Laboratorium 4 Z A S T O SO W A N I E F I L T R A C J I Ż E L O W E J

D O O D S A L A N I A I F R A K C J O N O W A N I A B I A Ł E K

  1. Przygotowanie kolumny:

Kolumnę chromatograficzną (ф ok. 2 cm) wypełnioną żelem Sephadex G-100 przygotuj do naniesienia próby. W tym celu należy zamknąć wylot kolumny, odłączyć zbiornik z eluentem (0,9% roztwór NaCl) i poprzez otwarcie wylotu kolumny usunąć nadmiar roztworu znad powierzchni żelu tak, by nie doprowadzić do zapowietrzenia się kolumny. Następnie zamknij wylot kolumny.

  1. Nanoszenie próby na kolumnę i elucja:

Przy zamkniętym wypływie kolumny nałóż ostrożnie na powierzchnię żelu 1 mL badanej mieszaniny. Podstaw pod wylot kolumny probówkę miarową i otwórz kranik, aby próbka wsiąknęła w górę żelu pod wpływem ciśnienia grawitacyjnego (uważaj, żeby nie wysuszyć powierzchni żelu). Następnie ponownie zamknij wylot kolumny i ostrożnie nanieś na powierzchnię żelu około 1 mL 0,9% roztworu NaCl, dokładnie spłukując ze ścianek kolumny pozostałości nałożonej mieszaniny. Otwórz kranik, aby naniesiony roztwór wsiąknął w górę żelu, nie wysuszając jego powierzchni. Znowu zamknij wypływ kolumny.

Po wykonaniu tych czynności można przystąpić do właściwego rozdziału. W tym celu na powierzchnię żelu nanieś ostrożnie 0,9% roztwór NaCl do wysokości umożliwiającej (po szczelnym podłączeniu zbiornika z eluentem) otrzymanie nieprzerwanego słupa eluującej cieczy. Następnie podłącz szczelnie kolumnę ze zbiornikiem z eluentem, otwórz wylot kolumny i prowadź elucję z szybkością około 1 mL / min., zbierając do probówek miarowych frakcje o objętości 4 ml. Kontynuuj zbieranie frakcji aż do pełnego wyeluowania chromianu potasu.

  1. Regeneracja kolumny:

Po ukończeniu frakcjonowania przygotuj kolumnę do następnych rozdziałów, przepuszczając przez nią około 100 mL 0,9% roztworu NaCl.

  1. Obliczenia:

Zmierz absorbancję uzyskanych frakcji: dla błękitu dekstranowego przy długości fali λ = 610 nm, dla hemoglobiny przy λ = 540 nm, a dla chromianu potasu przy λ = 390 nm.

Wykonaj na papierze milimetrowym wykres zależności absorbancji (oś Y) od objętości elucyjnej (oś X) dla trzech uzyskanych frakcji.

Oblicz wartość współczynnika podziału (Kav) dla błękitu dekstranowego, hemoglobiny i chromianu potasu zgodnie z poniższą tabelą:

Składnik

V0 (mL)

Ve (mL)

Ve - V0

Kav = Ve - V0 / Vt - V0

Błękit dekstranowy

Hemoglobina

Chromian potasu

gdzie:

V0 - objętość rozpuszczalnika zalegającego między ziarenkami żelu, wyznaczana jako objętość elucji od chwili naniesienia próbki do momentu wypłynięcia substancji wysokocząsteczkowej (błękitu dekstranowego) z kolumny

Ve - objętość niezbędna do wyeluowania danej substancji z kolumny, wyznaczana jako objętość elucji od chwili naniesienia próbki do momentu wyjścia z kolumny danego składnika mieszaniny

Vt - całkowita objętość kolumny (π r2h, gdzie r - promień kolumny, h- wysokość słupa żelu)

Uwaga: nie zapomnij zmierzyć średnicy kolumny i wysokości słupa żelu w używanej w doświadczeniu kolumnie.