Aktywność enzymów w zależności od warunków środowiska.
Chatakterystyczną cechą wszystkich enzymów jest ich specyficzność względem substratu oraz aktywność kinetyczna. Przyspieszają reakcje chemiczne poprzez obniżenie energii aktywacji około milionkrotnie przez co możliwe jest zachodzenie procesów które w normalnych warunkach byłyby niezauważalne. Wpływają jednak tylko na te procesy które są termodynamicznie możliwe przyspieszając osiągniecie równowagi termodynamicznej do której jak wiemy dąży każda reakcja. Ogólny schemat reakcji katalizowanej przez enzym wygląda następująco:
E+S->ES-> E+P
Zdolność katalityczna enzymu, czyli jego aktywność określa wzrost szybkości reakcji w ścisle określonych warunkach. Zwykle oznacza zmianę stężenia produktu lub substratu reakcji w jednostce czasu. Jednostką aktywności enzymatycznej w układzie SI jest katal. Odpowiada on aktywności enzymu, przy której jest on zdolny przekształcić 1 mol substratu w produkt w czasie 1 sekundy w temperaturze 30°C i pozostałych warunkach optymalnych. Jednak powszechnie używana jednostką jest międzynarodowa jednostka aktywności enzymu IU. Określa ilość enzymu potrzebnego do przekształcenia 1μM substratu w produkt w czasie 1 minuty w warunkach optymalnych.
Aktywność enzymów jest ściśle zależna od panujących warunków środowiska w którym zachodzi reakcja. Na szybkość reakcji wpływ mają takie czynniki jak:
Temperatura
pH
Siła jonowa
Stężenie substratu
Stężenie enzymu
Obecność aktywatorów
Obecność inhibitorów
Wpływ temperatury na aktywność enzymów.
Jak wiadomo z reguły Van't Hoffa, podwyższenie temperatury o 10°C powoduje dwu lub nawet trzykrotny wzrost szybkości większości reakcji chemicznych. Ta sama reguła obowiązuje w przypadku enzymów, jednak tylko w granicach temperatury poza którą następuje denaturacja białka i utrata zdolności katalitycznych. W związku z tym przy temperaturze 0-30°C następuje wyłącznie wzrost aktywności enzymu, zgodnie z regułą Van't Hoffa. Przy dalszym wzroście temperatury szybkość reakcji nadal się zwiększa jednak następuje denaturacja białka enzymu poprzez zrywanie wiązań niekowalencyjnych, głównie wodorowych. Następnie denaturacja postępuje tak szybko, że enzym traci swoje właściwości katalityczne a szybkość reakcji gwałtownie maleje.
Enzym wykazuje najwyższą aktywność w temperaturze zwanej temperaturą optymalną. Za taką uznaje się tą, przy której szybkość reakcji jest najwyższa i jednocześnie nie następuje proces denaturacji. Optimum jest różne dla różnych enzymów i zależy od ich pochodzenia. Dla enzymów zwierzęcych jest to temperatura bliska temperatury ciała. Dla enzymów pochodzenia roślinnego i bakteryjnego występuje duże zróżnicowanie, nawet do 90°C. Ważny jest również fakt, że dla niskich temperatur, czyli około 0°C aktywność enzymów jest niska, natomiast wykazują dużą trwałość.
Istnieją enzymy inaktywujące dzialanie wysokiej temperatury, cechuje je wysoka termostabilność. Określa się ją jako najwyższą temperaturę, w której nie zachodzi termiczna inaktywacja białka.
Przykład: Polimeraza Taq wykorzystywana w PCR występuje u bakterii żyjących w gorących źródłach a więc przystosowana jest do optymalnej pracy w wysokich temperaturach.
Wpływ odczynu środowiska na aktywność enzymów.
Każdy enzym największą aktywność wykazuje przy optymalnym pH. Wówczas szybkość katalizowanej reakcji jest najwyższa. Wpływ pH na białka zależy od wielkości zmiany jego wartości optymalnej. Skrajne wartości pH wpływaja denaturująco i powodują nieodwracalne zahamowanie ich działania. Niewielkie odchylenia od wartości optymalnej obniżają aktywność enzymów, ponieważ wpływają na stopień jonizacji substratu i enzymu oraz zmieniają warunki tworzenia kompleksu enzym-substrat.
(wpływ na stężenie jonów wodorowych na dysocjujące grupy aminowe i karboksylowe występujące w resztach aminokwasowych łańcucha peptydowego, a zwłaszcza w bezpośrednim sąsiedztwie centrum aktywnego enzymu. Zmiana stopnia dysocjacji tych grup pod wpływem zmiany pH roztworu powoduje zmianę układu ładunków, a tym samym struktury trzeciorzędowej białka, co może zmniejszych aktywność enzymu. Z drugiej strony grupy funkcyjne centrum aktywnego są w różnym stopniu wysycone protonami, a tylko jedna z form ma największe powinowadztwo do substratu.).
Zmiana pH wpływa na stopień uprotonowania grup centrum aktywnego oraz szybkość reakcji.
Optimum pH enzymów jest związane z odczynem środowiska ich naturalnego występowania. Dla większości zakres zbliżony jest do odczynu obojętnego lub słabo kwaśnego(6-9). Znamy jednak wiele przykładów takich enzymów, których optimum działania występuje w środowisku kwaśnym lub zasadowym. Na przykład pepsyna (enzym występujący w żołądku, enzym trawienny) optimum pH ma około2,0, proteinaza kwaśna() 3,5, arginaza () 10 a trypsyna() 8-11. Ponadto enzymy mogą mieć tóżne wartości optimum pH dla różnych substratów jak na przykład w przypadku pepsyny, która dla syntetycznego peptydu wykazuje optimum pH 2,8.
Wpływ stężenia substratu na aktywność enzymów.
Dla wielu enzymów aktywność katalityczna zmienia się wraz ze zmiana stężenia substratu. Zależność ta została opisana przez Michaelisa i Menten..Ich teoria, jako podstawa rozważań kinetycznych zakłada:
konieczność wytwarzania odwracalnego kompleksu enzym-substrat
Kompleks ten może rozpadać się w dwojaki sposób: na enzym i produkt lub enzym i substrat reakcji
Niemożliwa jest reakcja odwrotna, to znaczy przemiana produktu w substrat.
Szybkość reakcji katalizowanej przez enzymy podlegające kinetyce Michaelisa-Menten zależy od stężenia substratu. Przy niskim stężeniu substratu szybkość reakcji wzrasta proporcjonalnie do wzrostu jego stężenia. Jednak przy wysokim stężeniu substratu enzym ulega wysyceniu w związku z czym dalszy wzrost stężenia substratu powoduje tylko niewielkie zwiększenie szybkości reakcji ponieważ wszystkie cząstki enzymu posiadają związany substrat.
Maksymalna szybkość reakcji zostaje osiągnięta przy takim stężeniu substratu, gdy wszystkie centra aktywne są wysycone substratem.
Szybkość reakcji enzymatycznej opisuje równanie Michaelisa-Menten
V=(Vmax x S)/ Km x S
Gdzie: Km - stała Michaelisa, równa takiemu stężeniu substratu [S], przy którym szybkość reakcji V jest połową szybkości maksymalnej Vmax i opisywana równaniem:
Km=(k2+k3)/k1
gdzie: k1 - stała szybkosci tworzenia kompleksu enzym-substrat
k2 - stała szybkosci rozpadu kompleksu enzym substrat w kierunku uwolnienia
substratu
k3 - stała szybkosci rozpadu kompleksu enzym-substrat z wytworzeniem produktu
Stała Michaelisa-Menten jest wartością charakterystyczna dla enzymu w określonych wartościach pH i temperatury.
Znając wartość Km możemy dobrać tak stężenie substratu aby uzyskać stan nasycenia enzymu.
Wpływ aktywatorów i inhibitorów na aktywność enzymów.
Enzymy moga podlegac zarówno inhibicji, jak i aktywacji przez ró ne specyficzne czasteczki lub jony. Ma to szczególnie istotne znaczenie dla kontroli fizjologicznej ich działania w układach biologicznych. W ten sam sposób działa również wiele leków i czynników toksycznych.
Jak już wspomniano, aktywnosc enzymu w organizmie podlega kontroli
fizjologicznej. Niektóre z enzymów sa syntezowane w postaci nieczynnych prekursorów i ulegaja aktywacji w pożadanym czasie oraz miejscu, np. enzym trawienny - trypsyna wydzielana jest w trzustce jako trypsynogen, a jako czynny enzym pojawia sie w jelicie cienkim dopiero po hydrolizie wiazania peptydowego, która powoduje odczepienie krótkiego peptydu i przejscie proenzymy w forme aktywna.
Enzymy moga również podlegac modyfikacji kowalencyjnej. Aktywnosc jest
wówczas regulowana przez przyłaczenie małej grupy chemicznej do czasteczki enzymu, np. w wyniku fosforylacji, adenylacji czy rybozylacji.
Wiekszosc enzymów wymaga dla zachowania swojej aktywnosci aktywatorów.
Aktywatorami nazywamy zwiazki niskoczasteczkowe, których obecnosc w miejscu katalizy enzymatycznej przyspiesza przebieg reakcji. Aktywatorami enzymów moga byc jony metali (np. Mn2+, Co2+, Zn2+), aniony współdziałajace z białkami (np. Cl-), a także związki regulujace potencjał oksydoredukcyjny srodowiska, od których zależy budowa centrów aktywnych.
Inhibitory sa substancjami hamujacymi działanie enzymów. Inhibicja czasteczki
enzymu może zachodzic pod wpływem małych czasteczek lub jonów, zarówno
nieodwracalnie jak i odwracalnie.
W inhibicji nieodwracalnej inhibitor wiaże sie kowalencyjnie z enzymem tak silnie, że jego dysocjacja jest bardzo powolna (np. działanie gazów paraliżujacych na układ nerwowy). Te inhibitory nazywane sa czesto „truciznami enzymów”, ponieważ powoduja chemiczna modyfikacje aminokwasów enzymu. Najczesciej brak jest podobienstwa pomiedzy inhibitorem i substratem, ale jeżeli takie podobienstwo wystepuje, wówczas związanie substratu przez enzym działa na enzym ochronnie.
W inhibicji odwracalnej szybko osiagany jest układ enzym-inhibitor. Podstawowe
typy odwracalnej inhibicji, to:
Inhibicja kompetycyjna, kiedy inhibitor jest podobny do substratu i wia e sie
w miejscu aktywnym enzymu, blokujac wiazanie substratu. Wówczas inhibitor
współzawodniczy z enzymem o centrum aktywne. Czesto taki typ inhibicji
wystepuje, gdy produkt reakcji jest podobny do substratu. Wówczas reakcja
enzymatyczna hamowana jest przez produkt (zjawisko sprzężenia zwrotnego).
Inhibicja niekompetycyjna, kiedy inhibitor wiąże sie z czasteczka enzymu
w innym miejscu niż centrum aktywne enzymu. Wtedy nastepuje zmiana
konformacji enzymu, która pociaga za soba zmiane konformacji centrum
aktywnego. Aktywatory i inhibitory maja szczególne znaczenie dla podniesienia szybkości katalizy prowadzonej przez enzymy allosteryczne. W czasteczce takich enzymów poza centrum aktywnym wystepuje również centrum regulatorowe, ulokowane najczesciej na innej podjednostce białka. Przyłaczenie do tego centrum efektora (tj. aktywatora lub inhibitora) powoduje gwałtowna zmiane szybkosci katalizy. Proces aktywacji badz inhibicji takiego enzymu jest procesem odwracalnym. Enzymy takie katalizuja kluczowe reakcje szlaków metabolicznych i nie podlegaja kinetyce Michaelisa-Menten.
Kinetyke allosterycznych enzymów opisuje model sigmoidalny. Szybkosc reakcji katalizowana przez enzym allosteryczny przed zwiazaniem efektora jest bardzo niska i zmienia sie nieznacznie w zależnosci od steżenia substratu. Zwiazanie aktywatora powoduje gwałtowny wzrost szybkosci reakcji, aż do poziomu pełnego wysycenia enzymu substratem. Natomiast zwiazanie inhibitora powoduje jeszcze wieksze opóznienie uwalniania produktu z kompleksu przejsciowego. Charakterystyczne dla tych enzymów jest wystepowanie zjawiska pozytywnej kooperacji, czyli ułatwienie wiazania czasteczek substratu do kolejnych centrów aktywnych wskutek zmian konformacyjnych, jakie wywołane zostały w białku poprzez przyłaczenie pierwszej czasteczki substratu.
Wsród czynników, które wpływaja na szybkosc reakcji enzymatycznej należy
dodatkowo wyróżnic grupe inaktywatorów, czyli czynniki, które doprowadzaja do
niespecyficznego i nieodwracalnego hamowania enzymu poprzez jego denaturacje. Należa do nich zarówno czynniki chemiczne (np. niektóre rozpuszczalniki organiczne czy steżone roztwory soli metali cieżkich), jak i czynniki fizyczne
(np. promieniowanie jonizujace lub ultradzwieki).