Problemy badania dioksyn w próbkach żywności

Adam Grochowalski

Wydział Inżynierii i Technologii Chemicznej

Politechnika Krakowska

1. Wyjaśnienie stosowanych skrótów

μl - 10^-6 L

ng - nanogram = 10-9g

pg - pikogram = 10-12g

GC-MS/MS - spektrometria masowa w sprzężeniu z chromatografią gazową z

podwójną fragmentacją analizowanej cząsteczki.

PCDDs - polichlorowane dibenzoparadioksyny (dibenzodioksyny)

PCDFs - polichlorowane dibenzofurany

PCDD/F - sumarycznie, PCDDs i PCDFs

TCDD/TCDF - tetrachlorodibenzodioksyna / tetrachlorodibenzofuran

P₅CDD/P₅CDF - pentachlorodibenzodioksyna / pentachlorodibenzofuran

H₆CDD/H₆CDF - heksachlorodibenzodioksyna / heksachlorodibenzofuran

H₇CDD/H₇CDF - heptachlorodibenzodioksyna / heptachlorodibenzofuran

OCDD / OCDF - oktachlorodibenzodioksyna / oktachlorodibenzofuran

¹³C-PCDDs, ¹³C-PCDFs dioksyny i furany znaczone stabilnym izotopem

węgla ¹³C. Wszystkie 12 atomów węgla w cząsteczce o masie atomowej 13.

PCB, PCBs - polichlorowane bifenyle

TEF - współczynnik równoważny toksyczności 2,3,7,8-TCDD

wartość normowana dla PCDDs, PCDFs i koplanarnych PCBs

TEQ - poziom toksyczności analizowanej próbki.

Toksyczność próbki wyrażana jest w pg-TEQ/g dla próbek stałych i

ciekłych.

Dokładne objaśnienie znaczenia TEF i obliczania TEQ znajduje się w tekście

1. Wprowadzenie

Dioksynami nazywa się grupę chloroorganicznych, aromatycznych związków chemicznych, których cząsteczki wykazują wyjątkowo dużą stabilność termiczną i odporność chemiczną na utlenianie oraz procesy degradacji biologicznej. Pełna nazwa tych związków to polichlorowane dibenzoparadioksyny. W skrócie oznaczane są jako PCDDs. Substancje te, co zostało już udowodnione w wielu badaniach toksykologicznych i farmakologicznych należą do silnie toksycznie działających związków chemicznych , które zostały sztucznie wytworzone przez człowieka. Ze względu na podobne własności toksyczne oraz występowanie w przyrodzie do grupy dioksyn zalicza się również polichlorowane dibenzofurany - PCDFs i koplanarne, polichlorowane bifenyle - PCBs.

Dioksyny są bardzo dobrze rozpuszczalne w tłuszczach. Niemniej jednak są one również oznaczane w produktach niskotłuszczowych.

Problem z zawartością dioksyn w paszach i produktach pochodzenia zwierzęcego importowanych z Unii Europejskiej, głównie z Belgii stał się jednym z głównych problemów skażenia chemicznego żywności. Według informacji otrzymanych z Unii Europejskiej mięso kurczaków zawierało 700 ng-TEQ/kg tłuszczu. To bardzo dużo, biorąc pod uwagę, że według zaleceń poziom ten nie powinien przekraczać 5 ng-TEQ/kg w odniesieniu do masy tłuszczu u karmionych naturalnie zwierząt. Jakkolwiek problem ten dotyczył produktów znajdujących się na rynku od lutego do maja 1999, gdy cała sprawa ujrzała światło dzienne, to w moim przekonaniu dzisiaj trudno by znaleźć kurczaki i inną żywność skażoną dioksynami na tym poziomie.

W wyniku badań prowadzonych na ponad 250 próbkach żywności, pasz i składników paszowych w Laboratorium Analiz Śladowych Wydziału Inżynierii i Technologii Chemicznej w Politechnice Krakowskiej w miesiącach od czerwca do października 1999 nie wykazano w żadnej z nich podwyższonej zawartości dioksyn. Przedmiotem badania były próbki mięs: drobiowego, wieprzowego, żelatyny, mleka w proszku, mleka świeżego, mączek mięsno-kostnych, mączki rybnej, stosowanych jako składniki pasz, a nawet czekolady. Z wyjątkiem preparatów zawierających tłuszcze rybne, żadna z tych próbek nie zawierała dioksyn powyżej 5 ng-TEQ/kg tłuszczu, lub rzeczywistej masy próbki (jak np. żelatyna).

W Unii Europejskiej nie ma do tej pory żadnych jednolitych norm regulujących maksymalną zawartość dioksyn w innych produktach choćby jak mięso, masło, oleje spożywcze czy jaja. Proponowane są jedynie wskaźniki, które mają być przedmiotem dyskusji wiosną 2000.

W opinii wielu naukowców z Niemiec, Holandii i Szwecji ustalenie takich wskaźników w ogóle nie będzie możliwe. Otóż przedmiotem spornym jest dieta, która dla ludzi jest różna, a od dawki dioksyn zależy problem utraty zdrowia.

Aktualnie (dane z 16.06.99) dyskutuje się w Niemczech nad przyjęciem dopuszczalnej zawartości dioksyn w tłuszczu niektórych produktów zwierzęcych takich jak:

wieprzowina 2 pg-TEQ/g

drób 5 pg-TEQ/g

wołowina 6 pg-TEQ/g

mleko 3 pg-TEQ/g

jaja 5 pg-TEQ/g

Oznaczanie dioksyn, wykonywane w Laboratorium Analiz Śladowych Wydziału Inżynierii i Technologii Chemicznej Politechniki Krakowskiej w próbkach żywności prowadzone jest w oparciu o wieloletnie doświadczenia analityczne, współpracę międzynarodową oraz coroczny udział w międzynarodowych porównaniach międzylaboratoryjnych organizowanych przez Uniwersytet w Umeå w Szwecji.

3. Opis metodyki oznaczania PCDDs i PCDFs.

Badanie zawartości dioksyn wymaga wyizolowania ich z badanej próbki i uwolnienia jej od zanieczyszczeń utrudniających oznaczenie. Jest to duży problem analityczny wynikający z faktu, że stężenie dioksyn w środkach spożywczych jest na poziomie nanogramów w 1 kilogramie próbki. Wymaga to niezwykle selektywnego wydzielania dioksyn oraz czasochłonnego oddzielania od zanieczyszczeń. Jest to duży problem analityczny głównie z powodu silnej rozpuszczalności dioksyn w tłuszczach. Przygotowanie próbki do analizy jest długotrwałą i kosztowną procedurą analityczną. Stąd oznaczanie dioksyn prowadzone jest jak do tej pory w nielicznych laboratoriach, które oprócz wyposażenia w wysokiej klasy aparaturę analityczną muszą opanować przede wszystkim złożoną technikę przygotowania próbek do analiz dioksyn.

Przygotowanie próbek do analiz instrumentalnych prowadzone jest według procedur opartych na technikach ekstrakcji w układzie ciecz-ciało stałe w aparatach Soxhleta, metodą ASE oraz technikami mikrofalowymi a następnie wielostopniowej chromatografii cieczowej. Próbki żywności zawierające w swoim składzie wodę (sery, jogurty, mięso) należy wysuszyć poprzez liofilizację lub metodami chemicznymi. Z próbki mleka należy usunąć białko poprzez wytrącenie za pomocą szczawianu sodowego, a następnie ekstrahować w układzie ciecz-ciecz eterem dietylowym. Jajka powinny zostać uprzednio ugotowane na twardo i wysuszone. Mięsa rozciera się w homogenizerze, suszy bezwodnym siarczanem sodowym. Do ekstrakcji stosowane są rozpuszczalniki organiczne o bardzo wysokiej czystości, gdyż niejednokrotnie wymagane jest ich 1000-krotne zagęszczenie. Dla próbek o zawartości tłuszczu ponad 30% stosuje się również techniki membranowe przy zastosowaniu polimerycznych membran półprzepuszczalnych w celu usunięcia matrycy tłuszczowej.

Poważnym problemem mogą być straty dioksyn z badanej próbki podczas przygotowania do analiz. Aby proces ten kontrolować wprowadza się wzorce odzysku. Do określenia stopnia odzysku stosowane są wzorce znaczone izotopowo ¹³C-PCDDs, ¹³C-PCDFs i ¹³C-PCBs, które wprowadza się do próbek przed analizą.

Analizy kongenerów PCDDs, PCDFs i koplanarnych PCBs wykonywane są techniką chromatografii gazowej w sprzężeniu ze spektrometrią masową z podwójną fragmentacją badanej cząsteczki przy wykorzystaniu urządzeń typu Finnigan MAT GCQplus GC-MS/MS.

Zdecydowanie, do analiz PCDDs/Fs i PCBs szczególnie w próbkach biologicznych najlepsze są systemy chromatografów gazowych sprzężonych z wysokorozdzielczymi spektrometrami masowymi. Spektrometry wysokorozdzielcze są w stanie rejestrować jony różniące się nawet o 10^-5 jednostki masy atomowej. Jednak ze względu na bardzo wysoka cenę, systemy wysokorozdzielcze nie są powszechnie stosowane.

Do oznaczeń próbek z matrycą mineralną o zawartości dioksyn powyżej 1ng/g (np. popioły ze spalarni odpadów) wystarczają prostsze i tańsze systemy niskorozdzielcze. Do oznaczeń próbek biologicznych zalecane są spektrometry wysokorozdzielcze.

Pewnym kompromisem pomiędzy uzyskaniem wysokiej selektywności rozdziału mieszaniny analizowanych związków a kosztem inwestycyjnym i eksploatacyjnym urządzenia są systemy chromatografii gazowej z detektorami z podwójną fragmentacją badanej cząsteczki (GC-MS/MS). Pod względem rozwiązań konstrukcyjnych system GC-MS/MS jest nowszą wersją detektora typu pułapki jonowej z możliwością rejestracji jonów wtórnych powstałych wskutek kolizji jonu pierwotnego z atomami helu. Urządzenia GC-MS/MS w optymalnych warunkach pracy mogą mieć podobną selektywność i podobny poziom wykrywalności jak wysokorozdzielcze systemy magnetyczne GC-MS.

Do obliczenia poziomu toksyczności TEQ przyjęto wynik oznaczenia 17 kongenerów PCDDs i PCDFs oraz 3 kongenerów koplanarnych PCBs, dla informacji zestawionych w tabeli 1.

Określenie poziomu toksyczności analizowanej próbki wyrażonego jako parametr TEQ, dokonuje się za pomocą tzw. współczynnika równoważnego toksyczności TEF. Jest to parametr obliczany na podstawie wyników analiz chemicznych zawartości masowej wszystkich kongenerów PCDDs i PCDFs posiadających atomy chloru w położeniach 2,3,7 i 8 oraz 3 koplanarnych PCBs. Wartość liczbowa parametru TEQ jest wartością sumaryczną parametrów cząstkowych otrzymanych z pomnożenia wyniku analitycznego stężenia pojedynczego kongeneru przez odpowiedni współczynnik równoważny toksyczności 2,3,7,8-TCDD tzw. TEF.

Wartości liczbowe tych współczynników zestawiono w tabeli 1. Określają one względną toksyczność każdego kongeneru PCDD, PCDF i PCB w odniesieniu do najbardziej toksycznego 2,3,7,8-TCDD i 1,2,3,7,8-P₅CDD, dla których przyjęto współczynniki TEF = 1.

Odpowiednio dla najmniej toksycznych OCDD i OCDF przyjęto współczynniki TEF = 0.0001. Sumując pomnożone zawartości masowe poszczególnych kongenerów PCDDs i PCDFs i koplanarnych PCBs oznaczonych w analizowanej próbce przez odpowiadające im jednostkowe współczynniki TEF otrzymuje się wartość liczbową nazywaną poziomem toksyczności analizowanej próbki - TEQ. Jest to wartość masowa.

Z wartości tej można określić potencjalną toksyczność analizowanego preparatu w odniesieniu do dioksyn. We wszystkich aktualnie obowiązujących i tworzonych regulacjach prawnych odnośnie zawartości dioksyn ich masę wyraża się sumarycznie w pg-TEQ w odniesieniu do 1 grama substancji badanej (pg-TEQ/g).

Obliczenie wartości masowej TEQ prowadzi się wg wzoru 1:

(1)

Gdzie:

TEQ - Poziom toksyczności badanej próbki

wyrażony w jednostkach masowych (zwykle w pg).

m i - Masa i-kongeneru PCDD, PCDF i PCB (wg tabeli 1) w pg.

TEF_i - Współczynnik równoważny toksyczności 2,3,7,8-TCDD dla i-kongeneru

PCDD, PCDF i PCB (wg tabeli 1).

Tabela 1. Zestawienie poszczególnych kongenerów PCDDs, PCDFs i PCBs

i odpowiadające im wartości współczynnika równoważnego toksyczności TEF

(wg WHO 1998)

Kongener PCDDs	TEF	Kongener PCDFs	TEF
2,3,7,8-TCDD	1	2,3,7,8-TCDF	0,1
1,2,3,7,8-P5CDD	1	2,3,4,7,8- P5CDF	0,5
1,2,3,4,7,8-H6CDD	0,1	1,2,3,7,8- P5CDF	0,05
1,2,3,6,7,8- H6CDD	0,1	1,2,3,4,7,8- H6CDF	0,1
1,2,3,7,8,9- H6CDD	0,1	1,2,3,6,7,8- H6CDF	0,1
1,2,3,4,6,7,8- H7CDD	0,01	1,2,3,7,8,9- H6CDF	0,1
OCDD	0,0001	2,3,4,6,7,8- H6CDF	0,1
		1,2,3,4,6,7,8- H7CDF	0,01
		1,2,3,4,7,8,9- H7CDF	0,01
		OCDF	0,0001
Kongener PCBs
3,3',4,4' - T4CB (PCB#77)			^0,0001
3,3',4,4',5 - P5CB (PCB#126)			^0,1
3,3',4,4',5,5' - H6CB (PCB#169)			0,01

Ze względu na silną rozpuszczalność PCDDs , PCDFs i PCBs w tłuszczach przyjęto wyrażanie zawartości dioksyn w odniesieniu do jednostki masy tłuszczu w próbce czyli 1 g tłuszczu.

Dla próbek stałych i ciekłych o zawartości tłuszczu poniżej 0,5% wagowo zawartość PCDDs, PCDDs i PCBs podaje się w odniesieniu do rzeczywistej masy próbki.

Typowe poziomy zawartości dioksyn w badanej w Polsce żywności w okresie czerwiec-październik 1999 zestawiono poniżej tabeli 2:

Tabela 2:

Zestawienie wyników oznaczania dioksyn w próbkach żywności w okresie czerwiec-październik w odniesieniu do próbek żywności pochodzenia polskiego

Próbka	Zalecane wartości wg UE (od 2000r) pg-TEQ/g tłuszczu	Wartości zmierzone pg-TEQg tłuszczu
wieprzowina	2	0,06 - 0,85
Drób	5	0,12 - 2,65
Wołowina	6	0,08 - 1,24
Mleko	3	0,15 - 0,36
Jaja	5	0,10 - 2,60
ryby	Brak	4,25 - 60,0
Mączka rybna	Brak	2,15 - 19,5
konina	brak	14,0

W załączeniu przykładowy, szczegółowy raport z analizy przedstawiający sposób obliczenia wyniku końcowego (ostatni wiersz tabeli 3)

Tabela 3:

Wynik analizy 17 kongenerów PCDDs i PCDFs oraz 3 koplanarnych PCBs

w próbce tłuszczu zwierzęcego

(PRZYKŁADOWY WZÓR)

Nr	Kongener	Zawartość w próbce [pg / g]	cząstkowy TEQ ***
1	2,3,7,8-TCDF	4,25	0,425
2	2,3,7,8-TCDD	1,28	1,280
3	1,2,3,7,8-P5CDF	0,75	0,038
4	2,3,4,7,8-P5CDF	1,92	0,960
5	1,2,3,7,8-P5CDD	2,65	2,650
6	1,2,3,4,7,8-H6CDF	0,45	0,045
7	1,2,3,6,7,8-H6CDF	0,30	0,030
8	1,2,3,7,8,9-H6CDF	0,05	0,005
9	1,2,3,4,7,8-H6CDD	1,00	0,100
10	1,2,3,6,7,8-H6CDD	2,45	0,245
11	1,2,3,7,8,9-H6CDD	2,20	0,220
12	2,3,4,6,7,8-H6CDF	0,25	0,025
13	1,2,3,4,6,7,8-H7CDF	0,65	0,007
14	1,2,3,4,6,7,8-H7CDD	11,2	0,112
15	1,2,3,4,7,8,9-H7CDF	0,15	0,002
16	OCDD	70	0,0070
17	OCDF	1,10	0,0001
18	PCB#77	215	0,0215
19	PCB#126	32,0	3,2000
20	PCB#169	10,8	0,1080
Sumaryczna zawartość PCDDs, PCDFs i koplanarnych PCBs wyrażona w pg-TEQ/g			9,5

Poziom wykrywalności obliczono:

0,01 pg/g dla TCDD/F, P₅CDD/F i H₆CDD/F, 0.05 pg/g dla H₇CDD/F
i OCDD/OCDF oraz 0,1 pg/g dla koplanarnych PCBs

Błąd względny metody w odniesieniu do TEQ jest poniżej 10%

*** - w odniesieniu do wprowadzonych w 1998r przez WHO współczynników TEF.

---