DDRT-PCR, Semestr VI, Markery molekularne

Żywe organizmy, w swoich genomach, posiadają dziesiątki tysięcy unikalnych genów, z których tylko niewielka frakcja, być może 15%, ulega jakiejkolwiek ekspresji. Dlatego istnieje regulacja ekspresji odpowiednich genów, która steruje rozwojem komórek, nie tylko zdrowych - również patologicznych. Podstawowym problemem jest identyfikacja tych genów. DDRT-PCR został opracowany w roku 1992 po to żeby szybko i dokładnie stwierdzić zmienioną ekspresję danego genu.
W przeciwieństwie do innych technik DDRT-PCR może bez problemu „działać” przy bardzo niewielkiej ilości RNA - jest więc bardzo czułe. Metoda ta opiera się na założeniu, że każdy mRNA ulegający ekspresji w komórce może być wykryty na żelu agarozowym po uprzedniej reakcji odwrotnej transkrypcji z udziałem odpowiednich primerów, które mają statystyczną szansę do przyłączenia się do odpowiedniej sekwencji w populacji różnych mRNA. DDRT szybko zastępuje tradycyjne metody klonowania genów ponieważ jest bardzo efektywne w identyfikacji sekwencji, które ulegają zmiennej ekspresji, oraz, co ważniejsze - rozpoznaje transkrypty interesujących nas genów w populacji mRNA - co ciekawe wystarczą mikro lub nawet nanogramy RNA żeby reakcja się powiodła.
DDRT-PCR przebiega podobnie jak RT-PCR. mRNA musi być zidentyfikowany, następnie powstałe cDNA jest ponownie odzyskiwane z żelu agarozowego, reamplifikowane i wklonowane w odpowiedni wektor plazmidowy. Ekspresja genu musi być potwierdzona niezależnymi analizami RNA takimi jak slot blot czy northern blot - zanim ustalimy sekwencje klonowanego genu. Ponieważ nici cDNA klonowane przez DDRT-PCR są generalnie dość krótkie (150-500bp) i reprezentują region 3' genu, izolacja genów o pełnej długości z bibliotek DNA jest niezbędna przed oceną ich funkcji. Primery końca 3'używane do DDRT-PCR są tak skonstruowane, aby ulegały hybrydyzacji z poliadenylowymi ogonkami mRNA. Primery końców 5' są krótkie, stanowią losowe sekwencje oligonukleotydów, które hybrydyzują losowo w pewnej odległości od primera 3'. Pary primerów muszą być tak dobrane żeby każda z nich doprowadzała do amplifikacji innych fragmentów cDNA o różnej masie molekularnej w celu optymalnego rozdziału na żelu (przeważnie 70-100 regionów). Reakcja RT rozpoczyna się od hybrydyzacji primera na końcu 3' z końcem poli-A. Po utworzeniu nici cDNA, amplifikacja następuje z udziałem primerów 3' i 5' - żeby cDNA było amplifikowane primer końca 5' musi zhybrydyzować z cDNA w odległości nie większej niż 2-3 kb (przecietny rozmiar mRNA wynosi 1,2kb).

Etapy:
1.Przygotowanie RNA (RNA preparation):
- efektywne zniszczenie komórek lub tkanek (dezintegracja materiału)
- inaktywacja aktywności RNAz
- denaturacja kompleksów nukleoproteinowych
- oczysczenie RNA z DNA i białek

Prostym testem na wykrycie zanieczyszczenia kwasem DNA jest wstępny PCR przeprowadzony w takich samych warunkach jak ten przeprowadzony dla DDRT tylko pomijający syntezę pierwszej nici cDNA. Jeśli na żelu agarozowym pojawią się prążki - wskazują na obecność DNA.

2.RT-PCR - reakcja odwrotnej transkrypcji i PCR
3.Izolacja DNA z żelu agarozowego (np. tylko cDNA powyżej 200bp są wycinane i odzyskiwane z żelu - selekcja taka uzyskiwana jest dzięki zastosowaniu markera - prążki widoczne są dzięki barwnikowi) - elucja dokonywana jest w wodzie destylowanej i mimo, że ilość wypłukanego cDNA jest mała - wciąż wystarczy do reamplifikacji. Często też dodawany jest glikogen w celu precypitacji małej ilości cDNA.
4.ponowna reamplifikacja uzyskanych fragmentów cDNA - konieczna jest w celu późniejszego przeprowadzenia analizy ekspresji i klonowania. Generalnie wystarczą 4l cDNA w obecności par tych samych primerów jakie użyte były do RT. Odpowiednie temperatury i ilość cykli są takie same jak w poprzednim PCR, ale koncentracja dNTP powinna być wyższa.
5.klonowanie interesujących nas fragmentów cDNA np. w wektor pCR-TRAP zawierający represor genu cI faga lambda, którego produkt jest inhibitorem aktywności promotora, który kontroluje ekspresje genu odporności na tetracyklinę. Insert powoduje inaktywację represora genu odporności.
6.identyfikacja wklonowanych fragmentów - po transformacji zrekombinowane plazmidy sprawdzane są na obecność insertów w wyniku trawienia odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Istnieje prosta metoda amplifikacji wklonowanych insertów wykorzystująca lizat uzyskany z pojedyńczej kolonii jako „matrycy” i sekwencji otaczających wklonowany fragment jako primerów.
7.potwierdzenie zmiennej ekspresji klonowanych fragmentów cDNA - analiza Northern Blot jest standardową procedurą używaną do potwierdzenia, że prążki cDNA wyizolowane z żelu reprezentują interesujący nas gen. Slot Blot również może być użyta, ale tylko do wstępnych analiz większej ilości „przypuszczalnie pozytywnych” cDNA - rezultaty muszą być potwierdzone na Northern Blot.

Northern Blot (krótko dla przypomnienia)
Preparat RNA poddaje się elektroforezie w żelu agarozowym w warunkach denaturujących. Po barwieniu bromkiem etydyny widać dwa prążki - dwie większe cząsteczki rybosomowego RNA (rRNA), występujące obficie w większości komórek. Mniejsze rRNA, których także jest dużo, są niewidoczne, gdyż są tak małe, że wypływają z żelu. W większości komórek żaden z informacyjnych RNA (mRNA) nie występuje tak licznie, by utworzyć prążek widoczny po barwieniu bromkiem etydyny. Kwas nukleinowy z żelu przenosi się na błonę nylonową i - w tym przykładzie - hubrydyzuje z wyznakowanym fragmentem DNA. Na autoradiogramie widać jeden prążek wskazujący, że fragment DNA użyty jako sonda zawiera część lub całość jedenj sekwencji ulegającej ekspresji.

8.sekwencjonowanie - stanowi ostateczny dowód na to, że mamy do czynienia z ekspresją danego genu - sekwencję RNA otrzymuje się przez przekształcenie go w cDNA i sekwencjonowaniu metodą terminacji łańcucha.

Przykładowe zastosowanie DDRT-PCR:
Za pomocą DDRT-PCR badano ekspresję genów pszenicy zwyczajnej - genów, które ulegają ekspresji w odpowiedzi na wernalizację. Dwie izogeniczne linie Vrn-A1 (Vrn-A1 - pszenica jara, vrn-A1 - pszenica ozima) były poddane wernalizacji, poddano jej m.in. rozwijające się zarodki. Z pośród wyizolowanych 110 fragmentów cDNA o zmiennej ekspresji, 48 sprawdzono pod względem ich lokalizacji w chromosomach i oznaczono jako wec (wheat-embryo cold treatment). Siedem z pośród nich wykazało specyficzną ekspresję w odpowiedzi na wernalizację.

Literatura:

1. „Genomy” T.A. Brown
2. © 1998-2005 NAGRP - US Pig Gene Mapping Coordination Program:
http://www.genome.iastate...tech/ddpcr.html
3. S. Colonna-Romano, A. Leone, B. Maresca (1998) „Differential-Display Reverse Transcription-PCR (DDRT-PCR)”
4. C. Shindo, T.Sasakuma (2002) Genes responding to vernalization in hexaploid wheat