NAPRAWA DNA
Polimeraza DNA
Polimeraza DNA - enzym uczestniczący w procesie syntezy DNA(zwanym też replikacją). Działanie tego enzymu polega na katalizowaniu polimeryzacji deoksyrybonukleotydów przez wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych między nimi. Substratami do tej reakcji są nukleotydy trójfosforanowe, a jej produktem ubocznym jest pirofosforan, złożony z dwóch reszt fosforanowych. Dlatego składnikami DNA są nukleotydy jednofosforanowe (monofosforanowe). Większość polimeraz DNA wymaga matrycy, w formie jednoniciowego DNA lub RNA, z krótkim obszarem dwuniciowym. Odcinek dwuniciowy powstaje przez przyłączenie się do jednoniciowej matrycy krótkiego komplementarnego do matrycy odcinka DNA lub RNA, zwanego primerem (prajmerem) lub starterem (zwykle ma długość od kilku do ok. 20 nukleotydów).
Działanie typowej polimerazy DNA polega właściwe na wydłużaniu prajmera przez dobudowywanie nukleotydów komplementarnych do matrycy na końcu 3' prajmera, a później na końcu 3' wydłużonego prajmera. Wszystkie polimerazy DNA zgodnie z nazwą jako produktu dostarczają DNA, natomiast jako matrycę mogą wykorzystywać DNA lub (na ogół z dużo mniejszą wydajnością) RNA. Wyjątkowo, odwrotne transkryptazy są przedstawicielami polimeraz DNA, które bardzo wydajnie "przepisują" RNA na DNA (ten proces nazywamy odwrotną transkrypcją, a jego wynik nazywamy cDNA). Wyjątkowo też, terminalna deoksyrybonukleotydylotransferaza nie wymaga żadnej matrycy, bo dobudowuje dowolne dostępne nukleotydy na końcu łańcucha DNA (p. niżej). Reakcja dobudowywania nukleotydów przez polimerazy DNA jest odwracalna i przy dużym nadmiarze pirofosforanu enzymy te mogłyby odrywać zamiast przyłączać deoksyrybonukleotydy. Wiele polimeraz potrafi nawet przy fizjologicznych stężeniach pirofosforanu usunąć nowo przyłączony nukleotyd, jeśli nie w pełni pasuje on do matrycy. Jest to tzw. aktywność egzonukleazy 3'->5', czyli aktywność korekcyjna. Znacznie rzadziej polimerazy DNA mają też zdolność systematycznego odrywania pojedynczych nukleotydów na końcu 5' łańcucha DNA (aktywność egzonukleazy 5'->3'; dzięki tej zdolności, bakteryjna polimeraza I usuwa prajmery i wypełnia pozostałe po nich luki w końcowej fazie replikacji). Jeśli polimeraza DNA nie wykazuje aktywności korekcyjnej, to może do pewnego stopnia zadziałać jak terminalna deoksyrybonukleotydylotransferaza (TDTaza), wbudowując do nowo tworzonej nici, na jej końcu 3', jeden dodatkowy nukleotyd, nie zakodowany w nici matrycowej. Najczęściej tym dodatkowym nukleotydem jest deoksyadenozynomonofosforan. TDTaza różni się jednak od typowych polimeraz DNA tym, że potrafi wydłużyć nić DNA nie o jeden, lecz choćby kilkaset nukleotydów nie zakodowanych w żadnej cząsteczce matrycowej.
Polimerazy DNA bakteryjne
Polimeraza DNA I
Enzym monomeryczny (zbudowany z pojedynczego łańcucha polipeptydowego), masa ok. 109 kDa, odkryty przez Artura Kornberga (czasami nazywany więc enzymem Kornberga). Posiada trzy aktywności enzymatyczne, co jest nietypowe dla monomeru:
polimerazowa
Jednorazowo polimeraza DNA I sytetyzuje do 20 wiązań fosfodiestrowych. Syntezuje ok. 10 wiązań na sekundę tj. ok 100 razy wolniej od polimerazy DNA III. Występuje w liczbie ok. 400 cząsteczek na jedną komórkę.
Aktywność egzonukleazy 5'->3' daje się stosunkowo łatwo oddzielić od pozostałych funkcji enzymu (każdą z nich katalizuje inny odcinek polipeptydowego łańcucha). Białko pozbawione aktywności 5'->3' egzonukleazy nazywamy fragmentem Klenowa.
Polimeraza DNA II
Enzym monomeryczny, masa ok. 90 kDa, posiadający dwie aktywności:
polimerazowa
egzonukleazowa 3'—>5'
Polimeraza ta nie uczestniczy w procesie replikacji DNA, jej funkcja polega na naprawianiu uszkodzeń DNA.
Polimeraza DNA III
Enzym heteromultimeryczny (złożony z kilku niejednakowych łańcuchów polipeptydowych), masa ok. 900 kDa, będący głównym inicjatorem replikacji DNA. Syntetyzuje z prędkością ok. 1000 wiązań na sekundę główną masę nowopowstałej, komplementarnej do matrycowej nici DNA.
W odróżnieniu od polimerazy DNA I działa w sposób ciągły, to znaczy oddysocjowuje od matrycy dopiero po zakończeniu replikacji. Łączy się tylko z jednoniciowym DNA, do którego przyłączony jest starter, wytwarzany przez enzym prymazę, wchodzący w składk prymosomu. Przyłączając się do prymosomu polimeraza III przekształca go w replisom. Aktywności enzymatyczne:
polimerazowa
egonukleazowa 3'->5'
Występuje w liczbie 10-20 cząsteczek na jedną komórkę.
Wycinanie - jeden z
Fotoreaktywacja
Fotoreaktywacja - jeden z machanizmów naprawy DNA, w którym enzym fotoliaza specyficznie reaguje z jedno- lub dwuniciowym fragmentem DNA, zawierającym fotodimery pirymidyn. Pod wpływem światła o długości fali 310-480 nm, następuje enzymatyczne rozszczepienie fotodimerów do monomerów i przywrócenie DNA do stanu pierwotnego. Zachodzi bezustannie w organizmie, w komórkach narażonych na działanie promieni UV.
Rekombinacja
Rekombinacja - proces wymiany materiału genetycznego, w wyniku którego powstają nowe genotypy. U organizmów wyższych rekombinacja zachodzi w wyniku niezależnej segregacji genów i crossing-over zachodzącego podczas mejozy, a także losowego łączenia się gamet. U bakterii rekombinacja towarzyszy procesom transdukcji i transformacji. Rekombinacja jest też ostateczną metodą usuwania uszkodzeń nici DNA.
Podczas usuwania uszkodzenia jednoniciowe DNA łączy się z białkiem RecA. Białko RecA atakuje homologiczną cząsteczkę powodując lokalne rozplecenie heliksu i wytworzenie heterodupleksu. Nukleazy nacinają nić docelową, powstają wolne końce i następuje rekombinacja typu crossing-over. Powstaje figura krzyżowa Hollydaya, w której naprzeciw uszkodzenia jest nieuszkodzony odcinek, a luka w drugiej nici będzie połączona z nicią nieuszkodzoną.
