Mikrobiologia i wirusologia ćw.1

Temat: Technika mikroskopowa i budowa komórki bakteryjnej.

Mikroskopy umożliwiają:

- wykazywanie drobnoustrojów, czy są w materiale czy nie.

- ocena morfologii komórek bakteryjnych na podstawie cech określonych.

Wynalazł mikroskop Anthony van Leeuwenhoek.

Zbudował pierwszy mikroskop Zacharias Jensen (1588 - 1631). Był prosty, zbudowany z 2 rurek nachodzących na siebie, wyglądał jak luneta. Służył do celów raczej zabawowych dla ludzi bogatych. Częściej do obserwacji niż do naukowych celów.

Drugą osobą, która zajmowała się mikroskopem był Robert Hooke (1635 - 1703). Pierwszy mikroskop do celów naukowych. Oglądał korek i wprowadził terminologię komórki.

Budowa mikroskopu świetlnego :

- okular (obserwujemy przez niego),

- rewolwer (pokrętło),

- obiektyw (kolejne soczewki),

- śruba makrometryczna,

- śruba mikrometryczna,

- stolik,

- źródło światła,

- kondensator,

- statyw.

Okular powiększa obraz tworzony przez obiektyw. Jeden z rodzajów soczewek.

Tubus - formowanie powiększonego obrazu pośredniego.

Śruba makrometryczna - wstępnie reguluje odległość

Śruba mikrometryczna - ustalanie ostrości.

Rewolwer - prosta zmiana obiektywu

Obiektywy - zbierają światło wychodzące z przedmiotu i tworzą jego powiększony obraz pośredni.

Stolik - do położenia preparatu

Łapki - przymocowują

Śruby - do poruszania stolikiem

Kondensator - kondensuje światło

Typy mikroskopów:

- mikroskop świetlny,

- ultramikroskop,

- mikroskop fazowo - kontrastowy,

- mikroskop luminescencyjny,

- mikroskop ultrafioletowy,

- mikroskop elektronowy,

- mikroskop elektronowy skaningowy.

Oko ludzkie 10^-4

Mikroskop świetlny 10^-3 - 10^-7

Mikroskop elektronowy 10^-5 - 10^-10

Mikroskop świetlny zwykły:

- zasadą działania jest wzmocnienie 2 soczewek pracujących w zespole. Jedna to obiektyw a druga to okular.

- otrzymane powiększenie jest iloczynem powiększenia obiektywu i okularu,

- zastosowanie: laboratorium mikrobiologiczne i cytologiczne.

- częściej są w nim oglądane drobnoustroje w postaci zabitej i barwione.

- może on zawierać kondensator do oglądania w ciemnym polu widzenia.

- ocena morfologii komórek bakteryjnych dotyczy tylko kształtu, wielkości, ułożenia lub sposobu barwienia.

- jeśli korzysta się ze specjalnych technik barwienia można zaobserwować rzęski, otoczki, przetrwalniki, ziarna wolutynowe.

Ultramikroskop:

- umożliwia oglądanie drobnoustrojów w ciemnym polu widzenia.

- jest zmodyfikowany przez zaopatrzenie w specjalny kondensator mikroskopem świetlnym zwykłym.

- kondensator zatrzymuje centralne promienie świetlne padające na preparat oświetlany promieniami bocznymi padającymi pod pewnym kątem.

- oglądane w ten sposób obrazy wyglądają jak gwiazdy świecące na ciemnym niebie.

Można w nim zaobserwować cząsteczki mniejsze niż przy użyciu zwykłego mikroskopu świetlnego.

- zazwyczaj oglądane są preparaty świeże niebarwione.

Mikroskop fazowo - kontrastowy:

- pozwala na oglądanie drobnoustrojów umieszczonych w kropli wody oraz na odróżnianie struktur komórkowych bez barwienia.

- możliwe jest także wykazanie bakterii w nie barwionych fragmentach tkanek oraz analize szczegółowych struktur wewnątrzkomórkowych.

- specjalna optyka w tym mikroskopie uwzględnia różnice w gęstości materiałowo - biologicznym i ich współczynników załamania światła.

Mikroskop luminescencyjny:

- zajmuje pośrednie miejsce między zwykłym mikroskopem świetlnym a ultrafioletowym,

- do oświetlania użyte SA promienie UV niewidzialne dla ludzkiego oka,

- zjawisko fluorescencji uzyskuje się po wybarwieniu związkami fluoroscencyjnymi.

Mikroskop ultrafioletowy:

- do oświetlania preparatów wykorzystuje się promienie UV przechodzące przez szkło kwarcowe znajdujące się w konstrukcji systemu optycznego.

- dzięki promieniowaniu UV zwiększa się zdolność rozdzielcza mikroskopu do 0,1mikrona.

- obraz rejestrowany na kliszy fotograficznej.

Mikroskop elektronowy:

- zasada działania polega na wykorzystywaniu strumienia elektronów, które przechodząc przez pole magnetyczne zachowują się podobnie jak wiązka promieni świetlnych przechodzące przez soczewki.

- obrazy rejestrowane na ekranie fluoryzującym lub na kliszy fotograficznej.

- oglądany obraz jest jakby cieniem oglądanego przedmiotu.

- umożliwia powiększenie obrazu do miliona razy.

- oglądane są wysuszone nie zabarwione preparaty poddane cieniowaniu solami metali ciężkich np. solami złota.

Mikroskop elektronowy skaningowy:

- wykorzystywany jest strumień elektronów, który nie przenika przez preparat.

- można uzyskać obraz przestrzennej budowy drobnoustrojów i ich szczegółów.

- przeznaczony jest głównie do celów diagnostycznych głównie w chorobach zakaźnych o etiologii wirusowej.

BUDOWA KOMÓRKI BAKTERYJNEJ

a) podstawowe struktury:

- ściana komórkowa,

- błona cytoplazmatyczna,

- mezonom (centrum energetyczne) ,

- nukleoid (materiał genetyczny),

- ciałka chromatoforowe,

- cytoplazma,

- rybosomy,

b) specjalne struktury (nie wszystkie bakterie je posiadają):

- rzęska (do poruszania się),

- otoczka,

- substancje zapasowe,

- fimbrie (wypustki),

- plazmidy,

- przetrwalniki.

Ściana komórkowa - rola:

- ochrona protoplastu przed czynnikami zewnętrznymi,

- przeciwdziałanie i utrzymanie gradientu ciśnienia osmotycznego między wnętrzem komórki a środowiskiem zewnętrznym,

- nadaje kształt zewnętrzny komórki,

- ułatwianie komunikacji ze środowiskiem zewnętrznym.

a) Budowa:

- zbudowana jest z peptydoglikanu (murieny). Cząsteczka peptydoglikanu jest zbudowana z długich łańcuchów polisacharydowych, które łączą się w sieć za pomocą mostków peptydowych.

- każdy łańcuch polisacharydowy zbudowany jest z dwucukrów

→ N-acetyloglukozaminy

→ kwasu N- acetylomuraminowego (występuje wyłącznie u organizmów prokariotycznych).

- do kwasu N- acetylomuraminowego dołączony jego tetra peptyd

→ często w jego układzie spotyka się aminokwasy występujące jedynie u bakterii (np. kw. Mezodwaaminopimelinowy, izomery D alaniny i kw. Glutaminowego).

- wiązanie krzyżowe peptydoglikanu powstaje przez połączenie tertapeptydów sąsiadujących łańcuchów mostkiem peptydowym.

- wiązanie powstaje między przedostatnią resztą jednego tetra peptydu ( L - lizyna lub kw. Mezodwuaminopimelinowy), a ostatnią resztą drugiego tertapeptydu (zwykle D - alanina).

- mostki zbudowane są przeważnie z glicyny lub L - alaniny.

Ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej dzielimy bakterie na Gram - dodatnie i Gram - ujemne.

BUDOWA TETRAPEPTYDU:

1.L - alanina 2. Kw. D- glutaminowy 3. Lizyna Gram(+) lub kw. Dwuaminopimelinowy Gram (-) 4. Proalanina.

Ściana komórkowa bakterii Gram dodatnich:

- grubość 20 - 80 nm

- składa się w 60 - 100% z peptydoglikanu, tworzącego trójwymiarową sieć. Złożony z linijnych polimerów w N- acetyloglukozaminy, kw. N- acetylomuraminowego.

- peptydoglikan bakterii Gram dodatnich może być hydrolizowany przez lizozym. Hydrolizowane jest wiązanie pomiędzy kw. N- acetylomuraminowym a N- acetyloglukozaminą.

- u niektórych bakterii przy aminokwasach występują dodatkowe grupy o- acetylowi, które czynią peptydoklikan niewrażliwym na działanie lizozymu.

- charakterystycznymi składnikami ściany komórkowej bakterii Gram dodatnich są także kw. Tejchojowe (rybitolowy i glicerolowy). Ich obecność ma znaczenie taksonomiczne.

- występują u niektórych polisacharydy i kwasy mykolowe,

- białka ściany komórkowej: np. białka M u Streptococcus pyogenes gr. A mogą być antygenami i warunkować właściwości chorobotwórcze bakterii.

Ściana komórkowa bakterii Gram ujemnych:

- grubość 10nm,

- bardziej złożona budowa chemiczna i strukturalna.

Składa się z 4 warstw:

1. 
   
   Lipopolisacharyd

2. Fosfolipidy

3. Białka

4. Peptydoglikan

Ad.1

Lipopolisacharyd (LPS) endotoksyna:

- hetero polimer zbudowany z 3 składowych:

* Lipid A,

* oligocukier rdzeniowy, nazywany antygenem wspólnym (CA - common antygen) lub antygenem Kumina,

* antygen somatyczny (antygen )).

- jest odpowiedzialny za wiele objawów chorobotwórczych u ludzi i zwierząt.

Ad.2 Fosfolipidy - podobne do fosfolipidów błony komórkowej, tworzą dwie warstwy skierowane do siebie regionami hydrofobowymi.

Ad.3 Białka główne - wiążą się między sobą z LPS i peptydoglikanem, tworzą kanały porynowe.

Ad.4 Peptydoglikan : cieńszy, struktura 2- wymiarowa, bardziej elastyczny, występują mostki peptydowe tworzące wiązania krzyżowe wiążące się z błoną cytoplazmatyczną wiązaniami jonowymi.

CYTOPLAZMA:

- zawiera wodę, nieorganiczne jony, niskocząsteczkowe metabolity, wysokocząsteczkowe polimery kw. Nukleinowych, substancje zapasowe, białka i rybosomy, toczą się w niej wszystkie procesy życiowe i funkcje ważne dla komórki.

NUKLEOID:

- materiał chromosomowy znajdują się informacje genetyczne, podwójne spirale z dwóch nici komplementarnych łańcuchów polinukleotydowych zwiniętych w kłębek. Jest przyczepiony do mezosomu lub do ściany komórkowej. Można go zaobserwować dokładnie dzięki specjalnemu barwieniu w mikroskopie świetlnym.

Pozachromosomowe czynniki dziedziczenia:

- niezależnie od nukleoidu mogą występować inne elementy genetyczne tj. plazmidy, transpozony oraz bakteriofagi.

RYBOSOMY:

- odgrywają rolę centrum, w którym odbywa się synteza białek.

BŁONA CYTOPLAZMATYCZNA:

- otoczona jest przez błonę cytoplazmatyczną przez, którą komórka komunikuje się ze środowiskiem zewnętrznym. Pełni funkcje: transportu elektronów, syntezy i transportu prekursorów wydzielania enzymów, toksyn.

MEZOSOMY:

- są utworzone przez wpuklenie błony cytoplazmatycznej do wnętrza komórki.

- funkcje: są miejscem przyczepu nukleoidu do błony, są miejscem gdzie występują liczne enzymy w tym biorące udział w syntezie składników ściany komórkowej, oraz obszarem lokalizacji enzymów oddanych.

PROTOPLASTY:

- komórki bakterii Gram dodatnich pozbawione murieny

SFEROPLASTY:

- komórki bakterii Gram ujemnych pozbawione murieny.

OTOCZKI:

- ich obecność można wykazać za pomocą barwienia negatywnego lub w testach serologicznych. Bakterie otoczkowe tworzą charakterystyczne śluzowate kolonie typu S, M, podczas gdy ich bezo toczkowe odmiany tworzą kolonie szorstkie R. Chronią komórkę przed wysychaniem, chronią przed fagocytozą, uczestniczą w adhezji, SA nieprzepuszczalne dla niektórych antybiotyków.

RZĘSKI:

- służą do poruszania się bakterii, SA długie, wypustki puste w środku filamenty. Ich długość może być kilka razy dłuższa niż bakteria. Obserwuje się przy odpowiednim barwieniu lub odpowiednim mikroskopie (elektronowym). Niektóre drobnoustroje mają ich dużo i mogą pełzać.

FIMBRIE(pili):

- są krótsze od rzęski, prostszą budowę, najczęściej w Gram ujemnych.

2 rodzaje:

* zwykłe (należą do wyznaczników chorobotwórczych bakterii),

* płciowe (służą do przekazywania plazmidów w procesie koniugacji z druga bakterią).

PRZETRWALNIKI(endospory):

- wytwarzane w większości przez bakterie niechorobotwórcze ( Bacillus i Clostridium). Pozwalają przetrwać bakterii. Wytwarzają się kiedy są niesprzyjające warunki dla bakterii (sporulacja).

Tworzenie przetrwalników to proces sporulacji. Przetrwalniki przeniesione do odpowiednich warunków mogą kiełkować, a proces ten nosi nazwę germinacji. Przetrwalniki mogą być uwidocznione w mikroskopie świetlnym po zastosowaniu specjalnych metod barwienia (metody np. Dornera).

ZIARNA CYTOPLAZMY:

- są to zapasowe substancje odżywcze,

- mogą być otoczone cienką błoną luźno umieszczone w cytoplazmie.

Błona zewnetrzna

Błona zewnętrzna

---