Laboratorium 4 Z A S T O SO W A N I E F I L T R A C J I Ż E L O W E J
D O O D S A L A N I A I F R A K C J O N O W A N I A B I A Ł E K
Przygotowanie kolumny:
Kolumnę chromatograficzną (ф ok. 2 cm) wypełnioną żelem Sephadex G-100 przygotuj do naniesienia próby. W tym celu należy zamknąć wylot kolumny, odłączyć zbiornik z eluentem (0,9% roztwór NaCl) i poprzez otwarcie wylotu kolumny usunąć nadmiar roztworu znad powierzchni żelu tak, by nie doprowadzić do zapowietrzenia się kolumny. Następnie zamknij wylot kolumny.
Nanoszenie próby na kolumnę i elucja:
Przy zamkniętym wypływie kolumny nałóż ostrożnie na powierzchnię żelu 1 mL badanej mieszaniny. Podstaw pod wylot kolumny probówkę miarową i otwórz kranik, aby próbka wsiąknęła w górę żelu pod wpływem ciśnienia grawitacyjnego (uważaj, żeby nie wysuszyć powierzchni żelu). Następnie ponownie zamknij wylot kolumny i ostrożnie nanieś na powierzchnię żelu około 1 mL 0,9% roztworu NaCl, dokładnie spłukując ze ścianek kolumny pozostałości nałożonej mieszaniny. Otwórz kranik, aby naniesiony roztwór wsiąknął w górę żelu, nie wysuszając jego powierzchni. Znowu zamknij wypływ kolumny.
Po wykonaniu tych czynności można przystąpić do właściwego rozdziału. W tym celu na powierzchnię żelu nanieś ostrożnie 0,9% roztwór NaCl do wysokości umożliwiającej (po szczelnym podłączeniu zbiornika z eluentem) otrzymanie nieprzerwanego słupa eluującej cieczy. Następnie podłącz szczelnie kolumnę ze zbiornikiem z eluentem, otwórz wylot kolumny i prowadź elucję z szybkością około 1 mL / min., zbierając do probówek miarowych frakcje o objętości 4 ml. Kontynuuj zbieranie frakcji aż do pełnego wyeluowania chromianu potasu.
Regeneracja kolumny:
Po ukończeniu frakcjonowania przygotuj kolumnę do następnych rozdziałów, przepuszczając przez nią około 100 mL 0,9% roztworu NaCl.
Obliczenia:
Zmierz absorbancję uzyskanych frakcji: dla błękitu dekstranowego przy długości fali λ = 610 nm, dla hemoglobiny przy λ = 540 nm, a dla chromianu potasu przy λ = 390 nm.
Wykonaj na papierze milimetrowym wykres zależności absorbancji (oś Y) od objętości elucyjnej (oś X) dla trzech uzyskanych frakcji.
Oblicz wartość współczynnika podziału (Kav) dla błękitu dekstranowego, hemoglobiny i chromianu potasu zgodnie z poniższą tabelą:
Składnik |
V0 (mL) |
Ve (mL) |
Ve - V0 |
Kav = Ve - V0 / Vt - V0 |
Błękit dekstranowy |
|
|
|
|
Hemoglobina |
|
|
|
|
Chromian potasu |
|
|
|
|
gdzie:
V0 - objętość rozpuszczalnika zalegającego między ziarenkami żelu, wyznaczana jako objętość elucji od chwili naniesienia próbki do momentu wypłynięcia substancji wysokocząsteczkowej (błękitu dekstranowego) z kolumny
Ve - objętość niezbędna do wyeluowania danej substancji z kolumny, wyznaczana jako objętość elucji od chwili naniesienia próbki do momentu wyjścia z kolumny danego składnika mieszaniny
Vt - całkowita objętość kolumny (π r2h, gdzie r - promień kolumny, h- wysokość słupa żelu)
Uwaga: nie zapomnij zmierzyć średnicy kolumny i wysokości słupa żelu w używanej w doświadczeniu kolumnie.