LABORATORIUM

TECHNOLOGIA BIOKONWERSJI

Temat ćwiczenia:

Oznaczanie witaminy C w produktach naturalnych

Pietrasiak Maciej Rembisz Daria Zając Karolina

II grupa dziekańska Piątek 12:15- 16:00

CZĘŚĆ TEORETYCZNA

Kwas askorbinowy

Witamina C jest jednym z najbardziej niezbędnych związków, jakie powinniśmy dostarczyć do naszego organizmu - należy do grupy związków egzogennych. Za witaminę C uważa się kwas L-askorbinowy i kwas L-dehydroaskorbinowy. Funkcja biologiczna kwasu askorbinowego polega głównie na tworzeniu odwracalnego układu oksydoredukcyjnego KA <-> KDA. Układ taki chroni różne substancje przed utlenieniem.

Kwas L-askorbinowy jest związkiem krystalicznym, dobrze rozpuszczalnym w wodzie

a jego roztwory mają smak kwaśny. Wykazuje właściwości redukujące. W warunkach

beztlenowych jest odporny na wysoką temperaturę. Kwas dehydroaskorbinowy jest mniej

trwały w tych warunkach i tym tłumaczy się straty witaminy C podczas ogrzewania. W

obecności tlenu obie formy ulegają nieodwracalnemu utlenianiu do produktów nieaktywnych

biologicznie, zwłaszcza w obecności jonów niektórych metali, szczególnie Cu2+ i Fe3+. Witamina C należy do jednych z najmniej stabilnych witamin. Łatwo ulega utlenianiu, jest bardzo wrażliwa na obróbkę termiczną. Wystąpienie czynników cofających dysocjację stabilizują ten związek. Te czynniki to m.in. mocne kwasy. Podczas wykonywania oznaczenia witaminy C w różnych produktach należy wydobywać ją delikatnie. Czynnikami przyspieszającymi proces utleniania są: pH słabo kwaśne i alkaliczne, wysoka temperatura, enzymy.

Funkcje witaminy C w naszym organizmie:

• podnosi odporność organizmu

• pełni funkcję ochronną w przypadku przeziębienia - dzięki swojemu udziałowi w biosyntezie kolagenu (podskórna warstwa ochronna, zabezpieczająca przed przenikaniem wirusów) oraz roli w produkcji limfocytów (niszczących zainfekowane komórki)

• uczestniczy w procesach metabolicznych jako substancja przenosząca elektrony

• dzięki współdziałaniu w biosyntezie kolagenu przyspiesza proces gojenia się ran i zrastania kości

• uczestniczy w metabolizmie tłuszczów, cholesterolu i kwasów żółciowych

• uczestniczy w regeneracji witaminy E

• ułatwia przyswajanie niehemowego żelaza i uczestniczy w wytwarzaniu krwinek czerwonych

• jako silny reduktor przeciwdziała procesowi utleniania wywołanemu przez wolne rodniki

• hamuje powstawanie w żołądku rakotwórczych nitrozoamin

• ma właściwości bakteriostatyczne, a nawet bakteriobójcze w stosunku do niektórych drobnoustrojów chorobotwórczych

Niedobór kwasu askorbinowego, objawiający się: wolniejszym gojeniem się ran,

bladością skóry i błon śluzowych, zaburzeniami w przemianie kwasów tłuszczowych,

osłabieniem naczyń włosowatych i możliwością powstawania mikrowylewów w różnych

narządach, zmniejszeniem odporności na infekcje oraz występowaniem szkorbutu (obrzęki i

krwawienie z dziąseł oraz wypadanie zębów), występuje dziś niezwykle rzadko. Nadmiar

witaminy C jest usuwany z moczem, jednakże stosowanie wysokich dawek powoduje

zakwaszenie moczu, upośledzając w ten sposób wydalanie stałych kwasów i zasad. Kwaśny

odczyn moczu może powodować wytrącanie się moczanów i cystynianów oraz tworzenie się

kamieni w drogach moczowych.

Dzienna dawka pokrywająca zapotrzebowanie organizmu na kwas askorbinowy u dorosłych osób wynosi : 90mg dla mężczyzn i 75mg dla kobiet.

Najbogatszymi źródłami tej witaminy są owoce i warzywa, takie jak: czarna porzeczka, głóg, cytryny, pomarańcze, papryka, nać pietruszki, chrzan, kapusta, bujawa.

Metody chemiczne - metoda Tillmansa i jej modyfikacje

Metoda Tillmansa oparta jest na redukcji 2,6-dichlorofenoloindofenolu przez kwas L-askorbinowy. Metoda ta sprowadza się do miareczkowania roztworu kwasu L-askorbinowego barwnikiem Tillmansa do momentu pojawienia się jasno różowego zabarwienia. Jest to metoda prosta, ale tylko w przypadku roztworów bezbarwnych i nie zawierających innych związków powodujących redukcję odczynnika Tillmansa. W praktyce wiadomo, że większość surowców roślinnych zawiera barwniki antocyjanowe, które nadają ekstraktom witaminy C różowe zabarwienie, a także mają właściwości redukujące. Ponadto w produktach, w których oznaczamy witaminę C, występują inne związki ulegające utlenieniu podczas miareczkowania odczynnikiem Tillmansa. Należą do nich reduktony - związki obdarzone silnymi właściwościami redukującymi, które należy przypisywać obecności ugrupowania endiolowego. W przypadku oznaczania witaminy C w owocach i warzywach oraz ich przetworach mamy do czynienia z reduktonami białkowymi (aminokwasy lub białka zawierające grupy sulfhydrylowe, które są utleniane przez odczynnik Tillmansa do wiązań disulfidowych) oraz cukrowymi (pochodne cukrów, które powstają podczas obróbki termicznej).

W przypadku roztworów silnie zabarwionych stosuje się modyfikację metody Tillmansa, tzn. miareczkowanie 2,6-dichlorofenoloindofenolem w obecności rozpuszczalnika organicznego (chloroform, ksylen). Wykorzystuje się tu fakt zróżnicowanej rozpuszczalności. Barwniki antocyjanowe, w odróżnieniu od barwnika Tillmansa, nie rozpuszczają się w rozpuszczalniku organicznym, natomiast barwnik Tillmansa rozpuszcza się. Nadmiarowa kropla 2,6-dichlorofenoloindofenolu przechodzi do warstwy rozpuszczalnika barwiąc go na różowo.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Oznaczenie miana odczynnika Tillmansa (OT)

Pobraliśmy 5cm³ roztworu roboczego KA o stężeniu 0,02mg/cm³ i miareczkowaliśmy odczynnikiem Tillmansa do uzyskania różowego zabarwienia trwałego przez 15 sekund. Oznaczenie wykonaliśmy w 3 powtórzeniach.

• Ilość OT zużyta do zmiareczkowania 5 cm³ kwasu askorbinowego (KA) wynosiła:

- 2,4 cm

- 2,5 cm

- 2,6 cm

Po uśrednieniu uzyskaliśmy wynik 2,4 cm
odczynnika Tillmansa.

Miano OT wyliczamy zgodnie ze wzorem:

miano OT = 0,1 mg KA / V_OT [mg KA/ cm³ OT]

miano OT = 0,1 mg KA / 2,4 cm
OT= 0,045 [mg KA / cm
OT ]

2. Oznaczanie kwasu askorbinowego w ekstraktach bezbarwnych

Badanym przez naszą grupę surowcem był banan.

Do wykonania oznaczenia pobraliśmy 20g surowca, rozcieraliśmy w moździerzu z piaskiem i dodatkiem 2% roztworu kwasu szczawiowego. Otrzymaną papkę przenieśliśmy ilościowo do kolby miarowej na 200cm³ i uzupełniliśmy kwasem szczawiowym do kreski. Następnie całość wymieszaliśmy, odstawiliśmy na 30 minut i przesączyliśmy przez sączek bibułowy. Po rozcieńczeniu w otrzymanym ekstrakcie oznaczyliśmy zawartość KA metodą tillmansometryczą.

• Ilość OT zużyta do zmiareczkowania 5 cm³ kwasu askorbinowego (KA) zawartego w ekstrakcie z banana wynosiła:

	Ilość OT zużyta do zmiareczkowania 5 cm^3 kwasu askorbinowego [cm ]
Pietrasiak Maciej	0,85
Rembisz Daria	0,85
Zając Karolina	0,825

Obliczenie ilości KA [mg] w 5 cm
ekstraktu z banana:

Przykładowe obliczenie dla 0,85cm
:

KA = 0,85 cm
* 0,045 mg KA/ cm
= 0,038 mg KA

Otrzymana ilość kwasu askorbinowego znajdowała się w 5 cm
ekstraktu, a nasza wyjściowa objętość ekstraktu z banana wynosiła 200 cm
. Zatem dokonujemy odpowiedniego przeliczenia:

0,038 mg KA - 5 cm


x KA - 200 cm


x KA
x KA = 1,52mg KA/ 20 g surowca

Do naszego doświadczenia odważaliśmy 20 g produktu, a zatem otrzymaną powyżej wartość musimy przeliczyć na 100g produktu:

C
KA = 1,52 mg KA* 5 = 7,6 mg KA/ 100g produktu

3. Wpływ oksydazy askorbinianowej na trwałość witaminy C w badanym surowcu

10g produktu rozcieraliśmy w moździerzu z piaskiem i wodą. Przenieśliśmy do kolby o pojemności 250 cm³ .Dodaliśmy zróżnicowaną ilość soku z ogórka (np. w przypadku banana było to 0,5 cm³), będącego źródłem enzymu, dopełniliśmy wodą do kreski i przesączyliśmy. Do 2 cm³ przesączu dodaliśmy 2cm³ 2% roztworu kwasu szczawiowego. Zawartość KA w próbie oznaczaliśmy metodą Tillmansa (j.w.)

• Obliczenie stężenia witaminy C (
  KA) w badanym surowcu po poddaniu go działaniu oksydazy askorbinianowej.

Ilość odczynnika Tillmansa zuzyta do miareczkowania próby:

	Ilość OT zużyta do zmiareczkowania 5 cm^3 kwasu askorbinowego [cm ]
Pietrasiak Maciej	0,05
Rembisz Daria	0,045
Zając Karolina	0,04

Przykładowe obliczenie stężenia KA [mg] w 2 cm
ekstraktu z banana:


KA = 0,05 cm
* 0,045 mg KA/ cm



KA = 2,25*10
mg KA

Następnie wykonujemy przeliczenie na wyjściową objętość ekstraktu surowca- 250 cm
:

2,25*10
mg KA - 2 cm



KA - 250 cm



KA



KA =0,28 mg KA/10g surowca

Przeliczenie na 100 g produktu:


KA = 0,28 mg KA* 10 = 2,8 mg KA/ 100g produktu

4. Wyliczenie strat kwasu askorbinowego jakie nastąpiły pod wpływem działania oksydazy askorbinianowej

S =


gdzie:

S - straty kwasu askorbinowego jakie nastąpiły pod wpływem działania oksydazy askorbinianowej [%]


- wyjściowe stężenie kwasu askorbinowego w badanym surowcu [mg KA/100g]


- stężenie kwasu askorbinowego w badanym surowcu po zastosowaniu oksydazy askorbinianowej [mg KA/100g]

Przykładowe obliczenie strat kwasu askorbinowego dla:


= 7,6 mg KA/100g


= 2,8 mg KA/100g:

S =


Tabela z wynikami wszystkich osób z grupy:

	wyjściowe stężenie kwasu askorbinowego w badanym surowcu [mg KA/100g]	stężenie kwasu askorbinowego w badanym surowcu po zastosowaniu oksydazy askorbinianowej [mg KA/100g]	S straty kwasu askorbinowego [%]
Pietrasiak Maciej	7,6	2,8	63,16
Rembisz Daria	7,6	2,53	66,71
Zając Karolina	7,43	2,25	69,72

5. Wnioski:

• Badane przez nas ekstrakty z banana wykazały niewielką zawartość witaminy C, która wynosiła od 7,43 do 7,6 mg KA/ 100g produktu.

• Według danych literaturowych wartość ta wynosi 10 mg/100g produktu, a zatem otrzymany przez nas wynik nieznacznie różni się od prawidłowego.

• Podczas badania wpływu oksydazy askorbinianowej zawartej w soku z ogórka stwierdziliśmy, że enzym ten znacznie przyspiesza proces utleniania kwasu askorbinowego.

• W przypadku naszego surowca ubytek witaminy C z wykorzystaniem 0,5 cm
  soku z ogórka wynosił od 63,16% do 69,72%.

---