Państwowa Wyższa Szkoła

Informatyki i Przedsiębiorczości w Łomży

Instytut Wychowania Fizycznego

Instrukcja do zajęć laboratoryjnych

Temat ćwiczenia:

Izolacja i charakterystyka tłuszczowców

Otrzymywanie lecytyn z żółtka jaja.

Reakcje charakterystyce lipidów.

Cukry

Budowa i właściwości.

Reakcje charakterystyczne cukrów.

Numer ćwiczenia: 3, 4

Laboratorium z przedmiotu:

BIOCHEMIA

1. Cel i zakres ćwiczenia laboratoryjnego

Przedmiotem ćwiczenia jest badanie właściwości lipidów i cukrów na podstawie ich charakterystycznych reakcji.

2. Przebieg realizacji eksperymentu

Doświadczenie 1. Otrzymywanie lecytyn z żółtka jaja

Wprowadzenie:

Lipidy nie rozpuszczają się w wodzie, lecz w rozpuszczalnikach organicznych, np. benzynie, chloroformie, eterze, alkoholu, acetonie i innych, choć w różnym stopniu, zależnie od warunków. Właściwości te stanowią podstawę metod ekstrakcji i frakcjonowania lipidów z każdego materiału biologicznego, zarówno o strukturze komórkowej, tkankowej, jak i z macierzy pozakomórkowej, w tym z surowicy krwi. Rozdzielanie tłuszczów prostych od tłuszczów złożonych opiera się na ich odmiennej rozpuszczalności w zimnym acetonie. Tłuszcze proste oraz pochodne lipidowe (estry steroli i kwasów tłuszczowych) rozpuszczają się w zimnym acetonie, natomiast tłuszcze złożone (lecytyny, kefaliny, sfingomieliny i glikolipidy) są nierozpuszczalne. Lipidy obecne w surowicy krwi są składnikami lipoprotein, które są rozpuszczalnymi w wodzie kompleksami białkowo-lipidowymi. W ekstrakcie lipidowym surowicy stwierdza się obecność triacylogliceroli, fosfolipidów, cholesterolu wolnego i zestryfikowanego oraz wolnych kwasów tłuszczowych. Dogodnym źródłem otrzymywania lecytyny są komórki jajowe bogatożółtkowe, ponieważ obecne w nich złogi deutoplazmatyczne zawierają wiele tłuszczowców, wśród których lecytyna stanowi znaczącą część. Ekstrakcję lecytyny przeprowadza się przy użyciu rozpuszczalników organicznych.

Wykonanie doświadczenia:

W moździerzu porcelanowym umieścić 3 g suchego, sproszkowanego żółtka (lub świeżego), zalać 10 ml mieszaniny chloroform - metanol (w stosunku 2:1) i rozcierać przez 5 minut. Następnie ekstrakt przesączyć przez sączek zwilżony mieszaniną ekstrakcyjną. Przesącz odparować do sucha we wrzącej łaźni wodnej, pod dygestorium. Pozostała oleista, pomarańczowobrunatna masa po ostudzeniu przyjmuje konsystencję wazeliny i stanowi surowy ekstrakt lecytyny. Otrzymany surowy ekstrakt lecytyny jest zanieczyszczony różnymi związkami, w tym barwnikami należącymi do karotenów. Ekstrakt przeznaczyć do dalszych analiz jakościowych.

Podać wzór strukturalny i sumaryczny lecytyny.

Doświadczenie 2. Badanie rozpuszczalności tłuszczów

Wykonanie doświadczenia:

Przygotować cztery probówki szklane. Do każdej z nich dodać 3 - 4 krople oleju roślinnego. Następnie do pierwszej wlać 1 ml wody destylowanej, do drugiej - 1 ml detergentu rozcieńczonego 4-krotnie woda destylowana, do trzeciej - 1 ml etanolu a do czwartej - 1 ml chloroformu. Zawartość probówek dokładnie wymieszać. Obserwować rozpuszczalność tłuszczu. Podobne doświadczenie przeprowadzić dla tłuszczów prostych (smalec lub margaryna) oraz dla lecytyny.

Zapisać obserwacje w tabeli. Sformułować wnioski.

Doświadczenie 3. Badanie składu chemicznego lecytyny

Wykrywanie glicerolu

Glicerol, główny składnik glicerolipidów, ogrzewany w obecności czynników wiążących wodę (np. KHSO₄), ulega odwodnieniu, przekształcając się w nienasycony aldehyd, zwany akroleiną. Akroleina jako aldehyd wykazuje własności redukujące, dlatego można ją wykryć reakcją „lustra srebrnego”. Po dodaniu odczynnika Tollensa (amoniakalny roztwór azotanu srebra) wytrąca się srebro metaliczne, które tworzy lustrzaną warstwę na ścianach probówki. Pary akroleiny również redukują jony Ag⁺ → Ag⁰, obecne w bibule nasączonej odczynnikiem Tollensa, dlatego bibuła przybiera kolor brunatny, aż do czarnego, zależnie od stężenia akroleiny.

Wykonanie doświadczenia:

Przygotować trzy suche probówki, zawierające po około 0,2 g krystalicznego KHSO₄, następnie dodać:

- 5 kropli glicerolu do pierwszej probówki,

- 5 kropli 10% etanolowego roztworu lecytyny, do drugiej,

- 5 kropli etanolu (próba ślepa) do trzeciej probówki.

U wylotu każdej probówki zawiesić pasek bibuły, uprzednio zwilżony w amoniakalnym roztworze AgNO₃. Probówki ogrzewać powoli w gorącej łaźni wodnej. Zaobserwować zmianę barwy bibuły w poszczególnych probówkach, zinterpretować uzyskane wyniki. Wydzielanie się akroleiny poznajemy po zapachu i po powstaniu lustra srebrowego na skrawku bibuły nasączonej amoniakalnym roztworem AgNO₃. Bibułę trzymamy u wylotu probówki podczas ogrzewania.

Doświadczenie 4. Badanie właściwości mydeł

a) Obniżanie napięcia powierzchniowego

Do 2 probówek zawierających po 4 cm³ wody destylowanej dodać kilka kropli oleju. Do jednej z nich wprowadzić 1 cm³ roztworu mydła. Zawartość probówek silnie wstrząsnąć. Zanotować spostrzeżenia. Sporządzić wnioski.

b) Wysalanie mydła

Do probówki z 5 cm³ roztworu mydła wprowadzić porcjami stały NaCl (szczypta) aż do wytrącenia mydła (kłaczkowaty osad) z roztworu. Zbadać rozpuszczalność otrzymanego osadu w nadmiarze wody. Zanotować spostrzeżenia. Sporządzić wnioski.

c) Otrzymywanie mydła nierozpuszczalnego w wodzie

Do trzech probówek zawierających po 2 cm³ roztworu mydła wprowadzić roztwory CaCl₂, MgCl₂ i (CH₃COO)₂Pb. Wytracają się osady odpowiednich mydeł nierozpuszczalnych w nadmiarze wody. Zanotować spostrzeżenia. Sporządzić wnioski. Zapisać zachodzące reakcje.

Doświadczenie 5. Wykrywanie nienasyconych kwasów tłuszczowych

Reakcja addycji chlorowców do atomów węgla wiązania podwójnego stosowana jest jako próba chemiczna na obecność wiązań nienasyconych w związkach organicznych. Nienasycone kwasy tłuszczowe reagują z chlorowcami (J₂, Br₂, Cl₂), które przyłączają się do wiązań podwójnych. Reakcje te są podstawą ilościowego oznaczania nienasyconych wiązań (oznaczanie liczby jodowej) oraz podstawą metod rozróżniania między nasyconymi i nienasyconymi kwasami tłuszczowymi. Wykrywanie wiązań podwójnych metodą Hübla opiera się na tym, że roztwór jodu ma brunatne zabarwienie, natomiast po addycji jodu do wiązań podwójnych (w obecności katalizatora reakcji HgCl₂) następuje odbarwienie roztworu, gdyż jod cząsteczkowy przechodzi w bezbarwny jon jodkowy, związany organicznie. W reakcji Hübla dochodzi do przyłączenia dwóch atomów jodu do każdego podwójnego wiązania w łańcuchu kwasu tłuszczowego.

Podobna sytuacja zachodzi, gdy zamiast jodu wykorzystuje się wodę bromową o żółtej barwie. Po addycji bromu pierwiastkowego do wiązań podwójnych następuje odbarwienie roztworu. Addycja tlenu do wiązań podwójnych nienasyconych kwasów tłuszczowych sprawia, że fioletowo zabarwiony roztwór manganianu(VII) potasu odbarwia się, przechodząc w roztwór brązowy z powodu pojawienia się jonów Mn⁺⁴. Utleniane wiązanie podwójne kwasu tłuszczowego nadmanganianem (KMnO₄) ulega rozbiciu tylko w podwyższonej temperaturze i produktami są dwie cząsteczki niższych aldehydów, a Mn⁺⁷ w środowisku zasadowym redukuje się do Mn⁺⁴ (brunatny osad MnO₂). Natomiast ta sama reakcja przeprowadzona na zimno dostarcza diolu, np. kwasu 9,10-dihydroksystearynowego.

Wykrywanie wiązań podwójnych metodą Hübla

Do trzech probówek zawierających po 3 krople roztworu Hübla I (2,6% roztwór jodu w alkoholu) dodać: do pierwszej probówki - 1 ml 10% roztworu oleju w etanolu, do drugiej - 1 ml 10% roztworu masła (lub smalcu) w etanolu, do trzeciej probówki - 1 ml etanolu (próba ślepa). Wszystkie próby dokładnie wymieszać. Do wszystkich probówek dodawać kroplami, jednocześnie mieszając, roztwór Hübla II (3% roztwór HgCl₂ w etanolu), aż do odbarwienia prób badanych. Do próby ślepej dodać tę samą liczbę kropel roztworu Hübla II, którą dodano do próby pierwszej. Porównać barwy próby ślepej z próbami zawierającymi różne rodzaje tłuszczów, zinterpretować uzyskane wyniki.

Doświadczenie 6. Reakcje charakterystyczne cukrów.

Redukcja błękitu metylenowego

Odczynniki:

1. 1% roztwór błękitu metylenowego

2. 5% roztwór NaOH

3. 1% roztwór glukozy

Wykonanie:

Do 2 probówek odmierzyć po 2 cm³ wody destylowanej i dodać po kropli 1% roztworu błękitu metylenowego. Następnie do jednej z nich dodać 4 krople 5% NaOH. Probówki ogrzać - barwa nie znika. Dodać kilka kropli 1% roztworu glukozy i zagotować. W odczynie zasadowym barwa znika z powodu redukcji błękitu do leukozwiązku. Napisać reakcję.

Po ostudzeniu probówkę z odbarwionym związkiem wstrząsać przez kilka minut. Kosztem tlenu z powietrza leukozwiązek utlenia się do błękitu metylenowego i roztwór zabarwia się ponownie. W ten sposób można tlenem z powietrza utlenić całą glukozę znajdującą się w roztworze. Błękit metylenowy pełni rolę nośnika wodoru- przyjmuje go od glukozy i przekazuje na tlen atmosferyczny, z utworzeniem H₂O.

Działanie kwasów na cukry (próba z tymolem)

Odczynniki:

1. 1% roztwory: glukozy, fruktozy, sacharozy i skrobi rozpuszczalnej

2. 3% etanolowy roztwór tymolu

3. stęż. kwas solny

Wykonanie:

Do 1 cm³ roztworu cukru dodać 4 krople 3% etanolowego roztworu tymolu i ok. 2 cm³ stężonego HCl. Wstawić na 5 min do wrzącej łaźni wodnej. Roztwór barwi się na czerwono. Próby wykonać dla 1% roztworów glukozy, fruktozy, sacharozy i skrobi. Zanotować obserwacje i wyciągnąć wnioski.

Odróżnianie pentoz od innych monosacharydów (próba Tollensa z floroglucyną na pentozy)

Odczynniki:

1. 1% roztwór floroglucyny w 12% kwasie solnym

2. 1% roztwór rybozy

3. 1% roztwór glukozy

Wykonanie:

Do 2 probówek odmierzyć po 12 cm³ roztworu floroglucyny. Do jednej z nich dodać kroplę 1% roztworu pentozy, a do drugiej - heksozy. Ogrzać we wrzącej łaźni wodnej. Zanotować obserwacje, napisać reakcje.

Doświadczenie 7. Właściwości redukcyjne cukrów (próba Trommera).

Odczynniki:

1. woda destylowana,

2. 10% roztwór glicerolu,

3. 10% roztwór winianu sodowo-potasowego,

4. 1 % roztwór amoniaku,

5. 1 % roztwór glukozy,

6. 5 probówek.

Wykonanie:

Do 5 czystych probówek odmierzono jednakową objętość (po 0,1 cm³) 1% roztworu CuSO4, a następnie kolejno czterokrotnie większą objętość (po 0,4 cm³) badanych roztworów:

1) wody,

2) 10% roztworu glicerolu,

3) 10% roztworu winianu sodowo-potasowego,

4) 1 % roztworu amoniaku,

5) 1% roztworu glukozy.

Następnie do każdej probówki wprowadź:

1. jednakową objętość (po 0,1 cm³) 10% roztworu NaOH i obserwuj zachowanie się poszczególnych roztworów bez ogrzania i po umieszczeniu ich we wrzącej łaźni wodnej na okres 5 minut.

2. jednakową objętość (po 0,05 cm³) 1% roztworu glukozy i ponownie ogrzej.

Zanotować obserwacje, napisać reakcje

Wyjaśnienie:

Dla odczynów redukcyjnych konieczna jest wolna grupa aldehydowa lub ketonowa w cząsteczce cukru. Należałoby oczekiwać, że cukry będą miały właściwości redukujące w środowisku alkalicznym, w którym równowaga jest przesunięta zdecydowanie na korzyść formy łańcuchowej, ale nie w środowisku kwasowym, ze względu na występowanie w tym ostatnim formy pierścieniowej cukrów i brak wolnej grupy karbonylowej.

W roztworze wodnym glukozy znajduje się, obok pierścieniowej tylko nieznaczna ilość odmiany łańcuchowej (0,024%). W środowisku alkalicznym następuje otworzenie się pierścienia i uwolnienie grupy aldehydowej lub ketonowej. Dowodem na zablokowanie grupy aldehydowej w środowisku kwasowym, przez wytworzenie mostka tlenowego, jest zachowanie się cukrów wobec roztworu odbarwionej fuksyny.

Cukry redukując inne substancje, np. jony metali ciężkich, barwniki itp., ulegają utlenieniu do kwasów. Glukoza utlenia się przy węglu C1 do kwasu glukonowego. W czasie ogrzewania w środowisku alkalicznym cukry redukujące mogą ulegać rozpadowi na szereg związków o właściwościach redukujących (jest to przyczyną trudności w napisaniu reakcji utleniania cukrów stechiometrycznie). W środowisku alkalicznym cukry mogą redukować tlenki i wodorotlenki metali ciężkich (Cu, Bi, Ag).

Wodorotlenki takie, nierozpuszczalne w wodzie, można utrzymać w roztworze jedynie w obecności związków organicznych zawierających sąsiadujące ze sobą grupy wodorotlenowe (winian sodowo-potasowy, kwas winowy, cytrynowy, gliceryna, a nawet i same cukry)

Winian sodowo-potasowy tworzy z wodorotlenkiem miedziowym rozpuszczalny kompleks. Kompleks ten jest zdysocjowany tylko w nieznacznym stopniu i w miarę redukcji Cu²⁺ przez cukry rozpada się, dostarczając nowych jonów Cu²⁺, które są następnie redukowane do Cu⁺¹ tworzących nierozpuszczalny osad tlenku miedzi (I) Cu₂O.

Zabarwienie osadu Cu₂O zależy od wielkości jego cząstek. Bardzo drobne cząsteczki dają barwę żółtą, większe - pomarańczową, największe - czerwoną. W nieobecności związku redukującego, ogrzewany wodorotlenek miedzi (II) przechodzi w czarny, nierozpuszczalny tlenek miedzi (I): Cu(OH)₂ → CuO + H₂O.

W próbach redukcyjnych przeszkadza obecność białka lub innych koloidów, gdyż utrzymują one w roztworze powstający nierozpuszczalny tlenek miedzi (I) (ochronne działanie koloidów na zawiesiny). Jony amonowe również przeszkadzają, ponieważ dają z miedzią połączenia kompleksowe. Białko usuwa się z roztworu przez odbiałczenie (koagulacja cieplna w środowisku kwasowym), a sole amonowe przez ogrzanie zasadowego roztworu.

Interpretacja wyników

1. Po dodaniu ługu w probówce zawierających wodę (nr 1) powstaje koloidowy, bladoniebieski osad Cu(OH)2 w probówkach zawierających roztwór glicerolu, winianu sodowo-potasowego i glukozy (nr 2, 3 i 5) tworzy się rozpuszczalny kompleks Cu(OH)2 ze związkami posiadającymi grupy alkoholowe, a w probówce zawierającej amoniak (nr 4) powstaje rozpuszczalny kompleks miedzi z amoniakiem [Cu(NH3)4](OH)2 o barwie niebieskiej.

2. Podczas ogrzewania w probówce zawierającej wodę (nr 1) wytrąca się czarny osad tlenku miedzi (II) CuO.

3. W probówkach zawierających roztwór glicerolu, winianu sodowo-potasowego i amoniaku (nr 2, 3 i 4) wytworzone związki kompleksowe nie ulegają wytrącaniu podczas ogrzewania.

4. W probówce zawierającej roztwór glukozy (nr 5) miedź ulega redukcji pod wpływem glukozy i wytrąca się w postaci czerwonego osadu Cu2O (przy małej ilości glukozy i dużym nadmiarze Cu(OH)2 obok czerwonego Cu2O może wytrącić się czarny CuO, maskujący obecność barwy czerwonej).

5. Po dodaniu glukozy do probówek zawierających roztwór glicerolu, winianu sodowo-potasowego i amoniaku (nr 2, 3 i 4) i ponownym ogrzaniu następuje strącenie się Cu2O w probówkach zawierających roztwór glicerolu, winianu sodowo-potasowego (nr 2 i 3), natomiast w probówce zawierającej amoniak (nr 4) redukcja nie zachodzi (wpływ jonów amonowych).

Wymagania

1. Podział lipidów, podział cukrów.

2. Wzory 2-3 kwasów tłuszczowych i cukrów.

3. Reakcje otrzymywania tłuszczy.

4. Reakcje charakterystyczne lipidów i cukrów.

5. Hydroliza tłuszczy, reakcje zmydlania, reakcja utwardzania tłuszczy.

6. Budowa i otrzymywanie mydła.

7. Umiejętność pisania reakcji zachodzących podczas wykonywanych na zajęciach laboratoryjnych ćwiczeniach.

8. Znaczenie biologiczne lipidów i cukrów.

Państwowa Wyższa Szkoła

Informatyki i Przedsiębiorczości w Łomży

^{Instytut Wychowania Fizycznego}

SPRAWOZDANIE Z ZAJĘĆ LABORATORYJNYCH

……………….………………………………………………

(Nazwa przedmiotu)

Ćwiczenie nr: 3, 4

Temat ćwiczenia:

Izolacja i charakterystyka tłuszczowców

Otrzymywanie lecytyn z żółtka jaja.

Reakcje charakterystyce lipidów.

Cukry

Budowa i właściwości.

Reakcje charakterystyczne cukrów.

Imię i nazwisko studenta:…………………………………………..

Kierunek studiów:……………………………………………………

Semestr:………………………………………………………………

Ocena

Nazwa tłuszczu	NAZWA ROZPUSZCZALNIKA
	woda destylowana	detergent	etanol	chloroform
Olej roślinny
smalec
margaryna
lecytyna

9

---