METODA SAUTHERNA
DNA tnie się przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych na fragmenty, które następnie rozdziela się pod względem wielkości poprzez elektroforezę w żelu. Fragmenty te przenosi się następnie na filtr wiążący DNA , a fragmenty komplementarne identyfikuje się za pomocą autoradiografii, stosując wyznakowane, radioaktywne sondy.
Za pomocą analizy Sautherna możemy wykazać mutacje odcinkowe
-o delecji będzie świadczyć zmniejszenie się rozmiarów lub brak prążków
-o amplifikacji -powstanie prążków o zmniejszonych rozmiarach.
PCR (polymerase chain reaction)
Umożliwia powielanie wybranego fragmentu DNA w milionach kopii, bez użycia wektorów i bakterii. Polega na ok.30 powtarzajacych się cyklicznych etapach.
Etapy:
-denaturacja dna w temp 90-95 C
-wiązanie starterów temp.50-65 C
- wydłużanie starterów temp 68-72 C
(synteza powielanego fragm.DNA)
Każdy cykl ma ok.3 min, a powstające amplikony służą jako matryce w następnych cyklach reakcji
Prowadząc do logarytmicznego przyrostu ilości produktów. Reakcja PCR zachodzi w termoblokach zdolnych do szybkich zmian temp. La poszcególnych etapów reakcji(4C\sek.)
Mieszanina reakcji PCR;
1.matryca DNA lub cDNA
2. Dwa startery -fragm. Jednoniciowych DNA o dł. kilkunastu nukleotydów komplementarnych do matrycy i ograniczajace długości powielanego odcinka DNA.
3.dNTP-miesznina dATP,dCTP,dGTP,dTTP,
4.Termostabilna polimeraza DNA(np. polimeraza Taq)
5. kationy magnezu
6.odpowiedni bufor
Cel:
-Wkrywanie mutacji genowych.
-wykrywanie chorób genetycznych
-wykrywanie nowotworów
-wykrywanie polimorficznych sekwencji(identyfikacja osobnicza)
-monitorowanie chorób(białaczki)
-monitorowanie translokacji.
ANALIZA NORTHERN BLOT
(dotyczy RNA)
Etapy;
-elektroforeza preparatów RNA
-transfer na filtr nylonowy
-związanie RNA z filtrem
-hybrydyzacja
-płukanie filtru
-autoradiografia