Ćwiczenie nr 4

Kataliza enzymatyczna - czynniki wpływające

na aktywność enzymów

Wprowadzenie

Biochemiczne reakcje oksydoredukcyjne są podstawowymi procesami dostarczającymi energii niezbędnej dla przemian w organizmach żywych. Przyjmując za kryterium mechanizm działania, enzymy klasy oksydoreduktaz można ująć w cztery grupy:

• dehydrogenazy - katalizują odrywanie atomów wodoru i przenoszą je na inne enzymy czy też związki pośrednie, a nie mają zdolności przenoszenia, elektronów bezpośrednio na tlen;

• oksydazy - katalizują przenoszenie elektronów bezpośrednio na tlen. W pewnych przypadkach niektóre enzymy są zarówno oksydazami jak i dehydrogenazami tzn. odrywane od substratu elektrony przenoszą bezpośrednio na tlen bez udziału enzymów pośrednich;

• oksygenazy - katalizują wbudowywanie tlenu w cząsteczkę;

• hydroperoksydazy - obejmują dwie podgrupy enzymów: peroksydazy i katalazy. Obydwie podgrupy powodują rozkład nadtlenku wodoru. Peroksydaza rozkłada H₂O₂, a powstający tlen utlenia jakąś substancję, natomiast katalaza powoduje rozkład nadtlenku wodoru niezależnie od obecności akceptora tlenu.

1. Oksydazy

Enzymy te przenoszą wodór bezpośrednio na tlen atmosferyczny. Substratem są często mono- i polifenole. Spośród oksydaz duże znaczenie praktyczne ma oksydoreduktaza, zwana potocznie oksydazą fenolową. Enzym ten jest metaloproteidem zawierającym w swoim składzie miedź (ok. 0,2%), która przyjmuje elektrony od fenoli i przekazuje na tlen cząsteczkowy. Oksydaza fenolowa odgrywa dużą rolę w przemyśle spożywczym. Dzięki jej działaniu następuje ciemnienie przekroju rozciętego jabłka lub ziemniaka, efektem jej działania jest także kolor czarnej herbaty, chleba razowego.

Wykonanie doświadczenia

Przygotować wyciąg ziemniaczany przez umycie i obranie ziemniaka, utarcie na tarce i włożenie do woreczka płóciennego, a następnie, zanurzenie w zlewce z ok. 200 ml wody. Zawartość zlewki łagodnie mieszać. Uzyskuje się wodny ekstrakt enzymów i skrobi. Poczekać aż osad skrobi opadnie, ciecz nadosadową należy zdekantować i używać do doświadczeń.

Do 3 probówek wlać po 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Do pierwszej dodać 10 kropli 1% roztworu fenolu, do drugiej 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny, do trzeciej 10 kropli 1 % roztworu pirogalolu. Zawartość probówek zamieszać i obserwować zmiany zabarwienia. Ponieważ reakcja przebiega dość wolno, w międzyczasie należy wykonać pozostałe doświadczenia

Wyniki doświadczeń

W określonych odstępach czasu notować nasilenie barwy w probówkach zawierających poszczególne fenole.

Intensywność barwy Probówka	Czas
		0,5 godz.	1 godz.	1,5 godz.	2 godz.
z fenolem z pirokatechiną z pirogalolem

2. Katalaza

Katalaza jest nadzwyczaj szeroko rozpowszechnionym enzymem: występuje u zwierząt, roślin i wszystkich bakterii tlenowych. Katalizuje reakcję rozkładu nadtlenku wodoru do tlenu i wody według równania:

2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂

Katalaza jest metaloproteidem i w stanie krystalicznym zawiera 0,09% żelaza. Istnieje wiele inhibitorów katalazy. Sam nadtlenek wodoru w większych stężeniach powoduje dezaktywację enzymu. Hamująco działa również szereg substancji reagujących z żelazem trójwartościowym, koenzymu katalazy (cyjanki, siarczki, fluorki, hydroksyloamina).

Wykonanie doświadczenia

Przygotować dwie probówki z 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Do pierwszej z nich dodać 1 ml 3% H₂O₂. Pod działaniem katalazy następuje obfite wydzielanie tlenu.

Drugą ogrzać do wrzenia w płomieniu palnika, po czym dodać 1 ml wody utlenionej. Zapisać w tabeli obserwacje.

Wyniki doświadczeń

Doświadczenie	Wynik	Wniosek
probówka 1 probówka 2

3. Peroksydaza

Peroksydaza jest enzymem bardzo rozpowszechnionym w roślinach, występuje także u zwierząt i niektórych bakterii. Jej działanie podobnie jak katalazy związane jest z obecnością nadtlenku wodoru. Jednak nadtlenek wodoru nie jest rozkładany z wydzieleniem tlenu, ale wykorzystywany jest przez enzym w reakcjach utleniania wielu substratów - fenoli i amin aromatycznych.

Podobnie jak katalaza, koenzym peroksydazy zawiera żelazo. Jest mało wrażliwa na wysoką temperaturę i jeszcze w 100°C zachowuje częściowo swoją aktywność. Przebieg typowej reakcji katalizowanej przez peroksydazę przedstawia się następująco:

peroksydaza

AH₂ + H₂O₂ ——→ A + 2 H₂O

Wykonanie doświadczenia

1. Do 3 probówek zawierających po 5 ml wyciągu ziemniaczanego wprowadzić do każdej probówki inną substancję po 10 kropli 1% roztworu fenolu, 1% roztworu pirokatechiny, 1% roztworu pirogalolu oraz do każdej probówki po 10 kropli 3% H₂O₂. Obserwować powstawanie barwy.

2. Do dwóch probówek odmierzyć po 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Ogrzewać probówki w łaźni wodnej w temperaturze 70°C przez 10 min. Łaźnię wodną przygotować w sposób następujący: do zlewki nalać gorącej wody. Za pomocą termometru rtęciowego ustalić temperaturę wody nie wyższą niż 70°C, wstawić probówki z wyciągiem ziemniaczanym na 10 min. Po tym czasie do jednej dodać 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny, a do drugiej dodać 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny i 10 kropli 3% H₂O₂. Zanotować rezultaty eksperymentu.

Wyniki doświadczeń

Doświadczenie	Wynik	Wniosek
Próba z fenolami probówka 1 probówka 2 probówka 3
Wpływ temperatury probówka 1 probówka 2

Zagadnienia do opracowania

Specyficzność substratowa enzymów.

Czynniki specyficzne i niespecyficzne wpływające na przebieg reakcji enzymatycznych

Inhibicja i aktywacja reakcji enzymatycznych.

Enzymy drobnoustrojów- konstytucyjne, indukcyjne i represyjne.

Adaptacje enzymatyczne drobnoustrojów.

Literatura

1. K. Miksch, Laboratorium podstaw biochemii technicznej. Skrypt uczelniany Politechniki Śląskiej, Gliwice 1980.

2. A. Kączkowski, Podstawy biochemii. Wydawnictwo PWN, Warszawa 1990.

---