Laboratorium 4 CHROMATOGRAFIAI, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, 2 rok, II rok, biochemia


Laboratorium 4 Z A S T O SO W A N I E F I L T R A C J I Ż E L O W E J

D O O D S A L A N I A I F R A K C J O N O W A N I A B I A Ł E K

  1. Przygotowanie kolumny:

Kolumnę chromatograficzną (ф ok. 2 cm) wypełnioną żelem Sephadex G-100 przygotuj do naniesienia próby. W tym celu należy zamknąć wylot kolumny, odłączyć zbiornik z eluentem (0,9% roztwór NaCl) i poprzez otwarcie wylotu kolumny usunąć nadmiar roztworu znad powierzchni żelu tak, by nie doprowadzić do zapowietrzenia się kolumny. Następnie zamknij wylot kolumny.

  1. Nanoszenie próby na kolumnę i elucja:

Przy zamkniętym wypływie kolumny nałóż ostrożnie na powierzchnię żelu 1 mL badanej mieszaniny. Podstaw pod wylot kolumny probówkę miarową i otwórz kranik, aby próbka wsiąknęła w górę żelu pod wpływem ciśnienia grawitacyjnego (uważaj, żeby nie wysuszyć powierzchni żelu). Następnie ponownie zamknij wylot kolumny i ostrożnie nanieś na powierzchnię żelu około 1 mL 0,9% roztworu NaCl, dokładnie spłukując ze ścianek kolumny pozostałości nałożonej mieszaniny. Otwórz kranik, aby naniesiony roztwór wsiąknął w górę żelu, nie wysuszając jego powierzchni. Znowu zamknij wypływ kolumny.

Po wykonaniu tych czynności można przystąpić do właściwego rozdziału. W tym celu na powierzchnię żelu nanieś ostrożnie 0,9% roztwór NaCl do wysokości umożliwiającej (po szczelnym podłączeniu zbiornika z eluentem) otrzymanie nieprzerwanego słupa eluującej cieczy. Następnie podłącz szczelnie kolumnę ze zbiornikiem z eluentem, otwórz wylot kolumny i prowadź elucję z szybkością około 1 mL / min., zbierając do probówek miarowych frakcje o objętości 4 ml. Kontynuuj zbieranie frakcji aż do pełnego wyeluowania chromianu potasu.

  1. Regeneracja kolumny:

Po ukończeniu frakcjonowania przygotuj kolumnę do następnych rozdziałów, przepuszczając przez nią około 100 mL 0,9% roztworu NaCl.

  1. Obliczenia:

Zmierz absorbancję uzyskanych frakcji: dla błękitu dekstranowego przy długości fali λ = 610 nm, dla hemoglobiny przy λ = 540 nm, a dla chromianu potasu przy λ = 390 nm.

Wykonaj na papierze milimetrowym wykres zależności absorbancji (oś Y) od objętości elucyjnej (oś X) dla trzech uzyskanych frakcji.

Oblicz wartość współczynnika podziału (Kav) dla błękitu dekstranowego, hemoglobiny i chromianu potasu zgodnie z poniższą tabelą:

Składnik

V0 (mL)

Ve (mL)

Ve - V0

Kav = Ve - V0 / Vt - V0

Błękit dekstranowy

Hemoglobina

Chromian potasu

gdzie:

V0 - objętość rozpuszczalnika zalegającego między ziarenkami żelu, wyznaczana jako objętość elucji od chwili naniesienia próbki do momentu wypłynięcia substancji wysokocząsteczkowej (błękitu dekstranowego) z kolumny

Ve - objętość niezbędna do wyeluowania danej substancji z kolumny, wyznaczana jako objętość elucji od chwili naniesienia próbki do momentu wyjścia z kolumny danego składnika mieszaniny

Vt - całkowita objętość kolumny (π r2h, gdzie r - promień kolumny, h- wysokość słupa żelu)

Uwaga: nie zapomnij zmierzyć średnicy kolumny i wysokości słupa żelu w używanej w doświadczeniu kolumnie.



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Laboratorium 18, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, od Joe, biochemia
Laboratorium 2 BIALKA, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, 2 rok, biochemia, koło 1
laboratorium 14, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, 2 rok, II rok, biochemia
Laboratorium 19, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, od Joe, biochemia, BIOCHEMIA, GIEŁDY - KOLOKWIA, Gie
Laboratorium 16, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, 2 rok, II rok, biochemia
Laboratorium 11 OKSYDOREDUKTAZY, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, od Joe, biochemia
pokarmowka gielda, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, od Joe, FIZJOLOGIA, KOLOKWIA, NEUROFIZJOLOGIA, gie
egzamin 2007, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, 2 rok, II rok, giełdy od Nura, fizjo, egzamin, New fold
żołądek ść 4, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, 2 rok, histologia
MELATONINA, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, od Joe, biochemia, BIOCHEMIA, GIEŁDY - EGZAMIN, Dodatkowe
lekarski ii rok ii sem, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, 2 rok, inne
Fizjologia kolo RKZ, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, od Joe, FIZJOLOGIA, KOLOKWIA, RÓWNOWAGA KWASOWO-
neuron, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, 2 rok od Pawła, fizjologia, Opracowanie ćwiczenia
Regulacja przyjmowania pokarmu, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, 2 rok, fizjo
Neurofizjologia, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, od Joe, FIZJOLOGIA, KOLOKWIA, NEUROFIZJOLOGIA
2007 ---, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, 2 rok od Pawła, fizjologia, egzamin, wordy
nerka, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, 2 rok, II rok, fizjologia

więcej podobnych podstron