Cloned Deoxyrybonucleic Acid - klonowany DNA, kwas
deoksyrybonukleinowy, uzyskany z nici mRNA za pomocą techniki odwrotnej
transkrypcji
Cis - po tej samej stronie (w odróżnieniu od trans - po drugiej stronie)
DNA - ang. Deoxyrybonucleic Acid - kwas deoksyrybonukleinowy
DTT - ang. Dithiotreitol - ditiotreitol, odczynnik redukujący mostki siarkowe w białkach
Dygestorium - wyciąg, szafka z wymuszoną wentylacją ("wciąga" szkodliwe opary)
Elektroforeza - metoda rozdziału naładowanych elektrycznie cząsteczek w polu
prądu elektrycznego stałego lub zmiennego (wprowadzona w 1937
roku przez Tiseliusa, nagroda Nobla w 1948 roku)
G - guanina
Genom - DNA zawarty w pojedynczym jądrze komórkowym zygoty
Glovesbox - komora do pracy z materiałem niebezpiecznym (z zamontowanymi na
stałe gumowymi rękawicami w przedniej szybie lub bocznych ściankach)
Helisa - struktura przestrzenna, złożona z dwu owiniętych wokół siebie łańcuchów
Kancerogen - substancja rakotwórcza
Kapilara - wypełniona rzadkim żelem cienka rurka szklana lub kwarcowa, ostatnio
coraz częściej stosowana do elektroforezy produktów reakcji PCR lub
reakcji sekwencjonowania DNA
Klenow'a fragment - polimeraza DNA strawiona tak dobraną proteazą, aby produkt
trawienia zachował aktywność enzymatyczną
Laminar - komora, do której poprzez filtry jest nawiewane sterylne powietrze
MALDI - TOF - ang. Matrix Associated Laser Desorption Ionization - Time Of Flight -
technika analizy spektralnej, polegająca na odparowaniu laserem
próbki i pomiarze czasu, w którym sublimująca substancja dociera do
detektora
mg - miligram, 10-3 grama
Mg++ - jon magnezowy, aktywator polimeraz DNA, najczęściej dostarczany w postaci
soli chlorkowej, rzadziej siarczanowej
Mitochondrium - "siłownia" komórki, oraganellum w którym zachodzą intensywne
procesy energetyczne, prowadzące do wytwarzania dużych ilości
ATP
Multi loci - próba (sonda) molekularna hybrydyzująca z wieloma fragmentami
restrykcyjnymi, dająca charakterystyczny wzór prążkowy, podobny do
kreskowego kodu towarowego
Mutagen - substancja powodująca mutacje (zmiany w DNA)
mpz - megapary zasad, odcinki DNA mierzone w jednostkach wyrażonych w
milionach par
mRNA - ang. Messenger Rybonuleic Acid - informacyjny RNA, wzorzec do syntezy
białek, kwas nukleinowy uzyskany z przepisania informacji z nici DNA na nić
RNA, poddany enzymatycznej obróbce polegającej na wycięciu
niepotrzebnych fragmentów (np. intronów)
N - którakolwiek z zasad (A, U, T, G, C)
ng - nanogram, 10-9 grama
Organellum - struktura komórkowa, odpowiedzialna za daną funkcję biologiczną (np.
mitochondria są głównym miejscem syntezy ATP w komórce)
Patogen - czynnik zakaźny
Palindrom - tekst, który można czytać jednakowo od początku i od końca (np. "kobyła
ma mały bok")
PCR - ang. Polymerase Chain Reaction - reakcja polimerazowa, namnażanie DNA in
vitro, (metoda wprowadzona w 1986 roku przez Mullisa, nagroda Nobla w
1993 roku)
pg - pikogram, 10-12 grama
plazmid - niewielki zamknięty (kolisty) łańcuch DNA w cytoplazmie bakterii,
replikujący się samodzielnie, często determinuje odporność na antybiotyk
pmRNA - ang. Prematured Rybonuleic Acid - świeżo wytworzony RNA, jeszcze przed
wycięciem niepotrzebnych fragmentów, potocznie także zwany "surowym
transkryptem", w szeregu podręczników błędnie nazywany "mRNA"
Poli A - sekwencja kilkunastu adenin, charakterystyczna dla mRNA
Poli T - sekwencja komplementarna do poli A, wykorzystywana przy uzolacji mRNA
Prąd przemienny - prąd elektryczny, w którym biegunowość oscyluje (plus co chwila
zamienia się miejscami z minusem)
Prąd stały - prąd elektryczny o stałej biegunowości (elektroda podłączona do
dodatniego źródła takiego prądu to anoda, do ujemnego to katoda)
Prąd zmienny - prąd elektryczny o stałej biegunowości, lecz o zmiennym (najczęściej
regularnie falującym) napięciu
Primer - odcinek DNA o długości na ogół od 15 do 30 pz, stosowany w reakcji PCR
do "oflankowania" fragmentu DNA który ma być powielony w wyniku reakcji
Promotor - sekwencja DNA będąca sygnałem do rozpoczęcia syntezy pmRNA
pz - pary zasad, miara długości łańcucha DNA
Restryktaza - enzym restrykcyjny, bakteryjna nukleaza specyficznie rozcinająca
łańcuch DNA w ściśle określonym miejscu
RNA - ang. Ribonucleic Acid - kwas rybonukleinowy
RT-PCR - ang. Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction - reakcja
polimerazowa, namnażanie DNA in vitro przy użyciu jako wzorca nici nie
DNA, lecz RNA
Starter - patrz "primer"
T - tymina
Termocycler - amplifikator DNA, mechaniczne urządzenie będące w istocie
sterowaną mikroprocesorowo cieplarką, służące do namnażania in
vitro odcinka DNA o długości wyznaczonej przez primery
hybrydyzujące z obiema niciami DNA
Teratogen - substancja powodująca zaburzenia w rozwoju płodu
Transiluminator - stolik, emitujący poprzez filtr w blacie promieniowanie UV o
długości fali około 305 - 315 nm
Transkrypt - RNA zsyntetyzowane na macierzystej nici DNA
U - uracyl
UV - ang. Ultra Violet - promieniowanie nadfioletowe
V - wolt, jednostka napięcia prądu elektrycznego
v - łac. versus - oznacza "lub" względnie "albo"
wektor - przenośnik, "koń trojański", środek za pomocą którego dokonujemy
transfekcji (przenosimy do jądra komórki obce jej DNA (np. plazmid z
wklonowanym genem)
g - mikrogram, 10-6 grama
- znak oznaczający miejsce, w którym łańcuch DNA jest rozcinany przez restryktazę
- znak oznaczający kierunek działania enzymu
* - znak używany na oznaczenie allelu (np. CYP2D6*3 oznacza trzeci allel w układzie
grupowym cytochromu)
Zagrożenia czyhające na biologa molekularnego można podzielić na zakaźne, chemiczne i fizyczne. Zostaną one kolejno omówione.
Zagrożenia zakaźne.
Związane są z zakaźnością badanego materiału biologicznego. Podczas pracy należy "na wszelki wypadek" traktować każdy dostarczony materiał biologiczny jako potencjalnie zakaźny, potencjalnie bardzo groźnym błędem jest dzielenie materiału a priori na "bezpieczny" i "niebezpieczny". Materiał genetyczny obecny w próbce biologicznej zwykle nie jest niszczony w wysokiej temperaturze, a więc próbki które zawierają mało białka teoretycznie można przed badaniem autoklawować, co w praktyce wydatnie zmniejsza niebezpieczeństwo zakażenia. Jeżeli takie postępowanie jest niemożliwe, bo próbka ulega koagulacji cieplnej, wówczas opakowanie należy przenieść pod włączone dygestorium, założyć rękawiczki i gogle i bardzo ostrożnie otworzyć (uwaga - czasami zawartość fiolki bywa pod ciśnieniem i potrafi "trysnąć"!). Pobrać część odpowiednią do badań, resztę zamknąć w zgrzanym foliowym worku i zamrozić do ewentualnej powtórki /po zakończonym badaniu spalić, lub po otwarciu worka i fiolki wrzucić do wiadra z rozcieńczonym podchlorynem sodu albo, w przypadku materiału w najwyższym stopniu zakaźnego - zasypać wapnem chlorowanym/. Przed izolacją kwasów nukleinowych z próbki skrzepłej krwi lub fragmentu tkanki często należy ją rozdrobnić, dobrze jest robić to za pomocą narzędzi jednorazowego użytku. Podczas izolacji materiału genetycznego klasyczną metodą (z użyciem m.in. fenolu i etanolu) zakaźność materiału znika i praca z wyizolowanym materiałem genetycznym bakterii i wirusów jest już całkowicie bezpieczna.
Zagrożenia chemiczne.
Najpoważniejszym zagrożeniem jest praca z odczynnikami do wybarwiania kwasów nukleinowych (np. z bromkiem etydyny - ethidium bromide). Praktycznie każda substancja wiążąca się z DNA ma działanie muta- lub kancerogenne. Nie należy dopuszczać do kontaktu tych substancji ze skórą ani wdychać pyłu lub oparów. Problemem ekologicznym jest pozbycie się resztek takiej substancji. W przypadku bromku etydyny sposób powszechny na świecie (kolumny jonowymienne) w Polsce jest bezużyteczny, ponieważ, jak dotąd, nie ma służb utylizujących wypełnione kolumny. Pozostaje sposób prymitywny i mniej skuteczny, polegający na dodawaniu łyżeczki nadmanganianu potasu na każdy litr roztworu bromku etydyny i po kilku godzinach wlewaniu niewielkiej ilości stężonego kwasu solnego - w takim środowisku zdecydowana większość mutagennej substancji ulega rozpadowi i można stosunkowo mało szkodząc środowisku po całonocnej inkubacji spuścić ciecz do kanalizacji.
Inna niebezpieczna mieszanina, odczynnik fenolowy, jest żrąca, silnie korodująca, mutagenna i trująca, a czysty gorący fenol używany do jej wytworzenia dodatkowo jest łatwopalny. Podczas sporządzania odczynnika fenolowego i późniejszej z nim pracy należy zachować najwyższą ostrożność. Chloroform, używany komplementarnie z fenolem ma działanie karcynogenne.
Sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS, sodium dodecyl sulphate) jest bardzo silnym detergentem w dużym stężeniu rozpuszczającym błony komórkowe, zwłaszcza "cienkościennych" komórek nabłonka układu oddechowego. Dodatkowo jest to substancja bardzo lekka, pylista i elektryzująca się (łatwo "odskakuje" od łopatki podczas nabierania). Unikać wdychania pyłu! W czasie ważenia należy zakładać maseczkę!
Obecnie odczynniki chemiczne, zwłaszcza sprowadzane z zagranicy, są dobrze opisane. Czytajmy ulotki dołączone do odczynników, studiujmy napisy na opakowaniach, nauczmy się międzynarodowych znaków ostrzegawczych (patrz ryc. 1.)
Zagrożenia fizyczne.
Najpoważniejsze do niedawna zagrożenie fizyczne w pracowni biologii molekularnej, czyli promieniowanie jonizujące izotopów radioaktywnych obecnie w praktyce prawie przestało istnieć. Nie ma już konieczności stosowania izotopów, znakowania radioaktywne prawie całkowicie zostały wyparte przez nie radioaktywne (biotyną, antygenem lub enzymem). Izotopy są (i pewnie jeszcze długo będą) stosowane w "starych" laboratoriach, w których po latach owocnej pracy ciężko zarzucić rutynową, sprawdzoną technologię i przestawić się na nową, nie radioaktywną. Należy to uszanować, ale nowo tworzone pracownie powinny unikać stosowania izotopów od początku swojej działalności. Szczególnie niebezpieczny jest radioaktywny fosfor, paradoksalnie dlatego, że "krótko żyje". Zwykle w pracowni mamy naskładane całe sterty blotów, a gdy przyjdzie wreszcie wytęskniona dostawa izotopu to pracujemy cały dzień i jeszcze długo w nocy, a o drugiej nad ranem jakże łatwo o nieostrożność, nieuwagę i wypadek.
Niedocenianym zagrożeniem jest promieniowanie ultrafioletowe, którego źródła w pracowni to lampy sterylizujące podsufitowe i w laminarach oraz transiluminatory. Należy chronić całą twarz przesłoną (a już koniecznie co najmniej oczy specjalnymi okularami), zakładać rękawiczki. Wietrzyć pracownię z nadmiaru tworzącego się pod wpływem UV ozonu! Rozpada się on na tlen cząsteczkowy i osławiony wolny rodnik tlenowy (anionorodnik ponadtlenkowy).
Pracownia biologii molekularnej to nieprzeliczone mrowie aparatów podłączonych do sieci elektrycznej, co zwiększa możliwość porażenia prądem. Zastosowanie nowoczesnych anty porażeniowych instalacji elektrycznych (z wyłącznikami różnicowo-prądowymi) jest wskazane, ale nie zawsze zdaje egzamin ponieważ taki zabezpieczenia są bardzo czułe i bywa, że działają bez potrzeby, a spowodowane odłączeniami prądu awarie są niezmiernie przykre w skutkach, a bywa, że i niesłychanie kosztowne. Absolutne minimum bezpieczeństwa to wszystkie gniazdka elektryczne w pracowni ze sprawnym zerowaniem (są to gniazdka z wystającymi metalowymi "kołkami").
Środki ochrony.
Fartuch laboratoryjny to nie fason ani moda. To nasza najważniejsza obrona przed zabrudzeniem odzieży chemikaliami i patogenami. Mniej twarzowe, ale skuteczniejsze są fartuchy wiązane z tyłu. W czasie przebywania w laboratorium ręce płuczemy dosłownie co chwila, ale mydła używamy tylko przed posiłkiem i przed wyjściem z pracy. Jeżeli ktoś "nie może" myć rąk samą wodą, to niech używa kremu natłuszczającego, bo odtłuszczona ludzka skóra to istne sito... Pracujemy w rękawiczkach, to chroni nas przed badanym materiałem i ... badany materiał (zwłaszcza RNA) przed nami. Wyciąg (dygestorium) jest po to, aby chronić pracownika przed robotą (próbkami). Komora z laminarnym przepływem powietrza jest po to, aby chronić robotę (tzn. próbki, zwłaszcza podczas nastawiania testu PCR) przed pracownikiem (zanieczyszczenie). Komora sterylna (glovesbox) służy do bezpiecznej pracy z wyjątkowo niebezpiecznym materiałem, chroni więc skutecznie "obie strony".
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Wszystko, co biologiczne, i tak wcześniej lub później zgnije, a na śmietniku leżą i w kanalizacji pływają wszelkie możliwe odpadki. Czy w związku z tym resztki przebadanych próbek śmiało możemy wyrzucić na śmietnik lub wylać do kanalizacji?
2. Wirus, biologicznie rzecz biorąc, to, z niewielką przesadą, prawie czysty materiał genetyczny. Czy to znaczy, ze wyizolowany wirusowy DNA lub RNA też jest zakaźny?
3. Bromek etydyny jest szkodliwy. Ale są znane także inne, nowocześniejsze i znacznie czulsze barwniki do kwasów nukleinowych. Czy one też są szkodliwe?
4. SDS w substancji to okropne paskudztwo. A w roztworze, kilku- lub kilkunastoprocentowy?
5. Czy "ciernista koniczynka" to znak ostrzegający przed radioaktywnością?
6. Nowe technologie znakowania prób /sond/ molekularnych są może i dobre, ale jeszcze długo nie zastąpią izotopów fosforu i siarki, bo radioaktywne znakowania są tańsze i czulsze, nieprawdaż?
7. Ozon to zdrowy, orzeźwiający gaz który na wakacjach czujemy w powietrzu po burzy. Jest więc oczywistością, że dobrze działa na nasze zdrowie także wtedy, gdy codziennie wdychamy go w naszym laboratorium, prawda?
8. Prawdziwa higiena jest wtedy, gdy nie żałujemy mydła, czy z tego wynika, że mycie rąk samą wodą nie ma żadnego sensu?
9. Do czego w pracowni biologii molekularnej służą dygestorium, laminar i glovesbox?
3. Materiał genetyczny człowieka.
W chwili pisania tych słów zastosowanie diagnostyczne w medycynie człowieka znalazły dwa rodzaje DNA, pochodzący z jądra komórkowego (zwany także DNA genomowym) oraz pochodzący z mitochondriów. W tym miejscu należy się lingwistyczna dygresja: DNA to kwas, czyli rodzaj męski. Studenci jednak często mówią o nim w rodzaju nijakim, „to DNA”. Jest to błąd gramatyczny, ale mnie on się podoba. W końcu DNA jest bezpłciowy (bezpłciowe!) i dobrze służy obu płciom, a więc ta gramatycznie błędna forma jest za to bardzo politycznie poprawna.
Ludzki genomowy DNA w pojedynczym jądrze komórkowym ma łączną długość około 3 miliardów nukleotydów i waży około 7 pg. Wypreparowany z jednej gamety utworzyłby helisę o całkowitej długości około 1 metra (a po jej rozwinięciu i naciągnięciu nitek do granic fizycznej wytrzymałości około półtora metra). Około 95% tego DNA nie pełni żadnej znanej nam funkcji, istnieją hipotezy że jest to regulator aktywności genów, "wypełniacz" chromosomów, pamiątka po prastarych przemianach ewolucyjnych a nawet... plan ewolucyjnych zmian które dopiero zajdą w przyszłości. Kodująca część genomu człowieka ma więc długość zaledwie około 150 mpz i zawiera ponad 30.000 genów. Ludzki DNA podzielony jest na 46 "kawałków", każdy odcinek tworzy jeden chromosom, największy z nich (nr 1) jest około sześć razy większy od każdego z najkrótszych (21, 22 i Y).
W porównaniu z DNA genomowym, DNA mitochondrialne na pierwszy rzut oka wygląda bardzo niepozornie, ponieważ obejmuje tylko około 16.000 pz. Jeżeli jednak uwzględnimy, że w komórce jest tylko jedno jądro ze 150 milionami kodujących zasad, natomiast kilkaset, a nawet więcej, mitochondriów, to niespodziewanie okaże się, że komórkowy kodujący DNA mitochondrialny to równoważnik wagowy ponad 10% kodującego DNA genomowego.
W każdej komórce organizmu ludzkiego posiadającej jądro komórkowe możemy znaleźć dwa rodzaje materiału genetycznego: DNA, czyli kwas deoksyrybonukleinowy (charakteryzujący się zdolnością do tworzenia regularnej helikoidalnej struktury przestrzennej, cukrem deoksyrybozą i jednopierścieniowymi zasadami pirymidynowymi tyminą i cytozyną) oraz RNA, czyli kwas rybonukleinowy, znamienny długimi odcinkami jednoniciowości, cukrem rybozą i pirymidynami uracylem i cytozyną. Oba kwasy zawierają takie same dwupierścieniowe zasady purynowe, adeninę i guaninę. Guanina ma zdolność do łączenia się z cytozyną trzema wiązaniami wodorowymi, a adenina dwoma takimi wiązaniami z tyminą (lub uracylem). Uwaga: w piśmiennictwie używane są czasami inne chemiczne nazwy związków wyżej wymienionych zasad: nukleozydy (zasady plus cukier), np. tymidyna, cytydyna, adenozyna i guanozyna, a czasami nawet precyzyjne określenia w rodzaju "nukleotydy" (zasada plus cukier plus reszta lub reszty fosforanowe), np. fosforan deoksyguanidyny, trójfosforan deoksyguanidyny itp.
Kwas deoksyrybonukleinowy ludzkiej komórki prawie zawsze występuje w swojej "naturalnej" postaci, którą jest dwuniciowa prawoskrętna helisa typu B. Oba łańcuchy helisy są przeciwbieżne ( "odwrotnie spolaryzowane" albo "antyrównoległe"), tam, gdzie jeden z nich ma koniec 5', drugi ma 3' i odwrotnie. Jest to bardzo istotne, niezrozumienie tego faktu prowadzi do pospolitego w podręcznikach genetyki błędu, polegającego na podawaniu informacji, że sekwencją komplementarną do np. sekwencji 5'AATGGTAACA3' jest sekwencja TTACCATTGT. Jest to oczywiście nieprawda, ponieważ końce tej rzekomo komplementarnej sekwencji są odwrotne, a więc prawdziwa sekwencja komplementarna (po uporządkowaniu końców) będzie wyglądać następująco: 5'TGTTACCATT3'. Powyższy wywód nie jest wcale, jak by się mogło na pierwszy rzut oka wydawać, nieistotnym mędrkowaniem, bez jego dogłębnego zrozumienia nie jest możliwe samodzielne konstruowanie primerów (starterów) niezbędnych do przeprowadzania reakcji PCR - patrz rozdział 9.
DNA ulega odwracalnej denaturacji cieplnej (topnieniu) w tym wyższej temperaturze, im większy odsetek zasad w topionym łańcuchu to pary G-C. Alkalizacja środowiska i dodatek niektórych substancji (np. mocznika, siarczanu dekstranu, glicerolu lub formamidu; uwaga: najczęściej stosowany formamid jest teratogenem!) wydatnie obniżają temperaturę topnienia, zwaną także często temperaturą hybrydyzacji (DNA ogrzewany się topi, schładzany - hybrydyzuje). Trzeci używany termin, denaturacja, nie jest najszczęśliwszy, ponieważ określenie to oznacza także w biochemii nieodwracalne uszkodzenie, podczas gdy topnienie nie uszkadza helisy DNA.
Normalny (najczęściej spotykany) układ organizacji procesów życiowych żywej komórki to DNA - RNA - białko. Początek syntezy RNA (kwasu rybonukleinowego) w jądrze ludzkiej komórki może być rozpoczęty na wiele sposobów, najczęstszy z nich polega na wykorzystaniu promotorowej sekwencji (boksu, czyli kasety) TATA, położonej około 25 pz przed miejscem rozpoczęcia syntezy RNA. Inna nazwa kasety TATA to Hogness Box, sekwencja ta może być znacznie dłuższa i najczęściej jest oskrzydlona sekwencjami bogatymi w G i C. Początek syntezy białka jest z reguły rozpoczynany od kodonu ATG, kodującego metioninę, i dlatego ten aminokwas jest zwykle pierwszym aminokwasem bardzo wielu rodzajów ludzkiego białka. Ludzkie geny są podzielone na eksony (exon, expressed region) i introny (intron, intervented region). Podczas syntezy pmRNA (prematured RNA, czyli surowego transkryptu) przepisywane są i eksony, i introny, a następnie w czasie dojrzewania mRNA (messenger RNA) introny są wycinane, często z wykorzystaniem autokatalitycznych właściwości cząsteczki RNA. Początek intronu jest zwykle rozpoznawany po sekwencji GT, koniec po sekwencji AG, poprzedzonej ciągiem bogatym w pirymidyny (T i C). Ostatnio ewolucjoniści powszechnie uważają, że geny poprzedzielane intronami oraz RNA są ewolucyjnie wcześniejsze od genów bez intronów i od powstania DNA.
Transkrypcja ludzkiego genu może być zakończona na szereg różnych sposobów, z których najpowszechniejszy polega na syntezie sekwencji AAGCGCCGxxxxxCGGCGCUUn - proszę zwrócić uwagę na palindromiczną komplementarność sekwencji tych zasad, powoduje ona samorzutne uformowanie się struktury "pętelki" względnie "spinki do włosów", a szereg Un powoduje łatwe oderwanie transkryptu od macierzystej nici DNA.
Obecnie czynione są intensywne wysiłki zaprzęgnięcia systemu replikacyjnego do użytecznej dla biologa molekularnego pracy, polegającej na amplifikacji materiału genetycznego bez wykorzystania klonowania genów lub reakcji PCR.
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Czy genom ludzki jest modelowym przykładem bardzo oszczędnej i celowej organizacji biologicznej, w której nie ma nic zbędnego i niepotrzebnego?
2. Czy DNA mitochondrialny to zaledwie bardzo drobny, wręcz nieistotny odsetek całego DNA obecnego w ludzkiej komórce? A właściwie to ile tego DNA jest w jednym jądrze?
3. Czym się różni DNA od RNA?
4. Czy adenina może wchodzić w skład RNA?
5. Jaki ciąg nukleotydów jest komplementarny do sekwencji 5'TGCAATGGAC3'?
6. Jak obniżyć temperaturę hybrydyzacji DNA?
7. Jaka jest sekwencja głównego promotora i głównego terminatora syntezy mRNA w ludzkich komórkach?
8. Co to jest ekson? A intron?
9. Jak można zwielokrotnić /namnożyć/ posiadaną przez nas niewielką ilość DNA?
Jednym z niewielu truizmów, wartych ciągłego powtarzania jest stwierdzenie, że wszelka praca z materiałem genetycznym człowieka bezwzględnie wymaga przed jej rozpoczęciem... posiadania, a więc wyizolowania tego materiału. Od tego zdawałoby się mało istotnego, wstępnego etapu jakże często zależy końcowy spektakularny sukces eksperymentu. Wbrew pozorom, izolacja materiału genetycznego wysokiej jakości nie jest wcale prosta.
DNA występuje w ludzkich komórkach głównie w dwu organellach : jądrze i w mitochondriach. Do wyizolowania DNA mitochondrialnego wcale nie trzeba najpierw izolować mitochondriów, preparuje się on "przy okazji", jako spora, kilkuprocentowa domieszka w czasie izolacji DNA jądrowego /genomowego/.
DNA genomowe występuje w komórkach jądrzastych, bezskuteczna byłaby więc próba izolacji DNA np. z odpłukanej masy erytrocytarnej, aczkolwiek pewne niewielkie ilości DNA można uzyskać i z tego źródła, pochodzi on z mitochondriów oraz z niedojrzałych, jeszcze jądrzastych krwinek czerwonych /retikulocytów/, w świeżo pobranej krwi średnio co setny erytrocyt ma jeszcze przez pewien czas jądro komórkowe.
DNA można izolować z praktycznie każdej ludzkiej tkanki, aczkolwiek z niektórych tkanek nie warto tego robić, z różnych powodów. I tak na przykład z tkanki płucnej uzyskuje się "brudne", ciemne preparaty z zawiesiną koloidalnych cząsteczek kurzu. Tkanka tłuszczowa jest trudna do homogenizacji, ponieważ "maże się", natomiast tkanka kostna jest bardzo twarda. Wątroba zawiera nukleazy, które degradują DNA, a śledziona duże ilości hemu /inhibitora reakcji PCR/. Niektóre komórki /np. plemniki, niektóre guzy nowotworowe, tkanki z formaliny/ źle się trawią proteinazą K, trzeba dodawać jej bardzo dużo i aktywować odczynnikiem tiolowym /DTT/. Wybrane tkanki ciała ludzkiego jako źródło izolacji DNA są wymienione w poniższej tabeli.
Tkanka |
g DNA/1 g tkanki |
Tkanka |
g DNA/1 g tkanki |
Krew |
30 |
Ślinianka |
270 |
Mózg |
125 |
Serce |
270 |
Mięsień |
200 |
Wątroba |
750 |
Tarczyca |
250 |
Gonada |
1950 |
Z tabeli wynika, że najlepszym źródłem izolacji DNA ze zwłok ludzkich są bez wątpienia gonady /jajniki i jądra/, i to niezależnie od wieku zmarłej osoby. W przypadku osób żywych najwygodniejszym, a więc najczęściej używanym materiałem do izolacji jest krew lub ślina, a ściślej wymaz nabłonków z jamy ustnej z domieszką śliny, najczęściej pobierany specjalną bibułową „skrobaczką”.
Izolacja DNA może być przeprowadzona na bardzo wiele sposobów, a metody stosowane w laboratoriach prawie zawsze są kompilacją możliwie dużej liczby technik źródłowych. Wykaz technik źródłowych jest przedstawiony na poniższym schemacie.
KOMÓRKA
JĄDRO KOMÓRKOWE
|
BIAŁKO |
|
|
DNA |
W tej chwili najbardziej rozpowszechnione techniki izolacji DNA w laboratoriach biologii molekularnej to metoda fenolowa i metoda solna /"nietoksyczna"/. Jeszcze lepsze wyniki osiągnąć można łącząc elementy obu tych metod. Wschodzącą gwiazdą wśród technik preparacji DNA jest metoda opierająca się na wykorzystaniu wiązania DNA przez pył silikonowy (krzemowy lub szklany) i następnie elucję (poprzez zmianę składu buforu, jego stężenia lub pH) związanego z pyłem DNA. W zastosowaniach medyczno - sądowych często stosuje się technikę cheleksową Bardzo dobry preparat DNA powinien mieć dużą lepkość, stężenie około 1mg/1ml, czystość spektrofotometryczną (iloraz absorbancji mierzonej przy A260nm/A280nm) zawartą pomiędzy wartością 1,6 a 1,8 a ponadto brak inhibitorów reakcji PCR oraz dużą trwałość, która umożliwia wieloletnie przechowywanie takiego preparatu.
RNA izoluje się do badań wówczas, gdy organizm który badamy nie zawiera DNA (np. jest retrowirusem), względnie wtedy, gdy nie interesuje nas czy dany gen jest obecny w genomie badanego organizmu, lecz to, czy ten gen jest aktywny, co przejawia się poprzez wytwarzanie odpowiedniego mRNA. RNA można izolować całościowo (za pomocą kwaśnego odczynnika fenolowego zwanego Trizolem) lub w postaci mRNA, wykorzystuje się wówczas fakt, że każda cząsteczka mRNA posiada strukturę poliA. Do izolacji używa się oligonukleotydów poliT, związanych z nośnikiem (celulozą, kulkami magnetycznymi itp).
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Czym preparacja DNA mitochondrialnego różni się od preparacji DNA genomowego?
2. Czy z erytrocytów można wyizolować DNA? Z leukocytów? Z płytek krwi? A z surowicy?
3. Których tkanek nie warto /jeżeli mamy wybór/ brać do izolacji ludzkiego DNA?
4. Która tkanka ze zwłok człowieka jest najodpowiedniejsza do izolacji DNA?
5. Jak wypreparować DNA z tkanki, która źle się trawi proteinazą K?
6. Jakie drogi izolacji DNA są możliwe do zastosowania?
7. Jakie metody izolacji DNA są najbardziej rozpowszechnione?
8. Jakimi parametrami charakteryzuje się dobry preparat DNA?
9. Jak wyizolować całościowy RNA? A jak jego najważniejszą frakcję, mRNA?
5. Enzymy restrykcyjne.
Enzymy te, zwane skrótowo restryktazami, czynnościowo są bakteryjnym "układem immunologicznym" - chronią przed zakażeniem wirusowym poprzez rozcinanie materiału genetycznego wirusa w krótkim momencie pomiędzy wstrzyknięciem materiału genetycznego wirusa a przestawieniem metabolizmu zaatakowanego mikroorganizmu na potrzeby agresora.
Terminologia restryktaz zwykle jest odzwierciedleniem łacińskiej nazwy bakterii, pierwsza litera pochodzi od rodzaju, dwie następne - od gatunku. I tak restryktaza Eco pochodzi z Escherichia coli, Alu z Anthrobacter luteus, Pst z Providencia stuarti itd.
Restryktazy rozcinają DNA mniej lub bardziej swoiście, rozpoznając przed cięciem określoną sekwencję nukleotydów. Rozpoznawany odcinek może być różnej długości, od 4 nukleotydów (restryktaza AluI, 5'AG
CT3') do 32 - 33 nukleotydów (restryktaza AloI, 5'
N7GAACN6TCCN12-13
3'). Sekwencja rozpoznawana może być ściśle określona (restryktaza Bsp143l, 5'
GATC3') lub z dopuszczalnymi niewielkimi (restryktaza MvaI, 5'CC
AvTGG3'), sporymi (restryktaza SduI, 5'GGvAvTGCCvAvT
C3') lub dużymi wariancjami (restryktaza Eco81l, 5'CC
TNAGG3').
DNA może zostać przecięte równo (niczym sznurek spleciony z dwu włókien przecięty nożem), czyni to np. restryktaza SmiI, 5'ATTT
AAAT3' lub z przesunięciem miejsca cięcia na obu łańcuchach o jeden /restryktaza MvaI, pierwszy łańcuch 5'CC
AvTGG3', drugi łańcuch 5'CC
TvAGG3'/, dwa /restryktaza Bsp119l, pierwszy łańcuch 5'TT
CGAA3', drugi łańcuch 5'TT
CGAA3'/, trzy /restryktaza Eco81l, pierwszy łańcuch 5'CC
TNAGG3', drugi łańcuch 5'CC
TNAGG3'/, cztery /restryktaza CfrI, pierwszy łańcuch 5'Py
GGCCPu3', drugi łańcuch 5'Py
GGCCPu3'/ a nawet pięć nukleotydów /restryktaza Eco91l, pierwszy łańcuch 5'G
GTNACC3', drugi łańcuch 5'G
GTNACC3'/. W przypadku równego cięcia mówimy o "tępych" a w przypadku nierównego o "lepkich" końcach rozciętego łańcucha DNA. Pojawianie się lepkich końców jest bardzo użyteczne w manipulacjach genetycznych, ponieważ możemy sztucznie łączyć ze sobą obce fragmenty DNA, cięte tą samą restryktazą, fragmenty te na zasadzie hybrydyzacji przytrzymane zostaną przy sobie na krótki czas potrzebny do zadziałania ligazy - enzymu naprawczego który łączy przerwane łańcuchy DNA.
Znane są restryktazy które tną wewnątrz rozpoznawanej sekwencji DNA /np. Eco105l, 5'TAC
GTA3'/, na zewnątrz tej sekwencji w bliskiej /restryktaza Mva1269l, 5'GAATGCN
3'/ odległości, daleko od niej /restryktaza HphI, 5'GGTGAN8
/ lub dwukrotnie, po jej obu stronach /PpiI, 5'
N7GAACN5CTCN13
/.
Powstaje pytanie, skąd restryktaza bakteryjna "wie" które DNA jest "obce" a które "własne", a więc nie powinno być cięte? Mechanizmem ochronnym może być metylacja własnego DNA, wiele restryktaz występuje w parze z odpowiednią metylazą /np. restryktaza PstI, 5'CTGCA
G3' oraz metylaza PstI, 5'CTGCA(CH3)G3'/. Od tej reguły są jednak wyjątki, i tak np. restryktaza DpnI rozcina wyłącznie zmetylowany łańcuch DNA 5'GA(CH3)
TC3', oszczędzając niezmetylowany. Wydaje się więc, że najpewniejszym mechanizmem ochronnym jest po prostu taka sekwencja nukleotydów rozpoznawana przez restryktazę, która w ogóle nie występuje w DNA danej bakterii, natomiast mechanizm metylacji gra główną rolę w wyciszaniu zbędnych genów.
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Jaka jest biologiczna funkcja enzymów restrykcyjnych? Czy restryktazy występują u kręgowców?
2. Jak tworzy się nazwy restryktaz?
3. Co to jest sekwencja rozpoznawana przez restryktazę? Jakie mogą być rodzaje takiej sekwencji?
4. Co to są "lepkie końce" i do czego je można wykorzystać?
5. Gdzie może leżeć miejsce cięcia względem sekwencji rozpoznawalnej przez restryktazę?
6. Jak bakteria chroni się przed pocięciem własnego DNA?
6. Elektroforeza i detekcja DNA i RNA
Kwasy nukleinowe można analizować za pomocą elektroforezy, czyli wędrówki cząsteczek w polu elektrycznym prądu stałego (dotyczy to krótkich łańcuchów, od 30 do 20000 pz) lub prądu zmiennego (łańcuchy do 1,5 mpz), ale nie prądu przemiennego.
Szybkość wędrówki cząsteczki zależy wprost proporcjonalnie od jej ładunku (a ten z kolei od pH środowiska) i od siły pola elektrycznego wyrażanej zazwyczaj w woltach na centymetr nośnika, oraz odwrotnie proporcjonalnie od wielkości cząsteczki (a ściślej od jej kształtu) i od oporu, stawianego przez nośnik (opór ten rośnie wraz ze wzrostem lepkości oraz ze zmniejszaniem się porów nośnika). Parametrami powyższymi można manipulować, ale w umiarkowanych granicach, np. ekstremalne wartości pH mogą uszkodzić rozdzielaną substancję, nadmierne zwiększanie napięcia powoduje przegrzewanie się nośnika, a zmniejszanie lepkości i powiększanie porów powoduje wzrost konwekcyjnych prądów w buforze oraz zanik efektu sita molekularnego.
Elektroforeza kwasów nukleinowych obecnie przeprowadzana jest głównie na żelach agarozowym i akryloamidowym oraz w tzw. płynnych (nisko spolimeryzowanych) żelach akryloamidowych w kapilarach. Elektroforeza akryloamidowa jest powszechnie, chociaż niesłusznie uważana za bardziej precyzyjną od agarozowej oraz (słusznie) za tańszą. Zaletami żelu poliakryloamidowego są niskie koszta oraz możliwość wybarwiania rozdzielonych frakcji DNA poprzez srebrzenie, które daje wyraźne, widoczne gołym okiem i trwałe obrazy. Wady, to trudność w opanowaniu przez osoby początkujące techniki polimeryzacji akryloamidu, jednorazowe użycie żelu, silna neurotoksyczność monomerów oraz słabsze niż w przypadku żelu agarozowego wybarwianie DNA przy pomocy bromku etydyny. Zaletami agarozy są łatwość sporządzania żelu, możliwość jego wielokrotnego wykorzystania i silne wybarwianie DNA z bromkiem etydyny, natomiast wady to stosunkowo wysoki koszt i brak możliwości srebrzenia.
Wybarwianie DNA elektroforetycznie rozdzielonego na żelu może być przeprowadzane za pomocą bromku etydyny lub innego, podobnego barwnika /np. SYBR Gold, który jest o wiele czulszy i mniej ekologicznie szkodliwy, lecz znacznie droższy/, natomiast w przypadku elektroforezy kapilarnej szczególnie popularne jest wielokolorowe barwienie fluorescencyjne, wykorzystujące wzbudzoną laserem fluorescencję wbudowanych w łańcuch DNA fluorochromów. Coraz rzadziej jest stosowana detekcja poprzez srebrzenie żeli poliakryloamidowych.
Przy użyciu bromku etydyny RNA wybarwia się znacznie słabiej niż DNA, i dlatego w ostatnim okresie coraz powszechniej stosowane są specjalne barwniki do barwienia RNA, np. "Radiant Red RNA stain" albo "SYBR Green II RNA gel stain".
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Jaki rodzaj prądu elektrycznego można zastosować w elektroforezie kwasów nukleinowych?
2. Od czego zależy szybkość wędrówki rozdzielanej substancji?
3. Na jakich podłożach rozdziela się kwasy nukleinowe?
4. Wymień zalety i wady żeli - poliakryloamidowego i agarozowego.
5. Jak wybarwić żel w celu uwidocznienia rozdzielonych frakcji DNA? Lub RNA?
7. Blotting i hybrydyzacja
Po zakończeniu elektroforezy żel, zwłaszcza agarozowy, można wysuszyć na specjalnym próżniowym stoliku i przeprowadzić bezpośrednio na żelu hybrydyzację, ale jest to trudny i kapryśny zabieg, i dlatego hybrydyzacja zwykle jest poprzedzona przeniesieniem frakcji rozdzielonego kwasu nukleinowego z żelowego placka na arkusz folii. Zabieg ten nosi nazwę blotingu (transferu, plamienia, stemplowania). Na początku używano folii z azotanu celulozy, ale ze względu na słabe wiązanie kwasów nukleinowych i niebezpieczeństwo zapłonu (azotan celulozy jest głównym składnikiem prochu strzelniczego) obecnie prawie wyłącznie stosuje się folie nylonowe. Bloting może być kapilarny, próżniowy, elektryczny mokry lub elektryczny półsuchy (popularny kiedyś bloting odśrodkowy został już zaniechany). Bloting kapilarny fragmentów DNA został wymyślony w 1975 roku przez dr Southerna z Oxfordu i dlatego nosi nazwę "southern blotting". Nazwa ta dała powód do językowych krotochwili, i tak transfer RNA pospolicie nosi nazwę "northern blotting", transfer białek "western blotting" a transfer białek po elektroforezie dwukierunkowej nazywany bywa "eastern blottingiem".
Po zakończeniu blotingu należy dać przeniesionemu materiałowi genetycznemu czas na trwałe związanie się z folią, w tym celu należy folię wysuszyć i pozostawić w spokoju w temperaturze pokojowej na dwa tygodnie. Jeżeli nie można czekać, folię można zapiec przez 2 godziny w +80o C, względnie przez 3 minuty na transiluminatorze albo przez kilkanaście sekund używając specjalnego ultrafioletowego pieca do zapiekania.
Zapieczoną folię można hybrydyzować. Przebieg hybrydyzacji przedstawia rysunek.
Hybrydyzacja polega na połączeniu jednoniciowego kwasu nukleinowego na blocie (jednoniciowość zapewniamy poprzez użycie RNA lub prowadzenie blotingu w alkalicznym środowisku) z sondą (próbą) molekularną którą jest jednoniciowy fragment kwasu nukleinowego o sekwencji komplementarnej do sekwencji, którą chcemy wykryć i o długości zapewniającej wiązanie się tylko z tą właśnie sekwencją. Pierwszy udany zabieg hybrydyzacji DNA-RNA wykonali Hall i Spiegelman w 1961 roku. Obecnie jako hybrydyzującej próby prawie wyłącznie używa się sztucznie zsyntetyzowanych łańcuchów oligonukleotydowych, najczęściej wyznakowanych już w trakcie ich syntezy (np. w testach typu "ASO Dot Blot").
W czasie przeprowadzania hybrydyzacji musimy zadbać o to, aby odbyła się ona we właściwej temperaturze. Temperaturę tę wstępnie ustala się korzystając z różnych wzorów, np. ze wzoru t = 69,3oC + 0,41[%G+C] - 650/n (n oznacza ilość par zasad w hybrydyzującej części próby molekularnej), ale zwykle jest to tylko ustalenie wstępne i ostateczną temperaturę ustala się metodą prób i błędów. UWAGA: tego wzoru nie należy stosować do obliczania temperatury hybrydyzacji primera w czasie przeprowadzania reakcji PCR - do tego celu służą inne wzory, które zostaną podane w rozdziale o przeprowadzaniu reakcji PCR. Jednym ze składników mieszaniny hybrydyzacyjnej jest bardzo często roztwór Denhardta, drugim zaś substancja blokująca folię w miejscach, w których hybrydyzacja nie zachodzi (bez niej próba łączyłaby się z folią i tło byłoby bardzo ciemne). Substancją tą zwykle jest bardzo czysta kazeina, ale można w tym celu użyć także... zwykłego odtłuszczonego mleka w proszku!
Po zakończeniu hybrydyzacji należy uwidocznić połączenie kwasu nukleinowego z próbą (sondą) molekularną. Można tego dokonać za pomocą autoradiografii (przy użyciu radioaktywnych prób) albo bez użycia izotopów, metodą chemiluminescencyjną albo wykorzystując reakcję barwną enzymu, połączonego bezpośrednio lub pośrednio z sondą.
Technika radioaktywna jeszcze niedawno była bardzo popularna, lecz obecnie z powodów BHP i ekologicznych bardzo szybko traci popularność na korzyść technik nie izotopowych.
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Jaką czynność należy wykonać po zakończeniu elektroforezy, przed hybrydyzacją?
2. Jakie znasz rodzaje transferu (blotingu)?
3. Co to jest zapiekanie folii (blotu) i jak można je wykonać?
4. Jak wyznaczyć właściwą temperaturę hybrydyzacji?
5. Po co blokuje się folię w czasie hybrydyzacji? Jak to zrobić?
6. Jak uwidocznić miejsca w których na blocie zaszła hybrydyzacja?
8. Odwrotna transkrypcja
Technikę odwrotnej transkrypcji stosuje się podczas pracy z RNA. Wykorzystuje się tu zdolność niektórych polimeraz do syntezy potomnej nici DNA na macierzystej nici RNA. DNA wytworzone za pomocą tej techniki nosi nazwę cDNA i może być badane technikami badania DNA (np. klonowania, PCR, restrykcji enzymatycznej lub hybrydyzacji). Obecnie do przeprowadzania reakcji odwrotnej transkrypcji wykorzystuje się szereg enzymów, których właściwości ujmuje poniższa tabela.
Nazwa i pochodzenie enzymu |
Jon aktywujący |
Uwagi |
Tth Polymerase z Thermus thermophilus |
Mn++ |
Termostabilna odwrotna transkryptaza, która z jonami magnezu wykazuje aktywność zwyczajnej polimerazy DNA |
MMuLV Rewerse Transkryptase z Moloney Murine LeucemiaVirus |
Mg++ |
Obecnie najpowszechniej stosowana odwrotna transkryptaza |
AMV Reverse Transkryptase z Avian Myeloblastosis Virus |
Mg++ |
Coraz powszechniej stosowana odwrotna transkryptaza |
Cth Polymerase Klenow Fragment z Carbohydrothermus hydrogenoformans |
Mg++ |
Stosowana w mieszaninie z Taq polimerazą do jednostopniowej reakcji RT-PCR |
Ostatnia z polimeraz wymienionych w tabeli jest o tyle ciekawa, że może być zastosowana do jednostopniowej reakcji RT-PCR. Typowa reakcja RT-PCR składa się z dwu etapów: odwrotnej transkrypcji polegającej na uzyskaniu cDNA i właściwej reakcji PCR przeprowadzonej z wykorzystaniem jako wzorca uzyskanego cDNA. Przy użyciu termostabilnych fragmentów Klenow'a Cth polimerazy zmieszanych z Taq polimerazą można od razu przystąpić do reakcji PCR, cDNA będzie wówczas produkowane w postępie arytmetycznym a następnie amplifikowane w postępie geometrycznym.
Reakcję RT-PCR stosuje się najczęściej wtedy, gdy chcemy się przekonać nie tyle o tym, czy w genomie badanego organizmu dany gen jest, ale o tym, czy ten gen jest aktywny (czy działa, czyli czy wytwarzany jest odpowiedni mRNA).
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Jak w laboratorium przepisać informację zawartą w nici RNA na nić DNA?
2. Jakie enzymy stosuje się do tego celu?
3. Czy reakcję PCR można przeprowadzić używając jako wzorzec nie DNA, ale RNA?
4. Kiedy stosuje się reakcję RT-PCR?
9. Reakcja PCR
Reakcja PCR obecnie jest uważana za najważniejsze narzędzie w pracowni biologa molekularnego. Do przeprowadzenia reakcji potrzebne jest odpowiednie oprzyrządowanie (patrz koniec tego rozdziału), zestaw odczynników który można kupić w wielu firmach oraz primery (startery) czyli dwa oligonukleotydy których syntezę można zamówić w dowolnej, wyspecjalizowanej firmie biotechnologicznej. Samodzielne konstruowanie primerów opiera się na następujących zasadach:
Z banku genów uzyskujemy sekwencję genu.
Wybieramy taki fragment genu, który ma długość od 21 do 27 nukleotydów, rekomendowane jest 24, stosunek zasad C+G do A+T powinien być jak najbliższy 50%. Przepisujemy ten fragment i nadajemy mu zrozumiałą dla nas krótką nazwę z dodatkiem na końcu litery F ("forward"). Przykładowo, dla genu amylazy nazwa ta może brzmieć „AMYF”.
W odległości od 150 do 450 nukleotydów od końca primera F szukamy odcinka o takiej samej długości i takim samym procentowym stosunku zasad GC do AT, jeżeli możliwe, to zaczynającego się od litery G lub C (względnie dwu takich liter, ale nie więcej). Przepisujemy go "od końca" i "komplementarnie", nazywając tak samo jak primer F, ale z dodatkiem na końcu litery R ("reverse"). Przykład: wybrana według powyższych wskazówek sekwencja genu amylazy 5'GTG CAC TTA GGT CAT GCA TTC TGC3' , przetłumaczona na zapis primeru R będzie miała postać „AMYR 5'GCA GAA TGC ATG ACC TAA GTG CAC 3'”.
Sprawdzamy, czy ostatnie trzy (lub więcej) nukleotydy każdego z primerów nie są komplementarne do czytanej wspak sekwencji drugiego primera. Przykład: w primerze F nie może w żadnym miejscu być sekwencji GTG, GTGC, GTGCA itd.
Jeżeli primery konstruujemy nie do reakcji PCR, ale RT-PCR, musimy sprawdzić czy wybrane przez nas startery nie leżą w sekwencji intronowej oraz czy pomiędzy nimi nie znajduje się intron.
Schemat reakcji PCR jest przedstawiony na poniższej ilustracji (po kliknięciu rysunku otwiera się powiększenie).
|
|
|
zielony - primer F |
|
CYKL I |
czerwony - primer R |
|
|
kolejne strzałki - numery 1-10 |
|
CYKL II |
|
|
|
|
|
CYKL III |
1 - macierzysty dwuniciowy DNA |
||
Do przedstawionego schematu można dodać następujące uwagi:
Primery (startery) przyłączają się do obu nici, każdy z nich do innej i łącznie wyznaczają długość dwuniciowego fragmentu DNA, który będzie amplifikowany.
Synteza DNA biegnie od końca 3' primera, a ponieważ łańcuchy DNA są przeciwbieżne, więc synteza nowych łańcuchów na obu niciach biegnie pozornie w odwrotne strony.
W drugim cyklu reakcji PCR powstają niespecyficzne ("za długie") łańcuchy, których ilość przyrasta w kolejnych cyklach w postępie arytmetycznym.
W trzecim i następnych cyklach reakcja PCR tworzy specyficzne łańcuchy, o długości zdeterminowanej przez primery, a ich ilość przyrasta w postępie geometrycznym.
Prawdopodobieństwo przyłączenia się primerów do nowo zsyntetyzowanego DNA, a nie do DNA macierzystego jest tym większe, im więcej zaszło cykli. Taka zależność ma znaczenie praktyczne, ponieważ termiczna denaturacja krótszych fragmentów DNA jest łatwiejsza. Temperatura topnienia ("denaturacji") w miarę upływu czasu może być więc obniżana. Można w ten sposób zwiększyć trwałość polimerazy, termostabilnej z nazwy, ale w rzeczywistości posiadającej ograniczoną wytrzymałość na temperaturę przekraczającą +80oC.
Temperatura hybrydyzacji (ang. annealing) zależy głównie od budowy primerów, tzn. im więcej jest G/C w stosunku do A/T, tym jest ona wyższa. Inne czynniki wpływające na tę temperaturę to długość startera oraz skład buforu reakcyjnego. Przy długości primera 14-19 oraz 36-70 bp temperaturę tę można obliczyć zgodnie z wzorem Tm = 81,5 + 16,6 [log10(J+)] + 0,41 (%GC) - (600/L) - 0,63(%F) gdzie J+ to stężenie jonów jednowartościowych, L to długość primera w bp a F to procentowe stężenie formamidu (przy braku formamidu ten człon równania wynosi 1). Przy długości primera 20-35 bp wygodniej jest stosować uproszczoną formułę Tm = [0,5 x (TmF + TmR)] - 7o C, gdzie TmF i TmR to temperatury podane na "metryczkach" przez wytwórcę primerów. Niestety, czasami może się okazać, że rzeczywista temperatura hybrydyzacji różni się od wyliczonej nawet o 12o C. Z tego powodu w praktyce laboratoryjnej najlepiej jest ustalać temperaturę hybrydyzacji doświadczalnie, przy użyciu termocyclera z termogradientowym blokiem grzewczym.
Optymalna temperatura syntezy ("elongacji") produktu reakcji PCR zależy od pochodzenia termostabilnej DNA polimerazy. Dla najczęściej stosowanej Taq polimerazy wynosi ona około +72o C.
Niezgodność na końcu 5' sekwencji startera z macierzystym DNA nie ma większego znaczenia dla przebiegu reakcji PCR.
Reakcję PCR zazwyczaj przeprowadza się w specjalnych urządzeniach zwanych termocyclerami (amplifikatorami), ale można ją przeprowadzić także ręcznie, z zegarkiem w ręku, używając trzech termostatów nastawionych na trzy temperatury cyklu. Reakcja PCR składa się zazwyczaj z 30 cykli i trwa w zależności od programu i rodzaju amplifikatora od 2 do 4 godzin, ale najszybsze dostępne obecnie termocyclery potrafią uporać się z zadaniem w czasie poniżej 30 minut. Kluczowym odczynnikiem w reakcji PCR jest termostabilna polimeraza DNA. Obecnie na rynku znajduje się szereg różnych polimeraz, najważniejsze z nich zostały wymienione w poniższej tabeli.
Nazwa (pochodzenie) |
Uwagi |
Producent |
Taq polymerase (Thermus aquaticus) |
Pierwsza termostabilna polimeraza na rynku, obecnie produkowana głównie metodami inżynierii genetycznej |
Pierwszy: Cetus Obecnie : wiele firm |
Taq Klenow Fragment (Thermus aquaticus) |
Taq polimeraza częściowo strawiona proteazą, ma zwiększoną termostabilność |
Wiele firm |
Taq Stoffel Fragment (Thermus aquaticus) |
Cząsteczka Taq polimerazy pozbawiona 289 aminokwasów, o zwiększonej termostabilności, wymaga więcej magnezu |
Applera |
Tth polymerase (Thermus thermophilus) |
Z jonami manganu ma aktywność odwrotnej transkryptazy, magnezu - polimerazy DNA |
Wiele firm |
Cth polymerase (Carbohydrothermus hydrogenoformans) |
Fragment Klenow'a tej DNA polimerazy ma aktywność odwrotnej magnezozależnej transkryptazy. |
Roche |
Tma polymerase (Thermatoga maritima) |
Zwiększona termostabilność, duża dokładność |
Applera |
Pfu polymerase (Pyrococcus furiosus) |
Zwiększona dokładność |
Stratagene |
Tfl polymerase (Thermus flavus) |
|
Bioline |
Bst polymerase (Bacillus stearothermophilus) |
|
Biorad |
Tgo polymerase (Thermococcus gorgonarius) |
Bardzo duża dokładność |
Roche |
Tli polymerase (Thermococcus litoralis) |
Ekstremalna termostabilność, duża dokładność |
BioLabs |
Niektóre z zawartych w powyższej tabeli termostabilnych polimeraz charakteryzują się zwiększoną dokładnością syntezy "dorabianego" łańcucha DNA. Na ogół jest to skorelowane z posiadaniem przez enzym dodatkowej aktywności ezgonukleazy 3'-->5'. Jeżeli enzym przyłącza błędny nukleotyd, to wskutek niesparowania "odstaje" on od macierzystej nici i natychmiast zostaje odcięty, po czym polimeraza na nowo podejmuje swoją działalność.
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Ile primerów (starterów) jest potrzebnych do przeprowadzenia reakcji PCR?
2. Jak samemu skonstruować primery do reakcji PCR? RT-PCR?
3. Dlaczego przy konstruowaniu primerów do reakcji RT-PCR należy wystrzegać się sekwencji intronowych?
4. W którym kolejnym cyklu reakcji PCR po raz pierwszy otrzymamy produkty syntezy o żądanej długości?
5. Który koniec primera jest wydłużany przez polimerazę?
6. Czy można przeprowadzić reakcję PCR bez dostępu do termocyclera?
7. Dlaczego polimeraza DNA użyta w reakcji PCR musi pochodzić z termofilnego organizmu?
8. Czy temperaturę hybrydyzacji można w przybliżeniu ustalić za pomocą obliczeń arytmetycznych?
9. Jaką wspólną cechę mają wszystkie polimerazy DNA używane w reakcji PCR, niezależnie od źródła pochodzenia?
10. Sekwencjonowanie DNA
Pierwsze udane próby sekwencjonowania DNA podjęto w 1965 roku. Sekwencjonowanie polega na ustaleniu kolejności nukleotydów. Jeżeli chcemy ustalić kolejność nukleotydów w RNA, należy najpierw uzyskać cDNA za pomocą odwrotnej transkrypcji. Wynik sekwencjonowania na ogół wieńczy dzieło - zazwyczaj jest końcowym etapem wszelkich badań przeprowadzanych w pracowni biologii molekularnej. Z dwu, niedawno prawie równie popularnych technik sekwencjonowania, Maxama-Gilberta i Sangera ostatnio stosowana jest wyłącznie ta druga. Wprowadzony przez firmę Perkin-Elmer (obecnie Applera) system znakowania trójfosforanów czterech dideoksynukleotydów fluorochromami w czterech różnych kolorach okazał się bezkonkurencyjny i w szybkim tempie wypiera wszelkie inne techniki sekwencjonowania oparte na technice Sangera. Spośród trzech konkurencyjnych wariantów tej metody (ze znakowanymi primerami i kolejno z każdym z nieznakowanych trójfosforanów deoksynukleotydów "Dye Primer Sequencing", kolejno z każdym ze znakowanych trójfosforanów deoksynukleotydów "Cycle Sequencing" i z mieszaniną nieznakowanych trójfosforanów deoksynukleotydów i znakowanych trójfosforanów dideoksynukleotydów "Dye Terminator Sequencing") ta ostatnia wygrała nieformalne lecz zażarte współzawodnictwo, ponieważ była stosowana przez oba konkurujące zespoły naukowe, które z sukcesem zakończyły sekwencjonowanie genomu człowieka. W technice tej używa się pojedynczego startera. Jeżeli do nici oligonukleotydowej losowo przyłączy się deoksynukleotyd, nić ta może być dalej wydłużana. Jeżeli natomiast los zrządzi, że przyłączy się dideoksynukleotyd, to następuje zakończenie (terminacja) wydłużania, a kolor fluorochromu daje informację który z dideoksynukleotydów zakończył łańcuch. W wyniku reakcji uzyskuje się więc kilkaset produktów reakcji dłuższych jeden od drugiego o pojedynczy znakowany dideoksynukleotyd, a elektroforeza kapilarna o wysokiej rozdzielczości pozwala na ustalanie koloru piętna, jednego po drugim. Dla pewności, że reakcja sekwencjonowania przebiegła prawidłowo, równolegle sekwencjonuje się drugą nić z drugim primerem, i porównuje się, czy uzyskane sekwencje są komplementarne na całej długości.
W fazie eksperymentów znajdują się inne, zupełnie nowe techniki sekwencjonowania, np. technika z wykorzystaniem lucyferazy i apyrazy, technika mikromatrycowa i inne.
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Jakie są możliwości ustalenia kolejności nukleotydów w DNA?
2. Jak przebiega sekwencjonowanie najczęściej stosowaną technika „Dye Terminator
Sequencing”?
11. Zastosowanie biologii molekularnej w medycynie sądowej
W medycynie sądowej techniki biologii molekularnej znalazły zastosowanie przy identyfikacji osób i próbek krwi oraz przy badaniu śladów biologicznych.
Identyfikacja osób. Z tym zagadnieniem mamy do czynienia w przypadku podejrzenia zamiany noworodków w szpitalach oraz przy ustalaniu pokrewieństwa do celów spadkowych lub emigracyjnych. Zbliżonym zagadnieniem jest identyfikacja nieznanych zwłok w sytuacji, w której inne metody identyfikacji indywidualnej (okazanie zwłok rodzinie, daktyloskopia, odontologia lub superprojekcja) nie mogą być przeprowadzone. Możliwość wydania opinii zależy od zakresu wykonanego badania. Przy wąskim zakresie często nie można wydać użytecznej opinii, natomiast po zbadaniu polimorfizmu DNA w szerokim zakresie dość często można wydać opinię "twardą", o bardzo wysokim stopniu prawdopodobieństwa prawdziwości konkluzji.
Identyfikacja próbek krwi. Badanie to przeprowadza się w przypadku podejrzenia zamiany próbek krwi pobranej w celu stwierdzenia obecności niedozwolonych substancji (alkoholu, narkotyków, leków) lub, rzadziej, pobranej do dochodzenia ojcostwa. Praktyka wykazała, że spotykane są cztery rodzaje zamiany: a/ na krew zwierzęcą, b/ na krew ludzką bez dobierania grupy, c/ na krew ludzką zgodną w zakresie AB0 i Rh oraz d/ na krew tego samego człowieka (po pozbyciu się inkryminowanej substancji). Zamiany typu "a", "b" i "c" są (przy użyciu technologii DNA) wykrywane w 100%. Zamiany typu "d" są niewykrywalne, jednakże prawidłowa organizacja pracy w laboratoriach alkoholowych i toksykologicznych może bardzo utrudnić tego typu przestępczą działalność.
Badanie śladów biologicznych. Najczęściej do badania są przysyłane ślady krwi. W badaniu kryminalistycznym można określić, czy jest to krew ludzka, a jeżeli tak, to czy "zwykła" względnie miesiączkowa albo połogowa.
Śladami biologicznymi są też, spotykane w przestępstwach seksualnych, ślady nasienia. Nasienie jest często wymieszane z wydzielinami ciała ofiary przestępstwa, i dlatego (jeżeli ofiara była kobietą) szczególnie wartościowe wyniki osiąga się oznaczając w takich śladach jedynie cechy genetyczne determinowane przez geny obecne na chromosomie Y.
Innym rodzajem śladów biologicznych są tkanki. Badane są po znalezieniu szczątków ludzkich względnie narzędzi, którymi dokonano zabójstwa lub uszkodzenia ciała ofiary. Znajdywane też bywają na pojazdach mechanicznych. Oprócz oznaczenia przynależności gatunkowej i badań genetycznych tkanki można badać histologicznie.
Ciekawym rodzajem śladu biologicznego są włosy. Jeżeli włosy są obcięte, urwane lub odłamane, to można w nich określić jedynie cechy morfologiczne, grupę krwi w układzie AB0 i niekiedy cechy DNA mitochondrialnego. Obecność cebulki umożliwia określenie płci oraz polimorficznych cech genomowego DNA.
Kolejnym rodzajem rutynowo badanych śladów biologicznych są ślady śliny. Bada się je głównie na niedopałkach papierosów, znaczkach, kopertach, gumie do żucia i ciele lub odzieży osób gryzionych przez napastnika.
Ostatnim rodzajem rutynowo badanych śladów biologicznych są próbki moczu, w którym znajduje się zwykle wystarczająco dużo komórek nabłonkowych, aby można było przeprowadzić badanie polimorfizmu DNA.
Badania dowodów rzeczowych powinny być przeprowadzone w zakresie zapewniającym szansę przypadkowego powtórzenia oznaczonego zbiegu cech rzadziej niż raz na dziesięć tysięcy.
W ostatnich latach coraz wyraźniej odchodzi się od badań śladów biologicznych w kierunku stwierdzenia tradycyjnych cech grupowych (np. grup w układzie AB0). Jest to coraz powszechniej uważane za "marnowanie materiału" i zastępowane badaniami polimorfizmu DNA. Przed wykonaniem badania śladów krwi można je ocenić pod kątem przydatności w dostarczeniu informacji o przebiegu zdarzenia, np. o ilości, sile i kierunku zadanych ciosów, przebiegu zdarzenia, lokalizacji ofiary w pomieszczeniu itp.
Niektóre z technik badawczych stosowanych w kryminalistyce znalazły zastosowanie w archeologii. Prowadzone są badania zmumifikowanych zwłok, a nawet pojedynczych kości, zwłaszcza czaszki i kości kończyn. Nie wiek szczątków ludzkich, ale warunki środowiska, w których przebywały, decydują o sukcesie tych badań.
W medycynie sądowej techniki biologii molekularnej zastąpiły metody stosowane wcześniej i umożliwiły spełnienie stuletniego marzenia genetyków sądowych - indywidualnej identyfikacji krwi ludzkiej i wszelkiego innego materiału biologicznego.
Dochodzenie spornego ojcostwa. W Polsce badania kontynuuje się do uzyskania prawdopodobieństwa ojcostwa nie mniejszego niż 99,9999%. Z pomocą oznaczania tradycyjnych grup krwi osiągnięcie tego stopnia prawdopodobieństwa w zasadzie też było możliwe, ale zdarzało się to raz na kilkaset badań, a nie w każdym badaniu, jak obecnie. Do ustalania spornego ojcostwa można zastosować:
1. Badanie DNA restrykcyjno - hybrydyzacyjne (bardzo skuteczne ale kosztowne, pracochłonne i długotrwałe, obecnie w wyraźnym zaniku)
2. Badanie DNA mikrosatelitarne zwane także badaniem PCR względnie multipleksowym (prawie tak skuteczne jak poprzednie, obecnie dominujące)
3. Badanie DNA sekwencyjne (bardzo skuteczne badanie przyszłościowe, obecnie znajduje się we wstępnym stadium rozwojowym, nie wiadomo, czy rozwinie się w kierunku sekwencjonowania DNA, czy raczej stwierdzania punktowych zmian typu SNP przy użyciu technologii mikrochipowej)
Niekiedy sporne dzieci, badane w sprawie o ustalenie ojcostwa są wieloraczkami, najczęściej bliźniętami. Bliźnięta mogą być dwujajowe z jednego cyklu jajeczkowania (ang. superfecundation) lub z dwu kolejnych cykli (ang. superfetation). W obu przypadkach mogą mieć tego samego ojca lub dwu różnych ojców. Mogą też być jednojajowe i wtedy zwykle powstają z jednego jaja i jednego plemnika, tzn. w wyniku podziału zygoty na dwa płody. Możliwe są jednak także bliźnięta jednojajowe lecz dwuplemnikowe. Z taką osobliwą sytuacją mamy do czynienia wówczas, gdy zostanie zapłodnione nie jajo, ale jeszcze oocyt, który się jeszcze raz podzieli, tworząc zygotę i dodatkowe jajo, które może zostać zapłodnione przez inny plemnik, pochodzący od tego samego lub nawet innego mężczyzny (ostatnia możliwość jest czysto teoretyczna, nie znaleziono jeszcze takiego przypadku).
Najogólniej, badanie DNA dla potrzeb medycyny sądowej można podzielić na trzy rodzaje:
Badanie "zwykłych" cech grupowych (np. AB0 lub HLA), przeprowadzane nie na poziomie antygenu, lecz na poziomie genu.
Badania uzupełniające, mające zwiększyć "moc dowodową" ekspertyzy wykonanej w zakresie tradycyjnym lub mające doprowadzić wydawaną opinię do wymaganej „siły dyskryminacyjnej”.
Badania molekularne wykonane w specjalnie wyznaczonym zakresie (najczęściej ustalanym przez organizacje międzynarodowe, chodzi o możliwość porównania wyników badań wykonanych w różnych krajach, ponieważ przestępczość międzynarodowa nie jest już wyjątkiem, stała się raczej regułą).
Polimorfizm kwasu deoksyrybonukleinowego.
Polimorfizm DNA można z grubsza podzielić na trzy główne rodzaje: polimorfizm typu VNTR (Variable Number Tandem Repeats), mikrosatelitarny czyli STR (Short Tandem Repeat) i typu SNP (Single Nucleotide Polymorphism).
Polimorfizm VNTR. W ludzkim DNA około 95% nie koduje białek. W tej masie DNA o niejasnej funkcji występują powtarzalne sekwencje, a powtarzalność ta realizuje się na trzy sposoby: "high" od 10.000 do 1.000 kopii, "medium" od 1.000 do 100 kopii i "low" od 100 do 2 kopii. Główna strefa wysokopowtarzalnego DNA znajduje się na chromosomach w okolicach centromerów. Ten rodzaj DNA jest odpowiedzialny za wystąpienie polimorfizmu typu VNTR. Genetycy sądowi uważają, że polimorfizm ten daje bardzo wartościową informację, ale koszt, pracochłonność i długotrwałość badań sprawiają, że badania tego typu prawie już całkowicie zanikły.
Polimorfizm mikrosatelitarny. W obrębie niekodujących wstawek zawartych w genach (sekwencje intronowe) możemy natrafić na polimorfizm mikrosatelitarny, inaczej STR, polegający na różnej ilości powtórzeń 2 - 5 nukleotydowego motywu. Oznacza się go za pomocą techniki PCR (Polymerase Chain Reaction). Omówienie tej techniki znajduje się w następnym rozdziale. Fragment polimorficzny "oflankowuje" się z obu stron starterami (primerami) i po przeprowadzeniu reakcji porównuje się długość uzyskanego produktu z wzorcem, czyli tak zwaną "drabinką alleliczną". Wynik badania z reguły podaje się w ilościach powtórzeń motywu mikrosatelitarnego, np. zapis TH01 6/6 oznacza, że w obrębie systemu mikrosatelitarnego TH01 (Tyrosine Hydroxylase intron 1) badana osoba jest homozygotą allelu 6, a zapis TH01 6/9.3 oznacza, że jest heterozygotą allelu 6 i niedoskonałego allelu 9.3, składającego się z dziewięciu powtórzeń czteronukleotydowego motywu AATG plus skrócony motyw ATG (trzy nukleotydy).
Polimorfizm typu SNP. Szacuje się, że w obrębie DNA kodującego średnio raz na 200 zasad występuje mutacyjna różnica, będąca wynikiem tranzycji (podstawienia jednej zasady przez inną), albo znacznie rzadziej insercji (wstawienia jednej lub wielu zasad), delecji (wypadnięcia jednej lub wielu zasad) albo inwersji (przestawienia kolejności nukleotydów). Tego typu różnice są wykrywane jako polimorfizm SNP. Polimorfizm ten jest o tyle ciekawy, że m. in. może objąć na poziomie genu większość polimorfizmów grup krwi, ponieważ o poszczególnych allelach nader często decydują punktowe, jednonukleotydowe mutacje (tranzycje) w obrębie genu warunkującego daną grupę krwi. Polimorfizm typu SNP najczęściej jest wykrywany za pomocą reakcji PCR lub techniki mikromatrycowej.
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Jakie znasz sądowo - lekarskie zastosowania technik biologii molekularnej?
2. Czy za pomocą tych technik można ustalać sporne ojcostwo, a jeżeli tak, to w czym te badania są lepsze od tradycyjnych oznaczeń grup krwi?
3. Jakie rodzaje badań DNA można zastosować do potrzeb medycyny sądowej?
12. Zastosowanie biologii molekularnej w seroantropologii
Seroantropologia jest działem antropologii badającym polimorfizm genetyczny człowieka w celu wyciągnięcia wniosków dotyczących pochodzenia naszego gatunku, jego pozycji systematycznej wśród hominidów, ustalenia prehistorycznych szlaków migracji, pokrewieństwa poszczególnych odmian etnicznych i narodowości oraz innych, podobnych informacji. Twórcą seroantropologii był Ludwik Hirszfeld, badający i porównujący grupy krwi u rannych żołnierzy różnych narodowości w czasie I Wojny Światowej. Z porównania częstości genów, warunkujących grupy krwi wynika, że Polacy najbliżej spokrewnieni są z, co nie zaskakuje, innymi narodami słowiańskimi, ale także, co można wytłumaczyć meandrami naszej historii, z Niemcami, Irańczykami i ludami Syberii. Rozpatrując pokrewieństwo należy oddzielnie rozpatrywać pokrewieństwo "po mieczu", wynikające z badania cech obecnych na chromosomie Y i pokrewieństwo "po kądzieli", czyli dziedziczenie DNA mitochondrialnego.
Badania seroantropologiczne w zasadzie rozstrzygnęły stary spór antropologów dotyczący pochodzenia Homo sapiens. Wywodzimy się z Afryki i jesteśmy gatunkiem stosunkowo młodym, luźno spokrewnionym z innymi gatunkami hominidów. Drugi z ogólnie znanych gatunków człowieka, Homo neandertalis nie był naszym przodkiem, lecz oddzielną, równoległą linią ewolucyjną rodzaju Homo. Naszymi najbliższymi żyjącymi krewnymi są w kolejności: bonobo (Pan paniscus), szympans (Pan troglodytes), goryl (Gorilla gorilla), orangutan (Pongo pigmaeus) i gibbon (Hylobates lar). Szokująca jest informacja, że genomy człowieka i bonobo są tożsame w prawie 99%. Inne ciekawostki seroantropologiczne to ustalenia że:
1. Współczesny Homo sapiens miał pochodzenie afrykańskie, pierwsze "wyjście z Afryki" miało miejsce ponad 200.000 lat temu, a ostatnie (w tej grupie znajdowała się słynna "Ewa mitochondrialna") 130.000 - 170.000 lat temu.
2. Najbardziej archaiczną (zbliżoną do pnia) grupą etniczną są Buszmeni i Pigmeje.
3. Najbardziej genetycznie izolowaną grupą etniczną do niedawna byli Aborygeni australijscy.
4. Ameryki zostały zasiedlone drogą lądowa od północnego krańca, a Euroazja z południowego krańca kontynentu.
Badania seroantropologiczne doprowadziły do wykrycia szeregu markerów charakteryzujących konkretną populację. Najbardziej znane przykłady to gen hemoglobiny sierpowatej HBS oraz gen kwaśnej fosfatazy ACP*R, charakterystyczne dla odmiany negroidalnej albo geny C4*A12 i HLA*Bw48 charakterystyczne dla ras orientalnych. Markery takie mają poważne znaczenie kryminalistyczne, ponieważ wykrycie takiej cechy w śladzie biologicznym z miejsca przestępstwa może ukierunkować śledztwo.
Od początku powstania seroantropologii poszukiwano biologicznego (przystosowawczego) sensu stwierdzonego zróżnicowania genetycznego. Sensu tego nie znaleziono, co sprowokowało następne pytanie, skąd się ten polimorfizm w ogóle wziął. Spośród różnych hipotez, tłumaczących przyczyny powstania obojętnego pod względem przystosowawczym polimorfizmu genetycznego człowieka najpopularniejsze są następujące:
1. Hipoteza mutacyjna. Mutacje są bezkierunkowe (ściślej wielokierunkowe) i z reguły szkodliwe, a przez to eliminowane przez dobór naturalny. Natomiast jeżeli mutacja jest neutralna pod względem przystosowawczym to nie jest eliminowana, a więc w tym samym miejscu może zachodzić wielokrotnie i powoli się akumulować.
2. Hipoteza katastrof. Jest ona uzupełnieniem hipotezy mutacyjnej. Zakłada, że po katastrofie demograficznej (zaraza, głód, migracja itp.) następuje odbudowa populacji z niewielkiej wyjściowo grupy osobników. Jeżeli wśród nich przypadkowo znajdzie się nosiciel zmutowanego genu, to w odbudowanej populacji ten gen będzie rozprzestrzeniony o wiele częściej niż w populacji pierwotnej. Zjawisko to nazywane jest czasami "dryftem genetycznym".
3. Hipoteza krzyżowania czystych linii. Jeżeli dwie linie genetyczne (różniące się w obrębie jakiegoś genu) zostaną zmieszane np. w wyniku napływu jednej na terytorium drugiej, może to doprowadzić do wytworzenia dwuallelicznego modelu dziedziczenia, a stopień polimorfizmu będzie zależał od ilościowego stosunku obu form wyjściowych. Hipoteza ta jest zgodna z głoszonym przez niektórych seroantropologów poglądem o polifiletycznym pochodzeniu rodzaju ludzkiego.
4. Hipoteza fetalizacji. Genom ssaka ma dwa komplety genów: czynnych w czasie rozwoju płodu oraz czynnych później, po zakończeniu embriogenezy. Geny pierwszego kompletu po wypełnieniu swojej funkcji powinny zostać "wyłączone", ale jeżeli wskutek błędu tak się nie stanie, to czynne geny "płodowe" zachowują się jak allele względem genów "dorosłych", co może spowodować wytworzenie się polimorfizmu.
Ze względu na łatwość oznaczania, markery w postaci genów warunkujących polimorfizm grupowy są bardzo cenne w wielu badaniach genetycznych. Poniższe zestawienie podaje przybliżoną lokalizację chromosomalną najważniejszych seroantropologicznych markerów genetycznych.
A1 - Rh, Fy, PGM1, FUC, PGD, AMY, C8, F13B
A2 - ACP, TPOX, CRY, D2S1338
A3 - Tf, D3S1358
A4 - MNSs, PGM2, PLG, Do, Gc, FGA, FABP
A5 - C6, CSF1PO, D5S818
A6 - HLA (A, B, C. DR, DQA1), Bf, PLG, GLO, PGM3, Lp(a), SE, C4, F13A, SE33
A7 - Kell, D7S820
A8 - GPT, LPL, D8S347, D8S1179
A9 - AB0, Ii, ALD, AK, ORM, GALT, D9S926
A10 - D10S608
A11 - TH01, UGB, APO
A12 - VWA, CD4, PLA
A13 - ESD, D13S317
A14 - Pi, Gm, D14S306
A15 - FES/FPS, CYP19, PENTA E
A16 - Hp, PGP, D16S539
A17 - ACE, D17S1358
A18 - Jk, MBP, D18S51
A19 - Lu, Le, Se, C3, D19S433, D19S235
A20 - ADA, D20S85
A21 - D21S11, PENTA D
A22 - P, D22S264
X - Xg, G6PDH, HPRT, AR, AMEL(X)
Y - DYS19, DYS385, DYS389(I,II), DYS390, DYS391, DYS393, AMEL(Y)
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Kto był twórcą seroantropologii?
2. Na jakim kontynencie powstał nasz gatunek?
3. Jakie gatunki zwierząt są najbliższe genetycznie człowiekowi?
4. Czy znane są ludzkie chromosomy, na których nie ma ważnych markerów seroantropologicznych?
Rozwój diagnostyki molekularnej datuje się od 1978 roku, w którym w dwu niezależnych ośrodkach wykonano oznaczenie mutacji w szóstym kodonie beta-globiny, warunkującej powstanie hemoglobiny HbS, odpowiedzialnej za anemię sierpowatą. Diagnostyka molekularna może być bezpośrednia - badanie wtedy polega na wykryciu konkretnej mutacji, określonego allelu lub materiału genetycznego patogenu mikrobiologicznego. Diagnostyka ta może też być pośrednia, polegająca na analizie sprzężeń genetycznych, im bliżej oznaczana cecha znajduje się względem genu powodującego chorobę, tym mniejsza możliwość pomyłki.
Najgłośniejsze zastosowanie medyczne metod opartych na zdobyczach biologii molekularnej to, oczywiście, próby terapii genetycznej. Próby te można podzielić na sześć głównych nurtów:
Próby wykorzystania materiału genetycznego jako szczepionki. Z techniką tą wiązano bardzo duże nadzieje, sądzono, że jest to najlepsza z możliwości zmniejszenia nadprodukcji białek powodujących chorobę lub zablokowania zmutowanego, dominującego patologicznego genu. Okazało się jednak, że w praktyce ciągle zbyt mało wiemy o strukturze DNA. Szczepionka DNA, aby była w pełni skuteczna, powinna być pozbawiona niektórych ważnych biologicznie sekwencji ( dla przykładu - elementów cis-aktywnych, tzn. obecnych na drugiej nici DNA), za to wzbogacona o sekwencje immunostymulujące (wyspy CpG). W praktyce bardzo trudno jest spełnić te wymagania.
Próby terapii genem za pomocą wektorów wirusowych. Pierwszy ujawniony przypadek tego typu terapii to podjęta w 1990 roku próba terapii SCID (wrodzonego braku odporności immunologicznej) za pomocą wprowadzenia genu dezaminazy adenozynowej do limfocytów chorego dziecka. Używane wektory wirusowe, jak do tej pory, należą do grupy retrowirusów, adenowirusów lub herpeswirusów. Terapia taka ma dwie bardzo poważne wady, pierwsza to sam pomysł terapii poprzez zakażenie (a chorzy bywają bardzo słabi i miewają obniżoną odporność), a druga to problemy związane z immunogennością białek wirusowego wektora. Największe trudności sprawia opanowanie zakaźności wirusowych wektorów, przenoszących leczący gen. Wynika to z możliwości nieoczekiwanego odbudowania sztucznie obniżonej zjadliwości dobroczynnego wirusa drogą rekombinacji z dzikimi wirusami, mało zjadliwymi lecz spokrewnionymi z naszym wektorem.
Próby terapii genem za pomocą wektorów nie będących wirusami. Polegają one na "ukrywaniu" terapeutycznego genu w kapsule wiążącej się bezpośrednio z celem - błoną jądrową. Przykładem tej techniki jest ukrycie genu w kapsule, złożonej z białka - receptora progesteronu oraz samego progesteronu w emulsji olejowej, taka kapsuła może być podana doustnie, bez trudności penetruje błony komórkowe i po dotarciu do jąder (niestety - komórek każdej tkanki, a nie tylko tej, którą obraliśmy za cel) wiąże się ze steroidowym receptorem błony jądrowej, uwalniając ukryty wewnątrz gen.
Próby terapii za pomocą sekwencji antysensownych. Stosuje się ją wtedy, gdy choroba polega na nadprodukcji jakiegoś białka. Technika polega na syntezie oligonukleotydu komplementarnego do kluczowych biologicznie sekwencji mRNA lub, jeszcze lepiej, pmRNA. Oligonukleotyd ten wiąże się z pmRNA utrudniając prawidłowy proces składania (splicing'u) lub z mRNA, wydatnie zmniejszając produkcję niepożądanego białka. Jedyna, ale największa trudność tej pomysłowej terapii polega na braku dobrej metody dostarczania antysensownego oligonukleotydu do wnętrza komórki. Ostatnio próbuje się wiązać (blokować) mRNA także przy pomocy niebiałkowych molekuł organicznych - niemniej problem ich transportu do miejsca przeznaczenia pozostaje ten sam co w przypadku terapii antysensownym polinukleotydem.
Wykorzystanie zjawiska interferencji RNA. W ostatnich kilku latach okazało się, że dwuniciowy RNA ma ciekawą właściwość - uruchamia kaskadę zdarzeń prowadzących do strawienia mRNA komplementarnego do sekwencji wspomnianego dwuniciowego RNA. Mechanizm ten pozwala na silne, wybiórcze blokowanie aktywności dowolnie wybranego genu i w chwili pisania tych słów jest juz stosowany w klinicznych próbach wyłączania genów wirusowych, kluczowych w procesie namnażania wirusów w trakcie choroby.
Próby terapii genu, tzn. naprawa uszkodzeń nieczynnego lub zmutowanego genu. Próby te, niewątpliwie przyszłościowe, obecnie ciągle jeszcze znajdują się na etapie laboratoryjnych manipulacji in vitro.
Wszelkie manipulacje na kodzie genetycznym człowieka muszą być dokonywane z wielką roztropnością, z trzech zasadniczych powodów. Po pierwsze, coraz więcej danych genomiki porównawczej świadczy o tym, że "człowieczeństwo" polega nie na posiadaniu przez nasz gatunek specyficznych "ludzkich" genów, ale na specyficznej tylko dla Homo sapiens organizacji (zestrojenia) genomu. Majstrowanie na oślep przy tym precyzyjnym mechanizmie może doprowadzić do ponurych skutków. Po drugie, ostatnio wykryto liczne "dobroczynne" skutki wielu złowrogich mutacji, a więc próby ich całkowitego wyeliminowania z puli genowej człowieka mogą przynieść więcej szkody niż pożytku. Dla przykładu - nosiciele genu anemii sierpowatej oraz osoby z nieczynnym genem glukozo 6-fosfodehydrogenazy wykazują dużą odporność na zakażenie malarią, nosiciele genu choroby Tay-Sachsa i mutanci wydzielający za dużo pepsynogenu do soku żołądkowego są odporni na zakażenie prątkami gruźlicy, a nosiciele genu powodującego mukowiscydozę są odporni na toksynę przecinkowca cholery. Takich zaskakujących korelacji wykrywa się coraz więcej. Drugi powód do zachowania ostrożności to brak należytej wiedzy jak nasze manipulacje genetyczne wpłyną na zdrowie przyszłych pokoleń. Z powyższych powodów wszelkie działania terapeutyczne na poziomie ludzkiego materiału genetycznego muszą bezwzględnie podlegać jednej żelaznej zasadzie - możemy z naszym pacjentem robić co chcemy (oczywiście po uzyskaniu jego świadomej zgody i w granicach wiedzy lekarskiej oraz zasad etyki) lecz pod warunkiem, że zmieniamy wyłącznie materiał genetyczny komórek somatycznych, a nie rozrodczych. Jeżeli zachowanie tej zasady jest z jakichkolwiek powodów niemożliwe, należy zrezygnować z próby terapii na poziomie genu lub bardzo poważnie rozważyć możliwość sterylizacji pacjenta (jego interes reprodukcyjny można przecież zabezpieczyć pobierając i zamrażając komórki rozrodcze).
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Czy można szczepić pacjenta używając do tego celu DNA?
2. Czy możliwe jest leczenie poprzez chorobę (zakażenie wirusowe)?
3. Jak można wprowadzić do wnętrza jądra komórkowego gen bez użycia wektora wirusowego?
4. Co to jest terapia genu i czym się różni od terapii genem?
5. Jaka jest główna, naczelna zasada terapii genowej u człowieka i dlaczego należy ją stosować?
14. Klonowanie DNA
Klonowanie DNA w zasadzie nie jest ani metodą badawczą, ani analityczną. Jest to po prostu przemysłowy sposób na amplifikację in vivo wybranego fragmentu DNA. Sposób ten jest technicznie prosty: plazmid zapewniający odporność na antybiotyk rozcina się enzymem restrykcyjnym dającym lepkie końce cięcia, i tym samym enzymem wycina się fragment DNA który ma ulec powieleniu. Po zmieszaniu produktów cięcia i połączeniu ich enzymem ligującym uzyskuje się między innymi plazmid z wklonowanym obcym fragmentem DNA. Następnie dodaje się ten plazmid do hodowli drobnoustrojów w warunkach, w których mogą przeżyć tylko te komórki, które pobiorą plazmid. Po wyhodowaniu ogromnej biomasy drobnoustrojów izoluje się z nich plazmidy używane do terapii lub odzyskuje się z nich DNA plazmidowe, z którego wycina się enzymami restrykcyjnymi interesujący nas, sklonowany fragment DNA. Klonowanie DNA opisaną metodą najłatwiej przeprowadzić korzystając z usług wyspecjalizowanej firmy biotechnologicznej lub we własnym zakresie, przy użyciu gotowych zestawów do klonowania. Od czasu opracowania technik amplifikacji dłuższych niż 10.000 bp odcinków DNA za pomocą techniki PCR, popularność klonowania DNA w plazmidach znacznie zmalała i, pominąwszy zastosowania przemysłowe, klonowanie jest techniką coraz rzadziej stosowaną.
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Na czym polega klonowanie DNA?
2. Do czego jest stosowana ta technika?
15. Przewidywane kierunki rozwoju biologii molekularnej
Trudno przewidzieć przyszłość, zwłaszcza odleglejszą. Dlatego w tym rozdziale zostaną omówione tylko takie nowe techniki badawcze, które już istnieją, ale są stosunkowo mało znane i ciągle bardzo mało rozpowszechnione.
Wiele przesłanek wskazuje na to, że stoimy w przededniu wynalezienia nowej, trzeciej po klonowaniu i reakcji PCR techniki amplifikacji DNA, polegającej na wykorzystaniu znanych enzymów do namnażania DNA w stałej temperaturze, bez użycia termocyclerów.
W zakresie hybrydyzacji szerokim frontem wchodzą różne techniki mikromatrycowe („mikroczipowe", „mikromacierzowe” wzglednie „mikroczujnikowe”). Obserwuje się walkę dwu wariantów metodycznych: kwas nukleinowy może być syntetyzowany albo na specjalnej płytce krzemowej, albo nakrapiany na odpowiednio przygotowanym szkiełku mikroskopowym. Na mikromatrycę można nakrapiać DNA wielu pacjentów (i hybrydyzować z próbą molekularną) lub nakrapiać cDNA (nawet kompletu genów danego organizmu, bo na niektórych mikromatrycach mieści się kilkadziesiąt tysięcy „kropek”), w tym drugim przypadku hybrydyzuje się do związanych z podłożem "kropek" DNA lub cDNA badanego pacjenta. Pojawiają się także pierwsze prace z wykorzystaniem reakcji polimerazy, która na mikromatrycy dobudowuje znakowany fluorochromem nukleotyd. Techniki mikroczipowe są bardzo tanie w wykonaniu, ale wymagają niesłychanie drogiego oprzyrządowania (głównie niesłychanie precyzyjnego skanera laserowego).
W dziedzinie sekwencjonowania może niedługo nastąpić rozwój technik sekwencjonowania bezpośredniego, poprzez fizykochemiczną analizę DNA, bez użycia reakcji PCR.
W technice PCR coraz powszechniej stosuje się odmianę reakcji zwaną potocznie "real time", charakteryzującą się trzema cechami: miniaturyzacją testu, bardzo wydatnym skróceniem czasu jej przebiegu oraz analizą produktów przebiegającą w czasie trwania reakcji a nie, jak do tej pory, dopiero po jej zakończeniu. Inną nowością są bloki termocyclerów przeznaczone już nie na mikropłytki 96 miejscowe, ale 384 miejscowe ( w przyszłości zapewne będą także i na 1536 miejscowe). Do ładowania takich mikropłytek stosowane będą roboty nakrapiające, ponieważ jest to praca przekraczająca możliwości nawet najstaranniejszego i najsprawniejszego manualnie człowieka.
REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Czy obecnie możliwy jest także inny, trzeci (obok klonowania molekularnego i reakcji PCR) sposób amplifikacji czyli namnażania DNA?
2. Co to jest "technika mikromatrycowa"?
3. Co to jest "real time PCR"?
Wyszukiwarka